第七章 重组克隆的筛选和鉴定
内容提要
第一节 载体表型选择法
第二节 DNA电泳检测法
第三节 核酸杂交检测法
第四节 免疫化学检测法
第五节 转译筛选法
第六节 真核重组基因的选择方法
一般克隆与筛选策略
第一节 载体表型选择法
根据载体提供的表型进行选择的方法：
抗生素抗性基因的插入失活选择法
-半乳糖苷酶的显色反应选择法
一般原理
一种利用抗生素抗性基因或其他基因的
插入失活，来筛选重组子的方法。
通常外源DNA插入的位点设计在特定基
因上，一旦外源DNA插入，该基因就被
破坏而失去活性。由此来判断载体上是
否带有外源DNA。
一、插入失活法的原理
二、利用抗生素抗性基因：pBR322
以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的
插入失活的原理。
1. 原理
在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如
BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。
如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及
四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组
pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，
但对四环素的抗性消失（敏感）。
2. 筛选的方法
①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培
养基上，并培养至菌落出现。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不
同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体
培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。
④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。
⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
图 pBR322的结构图
3. 抗菌素标记的选择
（1）Ampr 氨苄青霉素抗性基因
产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉
酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液
（I2-KI-Aampicillin）褪色。
Ampr有Pst I、Sca I等多个插入位点。
（2）四环素
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（3）环丝氨酸
杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。
4. 选择的过程
（1）四环素抗性插入失活
如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环
素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨
酸的平板，选择重组克隆。
Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环
素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；
Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常
生长，但可被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸
图 四环素抗性插入失活
重组克隆
（2）氨苄青霉素抗性插入失活
氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺
酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青
霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪
色。
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄
青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青
霉素指示液褪色---呈蓝灰色。据此选
择阳性克隆。
图 氨苄青霉素抗性插入失活
三、利用-半乳糖苷酶显色
选择重组子的原理
1. -半乳糖苷酶与Lac Z基因
由 lac操纵子上的Lac Z基因编码。
分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。
2. Lac Z基因
突变的Lac Z基因，只编码-半乳糖苷
酶的部分肽段（氨基端） 。
2. 培养基中IPTG、X-gal 的作用
（1）IPTG作用
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导
lacZ 基因的表达-半乳糖苷酶。
（2）X-gal作用
5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作为-半
乳糖苷酶水解的底物。
（3）X-gal的显色反应
β-半乳糖苷酶 (四聚体)将X-gal水解成半乳糖
苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝) 。在4℃蓝色加
深。
-互补作用是pUC质粒载体的特性。
pUC载体：含有Lac Z基因，编码-半乳糖
苷酶的部分肽段（ 片段，氨基端） 。
受体菌：基因组中带有突变的-半乳糖苷酶
基因（缺失片段），可被IPTG诱导表达
（只编码-半乳糖苷酶的-肽）。
载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸
收了带有LacZ基因的 pUC质粒，才能合成
完整的有活性的-半乳糖苷酶。
3. -互补作用
氨苄青霉素抗性基因
Lac Z基因：编码-半乳糖苷酶的部分
肽段。
Lac Z上有插入外源DNA的MCS位点。
pUC18/19的结构图
利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一
种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。
①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培
养基，能合成-半乳糖苷酶。
②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性，
来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，
又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重
组子细胞。
4. 筛选的方法：蓝白斑法
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应
很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、
IPDG的培养基中，那些能合成完整的
-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它
能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子
克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完
整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal
而呈白色。
5. 选择培养的原理
在含有X-gal 和IPTG 的选择培养基上，
载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌
落，而携带插入片段的重组质粒转化子
为白色菌落。
平板37℃培养后，放于冰箱3-4 小时，
可使显色反应充分，菌落为蓝色。
图 -半乳糖苷酶显色反应
*
-半乳
糖苷酶
乳糖 半乳糖 葡萄糖
X-gal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝
+
+
蓝色
图 LacZ 插入外源DNA
图 白色菌落与蓝色菌落的挑选
四、pBS重组质粒的筛选实验
使用的载体为pBS质粒。
转化受体菌为E. coli DH5α菌株。
由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因，故
重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互
补现象筛选相结合的方法。
载体
α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。
如pUC、pGEM系列载体。
菌株
α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。
如DH5α(LacZ△M15)、
JM101~110(LacZ△M15)等。
1. 抗性筛选
因pBS质粒带有Ampr 基因，而外源
DNA片段上不带该基因，故转化受体菌
后，只有带有pBS DNA 的转化子，才
能在含有Amp 的LB 平板上存活下来；
而只带有自身环化的外源DNA片段的转
化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
2. lacZ 基因的插入失活
pBS质粒上带有β-半乳糖苷酶基因的调
控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基
酸的编码序列。该编码区有一个多克隆
位点，但并不破坏lacZ 的阅读框架，不
影响其正常功能。
3. DH5α菌株
E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶的C
端的部分编码序列。
在各自独立的情况下，pBS 和DH5α编
码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。
但在pBS 和DH5α融为一体时，可形成
具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。
4. α-互补现象
lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变
体与带有完整的近操纵基因区段的β-半
乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现
象。
由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它
在生色底物X-gal 存在下，被IPTG 诱导，
形成蓝色菌落。
当外源DNA片段插入到pBS 质粒的多克
隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋
白失活，产生的肽段失去α-互补能力。
因此，在同样条件下，含重组质粒的转
化子，在生色诱导培养基上，只能形成
白色菌落。
α互补作用/现象
当pUC质粒转化LacZ基因的氨基未端编
码序列缺失的Lac- 指示菌株时，能恢复
β-半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG和X
-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4-氯靛
蓝，出现蓝色菌落的现象。
当外源DNA插入pUC的MCS时，α-互补
作用被破坏，在IPTG和X-gal平板上则
不显蓝色而出现白色菌落。
第三节 DNA电泳检测法
PFGE
从转化后的克隆（转化子）中快速抽提
重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子
量大小。
插入外源DNA的重组质粒分子量大，没
有插入外源DNA的质粒分子量小。
比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移
快慢不同，即可选出重组子。
一、直接电泳检测法
Marker 载体重组
图 琼脂糖凝胶电泳图谱的比较
已知 未知
二、酶切产物电泳筛选法
1. 原理
根据已知的外源DNA序列的限制性酶切
图谱，选择1~2种内切酶切割质粒，电
泳后比较DNA带数和长度。
或用一种内切酶切下插入片段，再用另
一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者
是否符合预计的结果。
图 酶切产物的电泳筛选
图 限制性内切酶酶切图谱
图 表型筛选加酶切筛选
０A A T T
A
AT
T
三、PCR扩增检测法
1. 原理
在模板序列上扩增出预期DNA片断。
2. 过程
（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。
（2）用插入的DNA片段的引物作PCR。
（3）PCR产物电泳检查。
（4）PCR产物的长度是否与外源基因一致。
第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70
年代建立，应用DNA或RNA探针，与
靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸
纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转
化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选
和鉴定目的序列克隆。
常用的方法：将转化后生长的菌落，复
印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，
释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的
核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在
含有目的序列的菌落DNA上。
该技术已广泛应用于基因的表达、基因
定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制
作、基因组中特定基因序列检测、遗传
病疾病的诊断及生物分类等方面。
一、核酸分子杂交的基础
1. 变性与退火
DNA以双链形式存在，在进行分子杂交
时，先将双链DNA分子解聚为单链，这
一过程称为变性。
两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的
双链区的过程称为退火或复性。
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一
定程度的互补顺序，即某种程度的同源
性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern
blot）、RNA与DNA（Northern blot）
或RNA与RNA（In situ）的二条单链之
间进行。
3. 分子杂交法
分子杂交是通过一定方法，将核酸分子
固定在固相支持物上，然后用放射性标
记的探针与被固定的核酸分子杂交，经
显影后，显示出目的DNA或RNA所处
的位置。
分子杂交就是将一种核酸单链用同位素
或非同位素标记成为探针，再与另一种
核酸单链进行杂交。
4. 探针
经过同位素或非同位素标记的已知序列
的寡核苷酸。
单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与
它们的目的序列配对，可以准确地设计
杂交条件，以保证探针只与目的序列杂
交而不与序列相近的非完全配对序列杂
交，对于一些未知序列的目的片段则无
效。
5. 杂交的灵敏度和特异性
核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异
性。
可以根据所使用的探针的已知序列，进
行特异性的靶序列检测。
二、探针的类型
根据核酸的性质，可分为：
DNA探针、RNA探针、 cDNA探针和寡核酸
探针。
根据是否使用放射性标记物，可分为：
放射性标记探针和非放射性标记探针。
根据是否存在互补链，可分为：
单链和双链探针。
根据放射性标记物掺入情况，可分为：
均匀标记和末端标记探针。
1. 双链DNA探针
双链DNA探针的合成方法
主要有两种：
①切口平移法。
②随机引物合成法。
2. 单链DNA探针
单链DNA探针主要有两种合成方法:
①以M13载体衍生序列为模板，用
Klenow片段合成单链探针。
②以RNA为模板，用反转录酶合成单链
cDNA探针。
3. 末端标记DNA探针
以Klenow片段标记3’末端为例说明末端
标记的方法。
4. 寡核苷酸探针
利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单
个核苷酸的点突变。
常用的寡核苷酸探针主要有两种:
单一已知序列的寡核苷酸探针
许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷
酸探针库。
三、探针的标记方法与选择
1. 探针标记的方法
①缺口平移法
②DNA快速末端标记
③T4多核苷酸激酶标记DNA 5’末端法
④随机引物延伸法
⑤聚合酶链反应法。
2. 标记方法的选择
根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选
择合适的标记方法。
①一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度
高。
②在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效
率高、显示灵敏的探针标记方法。
③在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间
长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷
酸酶显示系统或过氧化物酶系统。
四、分子杂交
1.常用的核酸杂交方法
① Southern印迹杂交（ Southern blot ）
② Northern印迹杂交（Northern blot）
③菌落原位杂交（Colony in situ
hybridization）
④组织原位杂交（Tissue in situ
hybridization）等。
⑤点杂交（Dot blot）
2. 分子杂交的分类
根据被测定的对象不同，可分为2大类:
(1) Southern杂交
被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。DNA
片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤
维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。
(2) Northern杂交
RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤
维滤膜（NC）上，然后用探针杂交。被检对
象为RNA，探针为DNA或RNA。
五、 Southern blot
1. Southern杂交或DNA印迹
1975年由Southern创建，称为Southern印迹
技术。用DNA或RNA探针检测样品DNA。
2. 特点
Southern杂交用以检测经限制性内切酶切割
后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。
从宿主细胞中提取基因组DNA或质粒载体，
再用探针杂交。只有插入目的片段的重组体，
才能与探针杂交，并在X光底片上曝光显示印
迹。
3. 杂交的方法
转膜：
将DNA样本用限制性内切酶消化后，经琼脂
糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变
性、Tris缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，
将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素（NC）滤
膜上，烘干固定后，即可用于杂交。
杂交：
在一定条件下，探针与同源DNA片段杂交，
然后漂洗除去非特异性结合的探针。通过自
显影检查目的DNA所在位置。
4. 杂交的步骤或程序
(1) 酶切待测目的DNA，凝胶电泳分离各酶
切片段，并使DNA原位变性为单链。
(2) 将单链DNA片段转移到硝酸纤维素
（NC）滤膜或尼龙膜上。
(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让单链的探针与同源DNA片段杂交，漂
洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过自显影检测目的DNA所在位置。
Southern杂交 (Southern印迹法)
将混合在一起的限制性酶切DNA片段，
用琼脂糖电泳分开，并变性为单链DNA
，再转移到一张硝酸纤维素膜上。在膜
上的单链DNA可用32p标记的单链DNA
探针杂交。再用放射自显影方法，显示
出与探针顺序互补的限制性酶切DNA片
段的位置。
这个方法能将上万个片段中的某一个特
殊的目的片段鉴定出来。
图 Southern blot
图 Southern blot
凝胶电泳 底片显示杂交印迹
图 Southern印迹
六、Northern blot
1. Northern印迹杂交
对被检测的RNA进行变性凝胶电泳，以
除去RNA中的二级结构，使大小不同的
RNA完全分离。
将变性后RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝
酸纤维素膜上，然后与探针杂交。
2. 特点
用DNA或RNA探针检测RNA样品。
从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。
主要检测插入片段是否被转录。
用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性RNA
，变性后的RNA有利于在转印过程中与
硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状
态。用NaOH会水解RNA。
七、DNA-RNA杂交
DNA-RNA杂交采用R-环检测法。
选择过程
①用mRNA与重组载体杂交。
②在70%甲酰胺中，DNA双链变性，复
性时，DNA-RNA杂交分子比DNA-
DNA双链更稳定。
③电镜下可见到R-环形结构。
图 DNA-RNA杂交（ R-环）
八、菌落原位杂交
Colony in situ hybridization
1. 杂交的方法
①将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上。
②将滤膜上的菌落原位裂解，以释出DNA。
③烘干，将DNA固定于膜上。
④与32P标记的探针杂交。
⑤平板置于4℃，放射自显影，检测菌落杂交
信号（结果），并与平板上的菌落对应。
2. 特点
对应的菌斑(或噬菌斑)位置不变，可以
直接找出阳性菌落。
对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落
(~200)进行克隆筛选时可采用本法。
将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落
归并到一个琼脂主平板以及已置于第二
个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上。
经培养一段时间后，对菌落进行原位裂
解。
图 菌落原位杂交
Colony in situ hybridization
九、组织原位杂交
Tissue in situ hybridization，简称原位
杂交
1. 方法
组织或细胞经适当处理后，使细胞通透
性增加，探针直接进入细胞内与DNA或
RNA杂交。
2. 特点
组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，
可以确定探针的互补序列在细胞内的空
间位置。
例如，通过与细胞RNA的杂交，可分析
一种RNA在细胞组织中的分布、显示细
胞及病原微生物的存在方式和部位等。
十、斑点杂交
斑点杂交是指将DNA或RNA样品直接点在硝
酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交,
以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。
同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半
定量的结果。所以它是一种简便、快速、经
济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和
基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力
工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,
不能了解目的序列的长度。尤其在本底干扰
较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
点杂交法（Dot blot）
将被检测标本点到膜上，烘烤固定。
这种方法耗时短，可做半定量分析，一
张膜上可同时检测多个样品。
为使点样准确方便，有多种多管吸印仪
如Bio-Dot (Bio–Rad ) ，它们有许多孔，
样品加到孔中，在负压下就会流到膜上
呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，
取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，
这时的膜就可以进行杂交。
凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段
转移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针
杂交，利用放射自显影术确定探针互补
的每条DNA带的位置，从而可以确定在
众多酶解产物中含某一特定序列的DNA
片段的位置和大小。
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片段互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素：32P 或 125I 。
（2）非放射性标记：荧光素
一、原理
酶切前 酶切后
插入片段载体 载体 载体重组体 重组体
第五节 免疫化学检测法
对表达产物的检测。
蛋白—蛋白“杂交”
利用抗体作为“探针”，检测转入受体
菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式
根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二
抗）的性质可分为几种作用方式：
待测基因
产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二
抗结合蛋白
固相支
持滤膜
待测基因
产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支
持滤膜
待测基因
产物蛋白
一抗
固相支
持滤膜
固相支
持滤膜
待测基因
产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗
结合蛋白
125I标记的二抗
2. 放射性抗体检测法过程
3. Broome-Gilbert双位点检测法
检测融合蛋白
既检测外源基因产物又检测载体基因产
物
质粒基因A 插入基因B
表达
质粒蛋白A 外源蛋白B
融合蛋白
固相支
持滤膜
抗A抗体
125I标记的
抗B抗体
质粒蛋白A 外源蛋白B
质粒蛋白A外源蛋白B固相支
持滤膜
抗A抗体
发光，底片曝光
二、免疫沉淀检测法
1. 原理
利用抗原—抗体凝集反应。
用于检测分泌型产物。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中，当
插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落
周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈
”。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先
进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体
诱发）。
三、酶联免疫吸附测（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理
一抗（primary antibody）
与目标分子的特异结合
二抗（secondary antibody）
与一抗的特异性结合
酶连（enzyme-linke）
二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再
通过比色测定有色物质的含量（或光强度），
从而推测目标分子的含量。
待测基因产物蛋白 一抗 二抗
酶
待测基因产物蛋白 一抗 二抗
无色的底物 有色的产物
比色观察
酶
2. ELISA检测的一般步骤
（1）固定样品
将待测样品加入96孔微量滴定板
（microtiter plate）的孔中，干燥后就
被固定在孔底。
孔底
（2）一抗结合
加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体
一抗
（3）二抗结合
加入二抗，与一抗结合后再将未结合的
二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。
二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧
化物酶、脲酶等）。
二抗
（4）显色反应
加入无色的底物，被二抗上所带的酶催
化反应转变成有色物质（或发光）。
图 ELISA assay
（5）比色
在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，
打印出结果。
图 Safire多功能扫描型酶标仪
的局限性
有效，但准确性稍差（主要取决于一抗
的特异性）。
必须与其他方法一起综合考虑。
最好用单克隆抗体（monoclonal
antibody）
临床检验常用的单抗
四、免疫印迹法（western blotting）
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫
的方法检测胶上的蛋白质泳带
1.原理
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
（SDS-PAGE）
① SDS
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状
态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
（Polyacrylamide gel electrophoresis）
在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质
中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小
（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。
电泳buffer
电泳buffer
图 电泳槽
点样
电泳方向
图
③蛋白质电泳的分子量标准
已知分子量的蛋白质混合液，与待测样
品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量
估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的
十六分之一。
一克约为6×1023道尔顿
Dalton
④凝胶中的蛋白质染色：
1）直接染色
考马斯亮蓝：
灵敏度底、只能检出>-1μg/带，但可
褪色回收。
硝酸银：
灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
图 直接染色电泳结果
（2）Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，
转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、
中性尼龙膜等）
胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转
移到正极一侧的膜上
膜胶
蛋白
图 Western装置
② Blotting
原理与ELISA相同。
辣根过氧化物酶：HRPO
待测蛋白硝酸纤
维素膜
一抗二抗
辣根过氧
化物酶
底物 产物，
并发出光
PAGE胶 待测蛋白
底片曝光
③ Blotting过程
1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）
与 膜上的蛋白结合。
2）洗去未结合的一抗。
3）用二抗与一抗结合（二抗上带有
HRPO）。
4）清洗掉未结合的二抗。
5）用HRPO的底物浸泡膜。
6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Immuno
Blotting
④结果
图 单抗blotting结果
图 多克隆抗体Blotting的结果
第六节 翻译筛选法
借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制
所选择的克隆载体上的外源基因的转录，
来筛选其产物是否符合预期。
适用于mRNA转录丰度高的外源基因。
一、无细胞翻译系统
能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞
提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红
细胞提取物系统。
二、转译筛选
与预期的产物分子量相符？
mRNA
无细胞翻译系统
35S标记的
甲硫氨酸
翻译 35S标记的肽链
PAGE电泳
放射自显影比较放射性
带纹的位置
载体+外源DNA
转录
三、杂交抑制转译法
1. 原理
mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双
链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转
译被抑制）。
单链mRNA
核糖体
小亚基
核糖体
大亚基
能翻译
mRNA
DNA
核糖体
小亚基
核糖体
大亚基
不能翻译
2. 过程
四、杂交释放转译法
1. 原理
在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA
与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释
放出与它对应的mRNA，进行体外转录。
研究其转录产物的性质是否是预期的基
因产物（如分子量、免疫源性等）。
2. 过程
硝酸纤
维素滤膜
载体和插
入的cDNA
总mRNA
cDNA基因的
mRNA
杂交
洗脱
cDNA基因的
mRNA 体外翻译
cDNA编
码的蛋白
电泳
凝胶放射自显影
cDNA编
码的蛋白
硝酸纤
维素滤膜
载体和插
入的cDNA
硝酸纤
维素滤膜
载体和插
入的cDNA
收集 35S标记的氨基酸
五、DNA-蛋白质相互作用筛选法
专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白
质因子。
待测蛋白质硝
酸
纤
维
素
滤
膜
能与蛋白质结
合的DNA序列 放射性标记
待测蛋白质
硝
酸
纤
维
素
滤
膜
能与蛋白质结
合的DNA序列 放射性标记
第七节 真核重组基因的选择方法
一、哺乳动物基因转移的选择标记
1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）
（1）TK选择原理
①四氢叶酸的必要性
真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提
供甲基。
二氢叶酸还原酶
dihydrofolate reductase，DHFR
二氢叶酸 四氢叶酸
DHFR
②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作
用
氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似
物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断
dATP、dCTP和dTTP的合成：
dUMP dATP TTP
dCTP 氨甲喋啉
抑制
抑制
③次黄嘌呤的补救作用
细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和
dCTP。
④胸苷酸激酶的补救作用
TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以
利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，
存活。
T tk
dUMP dATP TTP
dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉
抑制
抑制
（2）TK选择过程
① HAT培养基
含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养
基(hypoxanthine，aminopterin，
thiymidine）
② 宿主细胞
Tk- 细胞株
③ 载体标记
TK基因，只有转入TK基因的细胞才
能生存。
2. 二氢叶酸还原酶基因
（DHFR）
（1） 选择原理
①二氢叶酸还原酶的必要性
真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提
供甲基。
dUMP dATPTTP
dCTP
四氢叶酸
四氢叶酸
二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸
二氢叶酸 四氢叶酸
二氢叶酸还原酶
DHFR+细胞
DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，
所以能合成四氢叶酸。
能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中
生存
不需要补救！
DHFR- 细胞
DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，
所以不能合成四氢叶酸。
不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基
中生存。
需要补救！
② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救
无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻
时，
胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:
dUMP dATPTTP
dATP
次黄嘌呤
补救胸苷
补救
（2）选择过程
① 宿主细胞
DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养
基中生长）。
需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！
② 无核苷酸的培养基
透析除去血清中的内源性核苷酸，以免
补救。
③ 氨甲喋呤“加压”
添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的
补救作用，可提高选择。
DHFR+基因。
只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。
无核苷酸的培养基
DHFR-
DHFR-DHFR+ DHFR+ live
die
3. 新霉素抗性基因（neor）
（1）选择原理
① 新霉素（neomycin）
是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使
细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不
影响真核生物。
② G418（geneticin）
新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对
真核细胞和原核细胞都有毒性。
③ 新霉素抗性基因—neor
细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一
种磷酸转移酶（APH），能使G418失
活。
G418
真核细胞 死亡
G418
存活neor 真核细胞
（2）选择过程
① G418培养基
含致死剂量G418的完全培养基
G418：（100-800g/mL）
②宿主细胞
真核细胞株均可。
③载体标记
neor基因。
4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT）
chloramphenicol acetyl transferase
（1）选择原理
CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，
催化氯霉素发生乙酰化失活。
氯霉素
cat
乙酰氯霉素
（2） 选择条件
含氯霉素的完全培养基。
（3） 宿主细胞
真核细胞株均可。
（4）载体标记
cat基因。
（5） CAT分析方法
① 分析乙酰氯霉素
在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉
素。
用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，
检查CAT的表达。
Anti-CAT Antiserum is available from
Invitrogen.
Other kits to assay for CAT protein
using ELISA assay are available from Roche
Molecular Biochemicals and Molecular
Probes.
二、植物转化体报道基因筛选法
1. 报道基因（reporter gene)
（1）大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶
（β-D-glucuronidase，GUS）；
（2）细菌和萤火虫的荧光素酶
（luciferase）；
（3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因
（Green Fluorescent Protein）。
（4）其它
2. 几种报道基因的作用原理
GFP
紫外光照
发绿色荧光
4-甲-β-D-葡糖醛酸 荧光产物GUS
5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸
蓝色水解产物
GUS
Fireflies emit light catalyzed by
luciferase with ATP
转入萤火虫的luciferase的烟草
烟草叶片表达B型肝炎抗原
植物细胞中适用的报道基因
酶活性 是否显性 方法是否
成熟
新霉素磷酸转移酶 显性 成熟
潮霉素磷酸转移酶 显性 成熟
二氢叶酸还原酶 显性 成熟
氯霉素乙酰基转移酶 显性 成熟
庆大霉素乙酰基转移酶 显性 成熟
胭脂碱合成酶 隐性 成熟
章鱼碱合成酶 隐性 成熟
植物细胞中适用的报道基因
β-D-葡萄糖苷酶 隐性 成熟
链霉素磷酸转移酶 显性 成熟
萤火虫荧光素酶 隐性 成熟
细菌荧光素酶 隐性 成熟
苏氨酸脱氢酶 显性 成熟
磷酸肌醇乙酰转移酶 显性 成熟
乙酰乳酸合酶 显性 不成熟
绿色荧光蛋白 显性 成熟
Bromoxynil 硝化酶 显性 不成熟
5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转
移酶
显性 成熟
在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌，
由于含β-半乳糖苷酶，能分解培养基中的乳
糖，产生乳酸，使pH 下降，因而产生红色菌
落。
而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因
而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中
的乳糖，因而产生白色菌落。
通过α-互补现象筛法，将重组质粒与自身环
化的载体DNA 分开。
复习思考题
1. 概念：（1）克隆 （2）转化
（3）转位（4）基因工程 （6）限制性
核酸内切酶7）载体（8）G文库（9）质
粒（10）c文库
2. 简述基因工程的基本过程。
3. 简述获得目的基因的主要方法。
