基因重组与基因工程-中国医科大学.ppt

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　 　基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering　 第十四章 The biochemistry and molecular biology department of CMU 第 一 节 DNA的重组 DNA Recombination DNA重组 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 转 座 (transposition) 同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination) 发生在同源序列间的重组称为同源 重 组 (homologous recombination)， 又称基本重组。是最基本的DNA重组方 式，通过链的断裂和再连接，在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片 段的交换。 一、同源重组 Holliday模型中，同源重组的4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应 的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重 组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体 切开的链与原来断裂的是同一条链， 重组体含有一段异源双链区，其两侧来自 同一亲本DNA。 拼接重组体 切开的链并非原来断裂的链，重组体 异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 内切酶 (recBCD) DNA侵扰 (recA) 分支迁移 (recA) 内切酶 (recBCD) DNA 连接酶 5´ 3´ 5´ 3´5´ 3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ 3´5´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ Holiday中间体 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ DNA连接酶 片 段 重 组 体 5´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 3´ 内切酶 (ruvC) 内切酶 (ruvC) 5´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 拼 接 重 组 体 5´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ DNA连接酶 二、细菌的基因转移与重组 （一）接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接 触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移 至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合 作用(conjugation)。 可接合质粒如 F 因子(F factor) （二）转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA， 使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型， 称为转化作用 (transformation)。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 （三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释 放出来、再次感染另一（供体）细胞 时，发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组即为转导作用 (transduction)。 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 　 　 转导过程 三、位点特异重组 位点特异重组(site-specific recom- bination) 是由整合酶催化，在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。 （一）λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染 色体的特异靶位点发生选择性整合； 反转录病毒整合酶可特异地识别、整 合反转录病毒cDNA的长末端重复序列 (long terminal repeat, LTR)。  沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。 H片段 H1鞭毛蛋白 H2鞭毛蛋白 阻遏蛋白 P2 P2 hix hix （二）细菌的特异位点重组 （三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条 重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编 码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重 链。 轻链的基因片段： 重链的基因片段： L V J C L V D J C 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因 的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游， J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组 信 号 序 列 (recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共 有 两 个 ， 分 别 产 生 蛋 白 质 RAG1和RAG2。 CACAGTG (12/23) ACAAAAACC GTGTCAC TGTTTTTGG 重组信号序列基因片段 V片段 J片段RSS RSS 间插DNA OH OH V J 单链切开 RAG1 RAG2 分子内转酯反应 单链切开 转移核苷酸 修复、连接 免 疫 球 蛋 白 基 因 重 排 过 程 四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移 位或重排称为转座(transposition)。 插入序列(insertion sequences, IS)组成： 二个反向重复序列(inverted repeats, IR) 侧翼的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 IR Transposase Gene IR 转座形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition) （一）插入序列转座 插入序列的复制性转座 转座子(transposons) ——可从一个染色体 位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：反向重复序列 转座酶编码基因 抗生素抗性等有用的基因 IR IRTransposase Gene 抗性基因 （二）转座子转座 由转座子介导的转座 第 二 节 重组DNA技术 DNA Recombination Technique 重组DNA技术的发展史 1865年 的豌豆杂交试验 18661944年 的肺炎球菌转化实验 1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组 DNA分子 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上 第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术 制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰 岛素的工厂 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉 一、相关概念 –DNA克隆 –工具酶 –目的基因 –基因载体 二、基本原理及操作步骤 本节主要内容 一、重组DNA技术相关概念 克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。 （一） DNA克隆 DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的 DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或 转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细 胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也 称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等。 目的 ① 分离获得某一目的基因或DNA ② 获得目的基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) —— 实现 基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组 DNA技术。 （二）工具酶 • 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 反转录酶 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶 　　　　(restriction endonuclease) 识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制 修饰系统，限制外源DNA， 保护自身 DNA。 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类 （基因工程技术中常用的是Ⅱ类） 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名： Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 Ⅱ类酶识别序列特点： —— 回文结构(palindrome) 切口：平端切口、粘端切口 GGGGAATTCCCC CCCCTTAAGGGG Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG+ 平端切口 粘端切口 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同， 但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾 酶 。 这 两 个 相 同 的 粘 性 末 端 称 为 配 伍 未 端 (compatible end)。 Bam Bam HHⅠⅠ Bg Bg llⅡⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G ++ ++ATCTAG GATCT A （三）目的基因 • cDNA (complementary DNA) • 基因组DNA (genomic DNA) （四）基因载体 定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA 克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特 意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译 成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 载体的选择标准 • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具 有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 1. 质粒 (plasmid) 特点: 　　能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗 传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 　　细菌染色体外 的小型环状双链 DNA分子。 λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） 2. 噬菌体(phage) M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列                                                                  Multiple Cloning Sites 3. 柯斯质粒(cosmid) pJB8的物理图谱 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 动物病毒DNA改造的载体 　　腺病毒载体 　　逆转录病毒载体 杆状病毒载体 其他 二、重组DNA技术基本原理 目的基因的获取 重组DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 　　已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨 基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 1.　化学合成法 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 组织或细胞染色体DNA 基因片段 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 　　存在于转化细菌内 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合 2. 基因组DNA文库 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3.　cDNA文库　 逆转录酶 A A A A  T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解  T T T T 　　是一种在体外利用酶促反应大量获 得特异序列的基因组DNA或cDNA的专 门技术，又称为无细胞的分子克隆。 4. 聚合酶链反应（PCR） 模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。 PCR的反应体系　 （1）变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP 为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的 DNA新链。 PCR的基本反应步骤及原理　 　　 　　　　　　 PCR反应条件　 变性 95˚C 延伸 72˚C 退火 Tm-5˚C 　 　 PCR反应的基本原理 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 （二）克隆载体的选择和构建 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15ºC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体载体自连 目的基因自连 同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接 不同限制酶切位点的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 ++ EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 配伍末端的 连接情况和同一 限制酶切位点连 接相似。 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序 列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5´ 3´ 3´ 5´ 载体DNA 5´ 3´ 3´ 5´ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5´ 3´ 　3´ 5´ 　　　　 5´ 3´ T(T)nT T(T)nT 3´ 5´ 5´ 3´ 　3´ 5´ 　　　　　5´ 3´ A(A)nA 　A(A)nA 3´ 5´ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T( T) n T A( A) n A A(A ) n A T(T) n T T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 4. 人工接头(linker)连接 由平端加上带有新的酶切位点的接头， 再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘 端连接。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 人 工 接 头 及 其 应 用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5´- 3´- Eco RⅠ 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 （五）重组体的筛选 　1. 直接选择法 　(1) 抗药性标记选择 　(2) 标志补救(marker rescue) 　(3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 　2. 免疫学方法 　如免疫化学方法及酶免检测分析等 (插 入 失 活 法 ) 抗 药 性 标 记 选 择 组氨酸缺陷 型大肠杆菌 无组氨酸 的培养基 酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因 促进组氨酸合成 λDNA 重组体 标 志 补 救 α 互 补 的 检 测 原 位 杂 交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 1. 原核表达体系 （表达体系最为常用） 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 （一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认 识疾病的分子机制。 三、重组技术与医学的关系 （二）生物制药 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素( 1b, 2a,  2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子 生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水 平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺 失或插入等突变。 （三）基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 标准 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，适合大面积、 大人群普查。 （四）基因治疗 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺 陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补 偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性 （五）遗传疾病的预防 　 　 复习思考题： 　1. 概念： （1）克隆 （2）转化 （3）转位 （4）基因工程 （5）转座 （6）限制性核酸内切酶 （7）载体 （8）G文库 （9）质粒 （10）c文库 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。