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马尾松合子胚发育与胚性愈伤组织诱导#
于晓芳1，张冬林1,3，杨模华1，李志辉1，伊书亮1，史昆1，丁贵杰2**
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20060538004; 20104321110002）;湖南省自然科学基
金（11JJ3038）; 863 计划课题（ 2011AA10020301）; 湖南省研究生科技创新项目(CX2011B320); 中南林
业科技大学研究生科技创新项目(2009sx06)资助。
作者简介：于晓芳 （1986-），女，硕士研究生，森林培育学
通信联系人：杨模华（1974-），女，副教授，林木细胞工程及森林培育教学及科研
（1. 中南林业科技大学林学院，长沙 410004；
2. 贵州大学林学院，贵阳 550025； 5
3. 美国缅因大学，植物、土壤与环境学系，Maine, Orono 04469）
摘要：为研究采种时间和母树基因型对马尾松幼胚胚性愈伤组织诱导的影响，笔者于 2011
年 5下旬到 8月下旬在湖南长沙郊区每隔 15天采集马尾松球果，定期显微观察合子胚发育
状况、拍照，并将不同采种期的外植体接种在 LP培养基上诱导胚性愈伤组织。实验结果表
明：5月下旬至 6月下旬马尾松雌配子体中没有检测到可见合子胚，接种后 85%的外植体褐10
化，15%诱导产生非胚性愈伤；7月份雌配子体内检测到可见合子胚雏形轮廓，接种后可诱
导产生较多、质量较好的胚性愈伤，胚性愈伤诱导率最高可以达到 15%，褐化率降至 %；
8月份的合子胚已趋于成熟，接种后大量外植体不发生反应，仅诱导产生少量的胚性愈伤组
织，诱导率最高仅为 5%。因此，诱导胚性愈伤的较好的采种时间应为 7 月 25 日，即马尾
松合子胚处于子叶前期时。实验结果还表明，同一采种时间来自同一种源地的不同母树基因15
型对雌配子体胚性愈伤诱导率没有显著性差异。
关键词：生物技术；马尾松；合子胚；采种期；母树基因型；胚性愈伤组织
中图分类号：+2
Development of zygotic embryos and initiation of 20
embryogenic callus of Pinus massoniana Lamb.
Yu Xiaofang1, Zhang Donglin1,3, Yang Mohua1, Li Zhihui1, Yi Shuliang1, Shi Kun1,
Ding Guijie2
(1. Forestry School, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,
China; 25
2. Forestry School, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
3. Department of Plant, Soil and Environment Sciences, University of Maine, Orono 04469, USA)
Abstract: To investigate the effect of timing and mother trees on inducing the embryogenic calla
in Pinus massoniana Lamb., we collected masson pine cones every 15 days in Hunan from late
May to mid-August of 2011,examined zygotic embryo development, and documented them with 30
pictures. Cones were placed on LP media for embryogenic callus induction. The results showed
that there were no visible zygotic embryo in immature cones from late May to late June.
Inoculated cones during this period produced 15% non-embryogenic calla (NEC) and 85% brown.
Zygotic embryo in July were clearly visible and could be induced high quality embryogenic calla
(EC). The highest ratio of EC and browning were 15% and %. Zygotic embryos in August 35
reached maturation and little EC was induced. The highest EC was only 5% and most of cones
were no change. So, the the better time to collect cones should be July 25th when the zygotics of
Pinus massoniana are in cotyledon prophase. Also mother trees at same collecting time had no
significant effect on EC induction.
Key words: Biological technology; Pinus massoniana Lamb.; zygotic embryo; timing; mother tree; 40
embryogenic callus.
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0 引言
马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国南方分布面积最大的造林树种之一，具有用
材、采脂、造纸等经济用途。体细胞胚胎发生具有数量多、繁殖速度快、再生频率高、不受45
季节影响等特点，被认为是最有发展潜力的规模化组培快繁技术[1]，但胚性愈伤组织的诱导
率低一直是林木体细胞胚胎发生的瓶颈，胚性愈伤组织诱导的多少和质量好坏对后期胚性愈
伤的增殖、体胚成熟与萌发有重要的影响。马尾松体细胞胚胎发生技术已获得成功[2-4]，但
马尾松胚性愈伤诱导困难，且胚性愈伤诱导率低，这些问题严重制约了马尾松体细胞胚胎发
生这一技术的产业化应用。靳小翠[5]等针对马尾松胚性愈伤组织诱导的困难问题进行了不同50
采种期胚性愈伤的诱导研究表明，不同采种期诱导率有差异，且诱导率低，但没有结合合子
胚的发育阶段来探讨。松属树种中，当幼胚处在某一发育阶段时，对诱导胚性愈伤组织的反
应比较敏感[6]。吴丽君等[7]对湿地松（Pinus elliottii Engelm）合子胚发育与体胚诱导的研究
表明，不同发育状态的合子胚胚性愈伤的诱导率不同。Becwar 等[8]对火炬松(Pinus taeda L )
的研究表明, 当火炬松的合子胚处在子叶前期时，较易诱导产生胚性愈伤组织。Carneros 等55
[9]对意大利石松(Pinus pinea L.)的研究表明，6 月下旬和 7 月上旬的合子胚是最佳的球果采种
期。而有关马尾松合子胚发育阶段对胚性愈伤诱导率的研究还未见报到。确定最佳的马尾松
合子胚的发育阶段以诱导出高质量的胚性愈伤组织对建立马尾松良种体细胞胚胎发生应用
体系至关重要。所以本实验从观察马尾松合子胚的发育阶段入手，结合不同阶段幼胚的胚性
愈伤组织的诱导情况，建立马尾松合子胚发育与胚性愈伤诱导之间的对应关系，解析合子胚60
的发育进程对马尾松胚性愈伤组织诱导的影响，为选择最佳采种期，确定最佳的幼胚发育阶
段和高诱导率、高质量的马尾松胚性愈伤组织提供研究基础和技术支撑。
1 材料与方法
实验材料
马尾松未成熟球果取自湖南省天际岭林场，分别于 5 月 24、6 月 12、6 月 25、7 月 12、65
7 月 25、8 月 2、8 月 15、8 月 25 日采种，选取长势良好的三株母树，记为 A、B、C，每次
每树采 15-20 个球果，分母树基因型冷藏带回实验室。每个采种期每株母树取出 4 个球果，
剥出种子，混匀，随机取 30 粒浸于 FAA 固定液中，用于合子胚发育阶段的显微镜检。余下
的球果用 75%酒精擦拭表面，置于实验台上待球果表面晾干后装入透气的自封袋中，存于
4℃冰箱中冷藏备用。 70
实验方法
外植体的无菌处理
从冰箱中取出冷藏 20d 的马尾松球果，用软毛刷沾洗衣粉溶液将球果表面刷洗干净，放
在流水下冲洗约 30min，然后置于无菌操作台上，先用 75%的酒精清洗 3min，无菌水冲洗
3-4 次，再用 %的升汞消毒 10min，无菌水冲洗 4-5 次，放入已灭菌的烧杯中。用灭菌枝75
剪剥出马尾松的种子，用灭菌镊子小心去掉种翅和种皮后接种于已灭菌培养基中。
诱导培养基及培养条件
诱导培养基用 ..R 培养基，激素组合为 mg·L-1 2,4-D+ mg·L-1 6-BA+ mg·L-1
KT+ mg·L-1 NAA，添加 1000 mg·L-1水解酪蛋白，500mg·L-1 L-谷氨酰胺，蔗糖 10g L-1，
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琼脂 8 g·L-1 （>1300mg/cm2），调 pH=。培养室温度为（23 ±2℃ ℃），暗培养。每棵母80
树每个采种期接种 20 个外植体，三次重复。
未成熟合子胚发育阶段检测
取出 FAA 固定液中的马尾松种子，采用抽样检测法，在体视显微镜下划开胚乳，小心
剥出合子胚置于干净的载玻片上，于倒置显微镜下观察，放大 20×~400×，拍照。对定期采
集的球果、种子和合子胚，均用游标卡尺测定其横径、纵径长度，仔细观察各自的颜色、形85
态，记录于观察表格中。
愈伤组织形态学观察
对诱导产生的愈伤组织根据外表形态、色泽、愈伤产生位置、后期生长状况等进行分类、
描述，区分胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织。
数据统计与分析 90
将不同采集时间的马尾松幼胚接种，50d 后统计愈伤的类型、数量，观察愈伤组织的外
部形态，统计胚性愈伤(embryonic callus EC)、非胚性愈伤(none embryonic callus NEC)、褐
化数及无变化的外植体数量。所得数据采用 excel 作图，SPSS 数据统计分析。
2 结果与分析
合子胚发育状况的镜检结果 95
检测结果发现，同一时期三株母树合子胚的发育进程基本一致（图 1）。5 月 24 日和 6
月 12 日采集的球果没有观察到可见的合子胚雏形。参照 Pullman[10]对花旗松（Pseudotsuga
menziesii）和火炬松（Pinus taeda）的合子胚发育阶段的划分标准，结合观察到的马尾松合
子胚发育进程，发现，6 月 25 日的合子胚处于第二阶段，合子胚呈半透明状，胚头部胞质
浓厚，胚柄透明粘稠；7 月 12、25 日采集的球果其合子胚分别处于第三，四阶段，处于这100
两个阶段的合子胚为不透明状态，胚体伸长，胚头开始膨大，合子胚轮廓逐渐明显，胚柄变
粗缩短；8 月 3 日的合子胚处于第五阶段，此时合子胚的胚头继续膨大，胚柄逐渐退化，胚
轴渐渐伸长，顶端分生组织原基出现；8 月 10 的合子胚处于第六阶段，本阶段合子胚子叶
原基出现，胚柄继续退化，胚轴伸长；8 月 23 日采集的球果其合子胚处于第七、八阶段，
这两个阶段的合子胚子叶伸长，并逐渐高出分生组织。 105
图 1 马尾松合子胚不同发育阶段形态
Fig. 1 Developmental stages of zygotic embryos in P .massoniana
110
表 1 是马尾松不同采种期幼嫩球果、种子与合子胚变化的观察数据。由表中可以看出，
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从 5 月下旬至 6 月下旬，马尾松球果和种子幼嫩，胚乳由粘稠液态向半固化发展，还无可见
合子胚，球果与种子的横径、纵径值增幅较大，球果与种子生长速度较快。进入 7 月份后，
球果开始变硬，球果与种子的横径、纵径值增幅变缓，营养物质逐渐积累，胚乳固化，内种
皮可与胚乳分离，合子胚渐成形；8 月份的马尾松球果与幼胚逐渐趋与成熟，球果与种子的115
横径、纵径值变化不大，球果与种子的生长基本停止，进入形态成熟阶段。马尾松合子胚的
发育从 6 月下旬渐显雏形，到 8 月下旬完成形态发育过程历时约 2 个月。
表 1 马尾松不同采种期幼嫩球果、种子与合子胚的变化
Table 1 Development of cones, seeds, and zogytic embryos in P..massoniana Lamb. during May to August. 120
愈伤组织诱导
外植体在接种处理后的 60 天内，陆续被诱导产生愈伤组织。统计 60 天内每棵母树每个
采种期的胚性愈伤组织数、非胚性愈伤组织数、褐化外植体数以及接种后无变化的外植体个
数，计算百分率，统计分析结果如图 2-图 4 所示： 125
球果 种子 合子胚 采样
时间
月-日
母树
横径/cm 纵径/cm 横径 /
纵径
外观 横径/cm 纵径/cm 外观 长度/mm 发 育 阶
段
05-24
A
B
C
鲜绿色，种
鳞 边 缘 棕
色，种鳞幼
嫩较小
种皮白色，质软，
内部粘稠水状
--
--
06-12
A
B
C
鲜绿色，种
鳞 边 缘 红
棕，种鳞幼
嫩较小
种皮白色，质较
软，胚乳半固化，
种皮和胚乳不能
分开
--
--
06-25
A
B
C
同上
种皮乳白色，质较
硬，胚乳形成，质
软，种皮和胚乳可
分开
二
07-13
A
B
C
深绿色，种
鳞边缘深棕
色，种鳞变
硬
同上
三
07-25
A
B
C
同上
种皮乳白色，质较
硬，胚乳形成，质
较硬，种皮和胚乳
可分开
四
08-03
A
B
C
深绿色，种
鳞边缘棕褐
色，种鳞坚
硬
种皮浅黄色，质较
硬，胚乳白色，珠
孔清楚
五
08-10
A
B
C
同上
同上 -31
六
08-23
A
B
C
深绿色，种
磷坚硬
种皮浅黄色，质
硬，胚乳乳白色，
珠孔清楚
七、八
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%
%
%
%
%
%
%
%
%
1 2 3 4 5 6 7 8
采种次数
胚
性
愈
伤
诱
导
率
（
%）
A树
B树
C树
%
%
%
%
%
%
1 2 3 4 5 6 7 8
采种次数
非
胚
性
愈
伤
诱
导
率
（
%）
A树
B树
C树
图 2 不同母树不同采种期外植体胚性愈伤诱导率
Fig2 Effect of timing and mother tree on EC induction
rate.
图 3 不同母树不同采种期外植体非胚性愈伤诱导率
Fig3 Effect of timing and mother tree on NEC induction
rate.
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
1 2 3 4 5 6 7 8
采种次数
褐
化
率
（
%） A树
B树
C树
%
%
%
%
%
%
%
%
%
%
1 2 3 4 5 6 7 8
采种次数
无
变
化
率
（
%） A树
B树
C树
图 4 不同母树不同采种期外植体褐化率
Fig4 Effect of timing and mother tree on browns rate
图 5 不同母树不同采种期外植体无变化率
Fig5 Effect of timing and mother tree on no-changes rate
图 2-5 分别是不同母树基因型在不同采种期获得的胚性愈伤诱导率、非胚性愈伤诱导
率、褐化率以及外植体无变化率的统计结果图。图 2 表明，对三个母树基因型 A、B、C 而
言，不同的采种期其胚性愈伤组织的诱导率均有差异。分别对不同母树不同采种期的胚性愈
伤诱导率进行方差分析，结果表明，不同采种时间对胚性愈伤组织诱导率的差异呈极显著水
平，不同母树基因型对胚性愈伤诱导率有差异但差异不显著。A、B、C 三株母树未成熟球130
果在第 5 个采种期（即 7 月 25 日），胚性愈伤组织诱导率均达到最大值，其中以 A 树在不
同的采种时间胚性愈伤诱导率为最高，B 树次之，C 树最低。其胚性愈伤诱导率分别为 15%、
%、%，褐化率分别为 %、0%、0%，非胚性愈伤诱导率分别为 %，%，55%，
无变化的外植体数量极少，即该时段接种的外植体都能被诱导启动。在不同的采种时间，三
个母树基因型的幼胚诱导产生非胚性愈伤组织的数量远远大于胚性愈伤诱导的数量（图 2，135
图 3），不同母树基因型对非胚性愈伤组织的诱导率呈显著性差异。
对图 2-图 5 的图示结果进行综合比较，发现，6 月中旬以前采集的球果，幼胚接种处理
后，外植体容易发生褐化死亡，褐化率最大可以达到 85%，严重影响愈伤组织的诱导；6 月
下旬至 7 月下旬采集的球果，褐化率较低，同期其胚性愈伤和非胚性愈伤的诱导相对容易，
诱导率均较高；8 月以后，随着种子的成熟，外植体接种后基本不褐化，诱导启动的数量也140
较少，无变化率较高。因此，6 月中旬以前以及 8 月以后的种子幼胚均不适合胚性愈伤组织
的诱导，最好的胚性愈伤诱导的时期是 6 月下旬至 7 月下旬，本次试验结果表明，7 月 25
日采集的球果的幼胚，最适合于胚性愈伤组织的诱导，其诱导率最大可达 15%。显微镜检
结果显示，此时的合子胚正处于子叶前期，这与 Becwar 等[8]对火炬松(Pinus taeda L ) 最佳
诱导胚性愈伤组织的合子胚发育阶段为子叶前期的结果一致。 145
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愈伤组织形态学观察
在本实验中产生的愈伤组织主要有两种类型。一类是从胚乳表面向外生长的愈伤组织
（图 6-A），此类愈伤组织表面比较致密，质地较硬，干燥，外观颜色为浅棕色，后期生长
较为缓慢，为非胚性愈伤组织；将其放在倒置显微镜下观察，发现此类愈伤组织致密紧实，
表面光滑，没有明显的早期体细胞胚头突起（图 6-a）。而另一类愈伤组织从珠孔处呈喷射150
状吐出(图 6-B)，亮白色、质地松软、晶莹透亮，愈伤表面有透明晶亮颗粒状物质分布，水
分饱满，生长速度较快，在后期的增殖培养中增殖能力强，能被诱导出成熟的体细胞胚，鉴
定为胚性愈伤组织；本类愈伤组织在倒置显微镜下观察，可以看到其表面有很多凸起的早期
体细胞胚头，愈伤组织整体呈现出松散、疏松的状态（图 6-b）。实验表明，5 月至 6 月接
种的外植体诱导产生的多为非胚性愈伤组织，几乎没有胚性愈伤产生；7 月接种的外植体诱155
导产生的多为胚性愈伤组织，8 月份马尾松种子开始形态成熟，合子胚生理成熟，接种后诱
导产生的胚性愈伤组织较少，非胚性愈伤组织相对较多，无变化数多。
注：图 A、a 为非胚性愈伤组织 （NEC） 图 B、b 为胚性愈伤组织(EC) 160
图 6：胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织形态学观察
Fig6：Morphological observation of EC(A,a) and NEC(B,b)
3 结论与讨论
马尾松胚性愈伤组织诱导与合子胚的发育阶段密切相关，幼胚诱导产生胚性愈伤组织的
最佳采种时间为 7 月 25 日，此时的合子胚发育阶段为合子胚子叶前期，胚柄渐渐退化，此165
时有利于胚性愈伤组织的诱导。这与 Becwar 等[8]对火炬松合子胚发育时期与胚性愈伤组织
诱导频率之间的关系研究结果一致，李茜等[11]对白皮松不同发育时期的未成熟合子胚胚性
愈伤组织诱导结果也表明，不同发育时期其诱导率差异也很大。5 月中旬至 6 月中旬采集的
马尾松球果，剥出的种子内还未见合子胚的明显轮廓，合子胚发育处于第二阶段，接种后诱
导产生的多为非胚性愈伤组织，加之此时的马尾松种子种皮和胚乳难以分开，接种后宿存的170
种皮很容易导致外植体褐化，进一步阻碍了胚性愈伤的诱导，故这一时期不适合诱导胚性愈
伤组织；6 月下旬到 7 月份下旬，马尾松合子胚雏形发育，形态发育分化比较明显，胚头发
展，胚柄退化，合子胚处于三、四阶段，尤其是在 7 月下旬，合子胚胚头形成，胚柄进一步
退化，此时的幼胚合子胚正处于子叶前期，内种皮与胚乳容易剥离，外植体接种后褐化数量
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较少，诱导产生较多质量好的胚性愈伤组织，此时，胚性愈伤诱导率达到最大。因此，7 月175
下旬的外植体最适合诱导胚性愈伤组织。火炬松胚性愈伤的诱导最佳时间为也合子胚子叶前
期[8]。8 月份采集的马尾松外植体，合子胚进入形态成熟阶段，子叶开始分化，胚柄退化，
胚轴形成，接种后长时间不发生启动，诱导产生的也多为非胚性愈伤组织，所以并不适合胚
性愈伤组织的诱导。
不同马尾松母树基因型的胚性愈伤诱导率有差异，但母树基因型对胚性愈伤诱导率无显180
著影响。黄健秋等[2]在对不同种源的马尾松基因型对胚性愈伤诱导率影响的研究中发现，不
同种源的马尾松成熟胚对胚性愈伤的诱导率有很大差异。不同种源的湿地松[12]、火炬松[8]
胚性愈伤诱导率也有很大的差异。这些均说明母树基因型对胚性愈伤诱导有一定影响，但其
影响作用方式还有待进一步研究。
185
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