￡-聚赖氨酸的生物合成与抑菌机理的探讨
孙艳芳 董惠钧 贾士儒
天津科技大学生化工程研究室 天津300222
摘要：本文阐述了新型生物防腐剂E一聚赖氨酸的生物合成途径，e一聚赖氨酸降解酶和质粒
pN033对合成的调节作用；对e一聚赖氨酸的抑茵机理进行了介绍，同时对应用生物信息学预测
的e-聚赖氨酸的空间结构进行了初步探讨。
关键词：e-聚赖氨酸I生物防腐荆}生物合成；抑茵机理；结构预测
Discuss枷。魏BiosynthesisandAntimicrobial
Mechanismofe-poly‘-L__Iysine
SunYanfangDongHuijunJiaShiru
(BiochemistryEngineeringLaboratoryTianjin Universityof
Science＆TechnologyTianjin300222)
Abstract：Thispaperelucidatedbiosynthesisofbio-antimicrobiale-poly-L-lysineandregulation
ofan￡一poly-L-lysine-degradingenzymeandplasmidpN033forbiosynthesis；introducedantimicro—
bialmechanismofe—poly-L-lysine，meanwhilepreliminarilydiscussedonstereostructureprediction
ofe—poly—L-lysinewithbioinformatics．
Keywords：￡一poly-L-lysine；biologicalpreservative；biosynthesis；antimicrobialmechanism；
structureprediction
￡一聚赖氨酸(￡一PL)是一种具有广谱抑菌能力的新型生物防腐剂，由日本学者腾井正
弘、平木纯首次应用于食品防腐，目前在日本已实现工业化生产。e—PL有许多优良特性：
首先其安全性高，￡一PL能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的八种氨基酸之一，
也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸，因此e—PI。是一种营养型抑菌剂；e—PL抑菌谱
广，在酸性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定抑菌效
果，而且对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用；e—PL的高水溶性和热稳定性使其更
具应用潜力。本文对￡一PL的生物合成与抑菌机理进行探讨。
1 e-PL的生物合成途径及其调节
聚赖氨酸的化学合成是由K．L．Eprain在1947年首先完成的[1|。化学法合成的聚赖氨
酸为a型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是由a一氨基和a一羧基缩合而成。1977年日本学者
S．shima和H．sakai从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25～30个赖氨酸残基的同型单
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体聚合物[2]。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过搜一羧基和￡一氨基形成的酰胺键连接而成，
故称为￡一多聚赖氨酸。研究证明￡一PL比a—PL有更强的抑菌活性，而且d—PL有毒性，目前
在国际市场上￡一PL作为食品防腐剂已经取代了a—pL[a]。
1981年Shojishima和Hechisakai对￡一PL产生菌进行了鉴定和发酵研究。作者采用不
同碳源和氮源做了对比研究，发现以葡萄糖为碳源；无机铵盐和有机氮为氮源，e—PL的发
酵产量最高，为0．49／L。同时对发酵温度、发酵周期和发酵过程进行了研究[4J。
Shimaetall5]通过将“C-L-赖氨酸掺入培养基中验证了L一赖氨酸是￡一PL生物合成的前
体物。一Shimaetal指出，￡一PL是由白色链霉菌细胞内的非核糖体多肽合成酶催化合成的，
产生的￡一PL转运到胞外。
Takahiro‘Kawaiet钮Z[6]在￡一PL在白色链霉菌无细胞体系中的生物合成的研究中指出，
在体外，e-PL的合成需要有ATP的参与，不受核糖核酸酶，卡那霉素或氯霉素的影响。他
们发现￡-PL的合成是通过膜结合酶的催化作用而进行的非核糖体的合成，同时也指出e—PL
的合成活性催化需要有赖氨酸参与的AMP的产生和ATP—PPi交换反应。据此，他们认为
从L一赖氨酸生物合成￡一PL的过程至少存在两个阶段的反应可能性：①L一赖氨酸的腺苷酸化
作用的活化②活化L一赖氨酸的缩合。但目前不清楚的是由L一赖氨酸合成￡一PL的阶段中是一
种酶还是许多酶参与了合成。
；-PL的微生物法合成通常采用合成培养基，发酵的pH偏酸性，培养温度为30℃，￡一
PI。的产量高低与生物量有相关性。各种无机盐对聚赖氨酸的合成也非常重要。
目前，￡一PL合成菌株的最高产率为5％左右，若要取
得更大的经济效益，还必须对菌株作进一步改良。传统的
方法是对出发菌株采用物化方法进行诱变。例如，通过亚
硝基胍处理，筛选L一赖氨酸结构类似物S-(2一氨基乙基)一L_
半胱氨酸和甘氨酸抗性突变株，以提高￡一PL产量。随着
对e—PL合成机理研究的深入和合成酶基因的定位、克隆
和表达，科研人员将采用基因工程手段，构建基因工程菌
应用于￡-PL的生产。
雠霉Hi菌roshiTak。．agiIF014147举萎篡篙麓等3熊7Kb产)眚墓是图，⋯的蒜⋯俐色链霉菌 中发现了一种高分子( 隐蔽性一 ‘ ⋯⋯⋯⋯⋯～⋯。
质粒pN033(图1，图2)。质粒pN033只在产生￡一聚赖氨酸的白色链霉菌中发现，因此，
ORF285ORF760RF355ORF502
图2 EcoRI—SmaI酶切片段ORFs可读框[71
此质粒可能编码￡一聚赖氨酸合成或抗性基因。为
1了进行e—PL高产菌株的分子育种，有必要开发
白色链霉菌的宿主载体系统。质粒pN033具有作
为载体质粒的特性。如中等数量的拷贝，有几个
独立的切割位点，因此只要引入抗生紊抗性基因
标记，就可作为克隆载体。HiroshiTakagiet
al[S]以pN033为载体，进行了白色链霉菌
IF014147内酰胺酶基因的克隆与分析(图3)-结果晕示，内酰胺酶的产生由氨苄青霉索诱
导，内酰胺酶是由blaL同源基因编码。p内酰胺酶基因可用作白色链霉菌IF014147、克隆载
体的标记基因。
Kaharetall9]发现，当培养基的pH为4．2～4．5时白色链霉菌可以高效率地合成和分
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泌￡一PL，当pH为5．O～8．0时e—PL会立即被菌株降解。
pKFbla2．0
pKFbla36
<露固回-s．扔讲淞
67％ 58％49％Identity
Regulatoryproteins 8一Lactamase
图3 B一内酰胺酶基因的克隆与分析L8j
￡一PL降解酶的存在对利用白色链霉菌合成￡-PL是不利的。然而为阐明￡一PL的合成机
制，需要将￡一PL降解酶进行特性和遗传分析。MitsuakiKitoetalE]O]将￡一PL降解酶提取、
纯化后进行了特性研究，发现在白色链霉菌中降解酶和细胞膜牢固结合，在链霉菌属中e—
PI。降解酶的存在与e—PL合成能力相关。
由于￡一PL为多聚阳离子，细胞表面带负电，分泌的￡一PL吸附到细胞表面，从而导致细
胞外膜脱落。Shimaetal利用电子显微镜可观察到细胞质的异常分布[10]，由此￡一PL对敏感
微生物的生长产生抑制。这解释了为什么￡一PL产生菌一般拥有膜结合的e-PL降解酶，Mit—
suakiKitoetalr10]指出白色链霉菌的￡一PL降解酶可能在对细胞的自我保护方面扮演了一个
重要的生理学角色。
2 ￡一PL的抑菌机理
研究表明，￡一PL对大肠杆菌的呼吸有一定抑制作用，并与典型的呼吸途径抑制剂存在
显著区别。同时e—PL还作用于生物膜系统和蛋白合成系统，其与核糖体结合抑制蛋白和酶
等生物大分子的合成[引。因为生物膜系统是微生物进行能量转化、物质代谢等生命活动的
主要场所，所以￡一PL吸附到生物膜上，可直接而迅速地破坏依赖于膜结构完整性的能量代
谢和细胞及细胞器赖以生存的对物质的选择性，并可导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产
生自溶作用，最终导致细胞死亡。
e—PL作为功能性多肽，其结构和功能之间必定存在密切的关系。在其一级结构层面，
ShojiShima等人[11]指出￡一PL的抑菌活性随肽链的缩短而降低，当肽链长度少于十个赖氨
酸残基，e-PL完全失去抑菌活性，因此可以推断十个氨基酸是形成具有生物活性的空间构
象所必需的；同时可以得出假设：由至少十个赖氨酸组成活性多肽，随着赖氨酸残基的增
加，其结构不断发生运动变化，逐步逼近活性最高的三维构象。这种构象涨落现象在蛋白质
结构中普遍存在，但特别的是‘￡-PL具有活性的序列长度变化大，10～30个赖氨酸不等，这
可能与￡一PL中氨基酸组成和键型的单一性有关，这在自然界存在的蛋白质中是鲜见的。通
常情况下，蛋白质中几个氨基酸，甚至一个氨基酸的缺失或改变都会导致蛋白质活性的完全
丧失。因此对e-PL空间结构的预测，有助于阐明其功能和作用机理。
3￡一PL空间结构的预测
目前，蛋白质结构研究通常采用X射线晶体结构分析、多维核磁共振波谱分析和电子
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—
显微镜二维晶体三维重构技术方法，但鉴于这些方法的时间周
期长以及技术方面的限制，因此应用生物信息学对蛋白质和多
肽进行结构预测得到广泛应用。
(1)￡一PL的二级结构单元预测：董惠钧[12]根据￡一PL的一
级结构，运用网络在线预测软件，通过与已知结构和功能的蛋
白质对比，预测了E-PL的二级结构。经PHD神经网络预测，
计算统计出e-PL一级结构中每个赖氨酸残基形成不同二级结
构的概率以及预测的可信度，其中有86．7％的残基形成a螺
旋，有13．3％的残基形成无规卷曲，而B折叠的形成倾向为
0。根据判定规则a螺旋(86．7％)>45％和口折叠一o<5％，
因此￡一PL多肽的二级结构单元为a螺旋。
图4 e—PL空间结构预测图
●暴露残基 。内部残基
(2)e—PL亲水性的预测：依照P一3一acc的判定规则，每
个赖氨酸残基的亲水性都大于36％，两端和中间的残基亲水性最强。所以￡一PL有强的亲水
性，宏观表现为易溶于水。
(3)￡一PL空间结构的预测：￡一PL的预测残基数目为30，其中预测有17个残基暴露于
多肽的外表面，暴露残基数超过50％，不能形成球形结构。
参 考 文 献
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