中国农业科学 1997，30(2)；I～15
Scientia Agricultura Sinica
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转基因植物食品中标记基因
的安全性评价
贾士荣 0口 占
(中国农业辩学院生杓技术研究中心，北京 100081)
△
捶要 标记基因是筛选转基目植物的有效方法。日前转基 园植物已广泛进行 了田阊试验，
有些已被批准商业化应用。鉴于几乎所有转基 因植物中都含有标记基 目，且同一标记基园己转
入不同的作物中，园此夸后^们消赉的食 品中标记基目及其产物的含量将增大，其安圭性引起
了普遍关注。国蕲机构如 FAO、WHO、OECD以及美国的FDA、北欧部长委员告等都在研究和
制订条啻j，我国尚未将遭传工程体(GMO)食品安全性的 价提到议事 日程上 有鉴于此，本文
试田重点以北欧都长委员告的出版物(1996)为兰奉，结合国际机构的咨询研讨结论，就植物食
品中标记基目的安全性评价作一综进，以供读者参考
美t词 转基园檀盐}标记基因}食品；安圭性
建立在重组DNA技术基础上的现代生物技术，使人们已可有 目的地将植物、动物、微
生物 的基因转人植物 ，产生的转基因植物 已广泛进行了田间试验，有些 已被批准商业化 ，
有关它对生态环境和食物安全性的影响已进行了不少研究，积累了有价值的资料 。
为促进制订转基因食品安全性评价的 国际条例和 国际贸易，1990年粮农组织(FAO)
和世界卫生组织 (WHO)联合召开 了“食品安全性 与生物技术 的专家咨询会议”，并于 1991
年出版了咨询报告《生物技术食品安全性分析的策略》(wHO，1991)。1992年FDA公布了
转基因植物作为食物的政策，该政策规定 ，来 自重组 DNA技术的植物新品种及其产品 ，不
需由FDA作市场前评价和批准，除非它引起新的安全性问题。经济发展合作组织(OECD)
1993年提出了“现代生物技术食品的安全性评价：概念和原则”的报告，报告中引入了一个
“实质等同性”(substantial equivalence)的概念。WH0(1995)将实质等同性原则用于现代生
物 技术产生的植物食品的安全性评价 。1996年 9月 30日至 1O月 4日第二次 FAO／WHO
专家咨询会议于意大利罗马举行，就生物技术与食品安全性问题作了进一步讨论，会议将
转基因植物、动物 、微生物产生的食品分成三类 ：(1)与市售传统食品具有实质等 同性 ；(2)除
某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性}(3)与传统食品没有实质等同性“ 。
标记基因(包括选择 标记基 因及报告基因)用于帮助在植物遗传转化中筛选和鉴定转化
的细胞、组织和再生植株。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡，
转化细胞由于有抗性，可继续成活、分裂并分化成植株。选择标记基因包括抗生素抗性基因
及除草剂抗性基因等，其中用得最多的是抗生素抗性标记基因。报告基因包括 葡糖醛酸苷
酶(gus)、荧光素酶(1uc)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、以及绿色荧光蛋白(gfp)基因等。
标记基因通常 与目的基因构建在同一植物表达载体上，一起转人植物 ，但标记基因本身
有时也可作为目的基因，如除草剂抗性基因提供除草荆抗性。
收幡 日期 1996—12—25
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2 中 国 农 业 科 学 3O卷
1993年 9月，WHO于丹麦召开了标记基 因的专题讨论会 ，出版了“转基 因植物 中标
记基因的健康问题”的报告，该报告提出了标记基因安全性分析的一般原则，但并未详细
分析各种标记基因的安全性。最近北欧部长委员会 (1996)出版了《转基因食用植物中标记基
因的健康问题》一书，对现用的几种标记基因作了详尽分析，主要包括 3种抗生寨抗性标记
(卡那霉素、潮霉寨和链霉素抗性)、3种除草剂抗性 标记[Glufosinate、草甘膦、绿黄隆
(Chlorsu1furon)]及 1种报告基因(gus)，最后列出了可安全使用的标记基因建议名单。
1 植物食品中标记基因安全性评价的一般描述
WH0(1993)报告中提出的植物食品 中标记基 因的安全性评价原则是 ：(1)标记基 因的分
子 、化学和生物学特性 ；(2)标记基因的安全性应与其他基因一样进行评价 ；(3)原则上，某一
标记基因的资料一旦积累，应可用于任何一种植物，且可用于与任何一种目的基因连接。
1．1 标记基因的安全性
1．1．1 标记基因有无直接毒性 任何DNA都由4种碱基组合而成，目前所用的标记基因
在 DNA组成上并无异常 据计算 ，在 24 h内进入消化道的真核 DNA在小肠中有 200～
500 mg，在结肠中则为 20～50 mg。食 用转基 因番茄 FLAVR SAVR (Calgene公司)后，
在同样时间内摄入的卡那霉寨抗性基因DNA估计为0．33～1．O0 Pg，因此与消化道中持续
存在的其他 DNA相比是微不足道的。根据所有生物食 品都含有大量 DNA，DNA在肠胃道
中很快被降解，标记基 因的 DNA 组成并无异常，WHO(1 991)及 FDA(1994)得 出结论认为
食物中的转基因 DNA本身并无安全性问题 。
1．1．2 基因水平转移(Horizontal gene transfer)的可能性 人们食用转基 因植物食品后，
其中的绝大部分 DNA已降解 ，并在肠 胃道 中失活 (表 1)。极小部分 (<O．1 )是否会有安
全性问题?例如标记基 因特别是抗生素标记基 因会否水平转移 至肠道微 生物或上皮细胞，
从而降低抗生素在临床治疗中的有效性?
目前的结论是 ：这种可能性非常小 ，除非在特倒 中需加考虑。理由是 ：
1．DNA从植物细胞中释放出来后 ，很快被降解成小片段 ，甚至核苷酸，因此植物 DNA
在进入有肠道微生物存在的小肠下段、盲肠及结肠前已被降解。
2．即使 DNA 完整地存在 ，DNA转移并整合进受体细胞也是一个非常复 杂的过程 ，包
括许多步骤 ：(1)DNA 必须与细胞结舍 ，穿过细胞膜进入细胞 ，且不被宿主细胞 内的核酸酶
及修饰系统降解。(2)受体细胞必须呈感受态。(3)为与受体细胞的基因组发生重组，供体和
受体至少要有一段 2O bp的DNA完全同源。(4)要有合适的调控系统才能表达。(5)标记基
因的表达只有在筛选压下才有优势，对抗生素标记而言，只有在口服抗生素后才有这种选择
压。(6)目前尚不知在消化系统中有植物 DNA转至微生物的机制，上皮细胞又因新陈代谢、
半衰期很短而被不断取代 ，不可能保存下来。因此标记基因水平转移并表达 的可能性极小。
工程植物原材料及未煮过种子 中的标记基因 DNA 不可能产生安全性问题 ，经食 品加工后
的植物材料则更不可能 。
对卡那霉素抗性基因 Kan (ap柏’一Ⅱ)，FDA食品顾问委员会 (1994)的结论是，番茄 中
的aph(3’)H 基因极不可能在消化道中转至微生物，不会引起安全性问题。
1．1．3 未预料的基 因多效性 基 因的多效性有的可预测，有 的则不可预测 ，其效应可有利
或不利 。多效性包括次生效应 ，如插入位点及插入基因产物 所引发的“下游”效应 ，影响代
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2期 贾士 荣 ：转基因植物食品 中标记基 因的安垒性评价 3
谢过程。如新霉素磷酸转移酶标记基因可改变细胞的磷酸化状态 。
寰 1 降解蛋白和 DNA的消化一
Table 1 Digestive enzymes which degrade proteins and DNA
目前 尚无法预测基因的插人位点或做到基因的定点整合 。由于基 因整合的随机性 ，外源
基因可插人植物基因组的非编码区、结构基因区或调控区，引起插人突变，如引起某一基因
的失活，这是一个常见的现象，因为通常基因在转录活跃区的整合机率大于静止区。相反，
若插人的位点使阻抑基因(repressor)失活，则可激活沉默基因。这些插人突变的表型可能
觉察不到或很小 ，也可能很大，甚至致死 。
插人 突变与物理和化学诱变相类似 ，可在 常规育种 中由育种家加以选择 ，即在育成品
种及商用 以前淘汰不利性状 。育种家更重视的是插人基因的稳定性 ，是否会在后代中失去
期望的表型性状 。
尽管基因多效性有不利的一面，但目前尚无随机插人激活毒性代谢途径的报道。WHO
(1993)的结论认为 ，尚无标记 基因插人不 同位点而引起 特殊的次生效应或多效性的证据 ，
标记基因的次生效应分折应作个案处理，即比较转基因植物及常规品种的关键成分是否有
实质等同性。
1．2 标记基因编码蛋 白的安全性
包括 (1)直接毒性 {(2)过敏性 }(3)因蛋 白的催化功能而产生的副作用。应考虑 的主
要问题是蛋白水平及每天摄人量，以及蛋白在消化道中的稳定性 蛋白在消化道中可降解
为小瞻和氨基酸。工业用酶的设计是使酶能忍受极端环境，如酸、热稳定，其设计原则和结
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中 国 农 业 科 学 30卷
构基元序列有不少已清楚 。植物转化 中所用 的标记基因不是专门针对在消化道的扳端条件
下保持其稳定性而设计的，在模拟消化系统中已观察到许多蛋白包括 APH(3’)一II及CP4
EPSPS很快被降解
1．2．1 标记基因编码蛋白的直接毒性 已知有许多蛋白对人有毒性，但在正常膳食中无
此类蛋白(如细菌毒素或蛇毒)。大量结构和功能不同的蛋白已有长期安全食用的历史。植
物遗传转化中所用的标记基因，其编码的蛋白尚_无直接毒性的证据，经与毒性蛋白的氨基
酸序列比较，没有显著的同源性，标记基因产物降解成多肽后，也无证据说明比其他蛋白降
解后的多肽毒性大，因此不可能产生新的毒性物质和安全性问题。
来自细菌的标记基因，是否会因翻译后修饰产生毒性?目前尚无这方面的科学数据。
1．2．2 蛋白的过敏性 若转移的标记基因来 自一种已知的食物过敏原，则应考虑转基因
植物中表达的蛋白是否有致敏性。目前尚无标记基因编码的蛋白有过敏性的证据，它们在
消化系统中很快被降解可支持这一论据。
1．2．3 蛋白功能及安全性 除直接毒性和过敏性外，还应考虑标记基因编码蛋白的催化功
能 ．即是否会对宿主的代谢产生潜在影响。催化功能取决于是否要求有辅因子 ，如需要 ，则
要考虑在消化道中是否存在以及存在的数量 此外还应考虑其底物的专一性，底物在植物中
降解的方式。对抗生素抗性标记而言，在人和动物作抗生素治疗时，抗生素的口服剂量是
否会失效 ，当酶在消化道中仍有功能活性时这可能发生 ，因此应计算转基因植物材料的最
大摄人总量及食物中抗生素抗性蛋白的摄人量。
2 卡那霉素抗性(Kan )标记基因
Kan 基因aph(3’)一II广泛地用作选择标记，是植物转化中所用的第一个标记，也是目
前最常用的标记(占文献报告的 9O 以上)，1994年首次批准商用的延熟番茄 FLAVR
SAVR] 中即含有该基因，其他待批的转基 因植物 中也含有 Kan 基因。
2+1 卡那霉素抗性基因
迄今至少已克隆了 1 6个编码氨基糖苷类修饰酶并提供 Kan 的基因：4个为己酰转移
酶 [AAC(3)一III，AAC(3)一Ⅳ]，3个为腺 苷基转 移酶 [ANT(2”)一I)，9个为磷 酸转移 酶
CAPH(3’)一I，APH(3’)一II，APH(3’)一III，APH(3’)一Ⅳ，APH(3’)一VI，APH(3’)一Ⅶ]，其中
aph(3’)一IIa(或 aphA一2，亦称 nptll，kan 或 7leO )编码氨基糖 苷 3'-磷酸转移馕 II[APH
(3’)一II]，亦祢新霉素磷酸转移酶 II(NPTII)，是植物转化中最常用的显性选择标记，通常
称为卡那霉素抗性基因或新霉素抗性基因。aph(3’)一JJ基因的核苷酸和氨基酸全序列已发
表(Beck等 ，1982) 。
卡那霉素抗性基因来 自Kan 细菌，aph(3’)一lla基 因只在 自然界中的真细菌 (eubacte—
ria)中发现，如革兰氏阴性菌及荧光假单胞菌(Pseudomonas spp．)。在一次普查 中，184种
Kan 细菌分离物中有 3株含 aph(3’)一lla序列。在另一次对 4200株临床抗一种或多种氨基
糖苷类抗生素分离物的普查中，有 2．5 的细菌古aph(3’)-Ila序列，说明该基因多数是在
革兰氏阴性菌中。
虽然编码 APH(3’)一II蛋 白的基因已从不 同来 源分离 出来，但最常用的是来 自抗卡那
霉素的大肠杆菌 。aph(3’)一J 基因常与转座子 Tn5有关，在延熟番茄转基因中所用的 aph
(3’)一IIa基因，分离自含 ColE1：：TnS的大肠杆菌 K12。
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2期 贾士荣：转基因植物食品中标记基因的安全性评价
2．1．1 基因的毒性 在分析 FLAVR SAVR 番茄 的安全性时 ，据估计 kan 基 因的拷贝
数在每一体细胞中不超过 1O个，从而计算出食用新鲜番茄后 kan 基因的量为 3．3×1O
～10X10～ng／d，实际接触的量显然要低得多。与消化系统中的DNA种类和数量相比，这
种摄人量应可忽略不计 ，因此 kan"基因极不可能引起直接毒性。
2．1．2 消化道中基因水平转移概率的估算 首先，aph(3’)一 极不可能由植物基因组水
平转移至肠道微生物，迄今不知有这种转移机制，也无类似报道。其次，即使这种转移可能
发生，其后果也很小，因为人体肠胃道中天然存在着 Kan 细菌并产生这种蛋白。据估计在
小肠中kan 基因转至细菌中的频率为1×10 ～2．6X10 ／人，即每 1000个人食用转基因
番茄后有一个肠道细菌由感转为抗卡那霉素或新霉素，因此食用转基因番茄后不会显著增
加 Kan 细菌的数量。
2．1．3 基 因的多散性 迄今尚无报告说 明 aph(3’)一Ⅳ 基因的产物在植物中有任何次生效
应，这在FLAR SAVR 番茄中已作过详尽研究，未发现有次生效应。kan 基因通常为单位
点插入也降低 了基 因多效的可能性 。
在食 用植物的其他科、属中详细研究 aph(3’)一 基因产物有无多散性也很重要 ，因为
不同植物 中可能有不同的效应 。FDA得出结论认为 APH(3’)一II在番茄(茄科)、油菜(十字
花科)和棉花(锦葵科 )上应用是安全 的(FDA，1994)。
2．2 kan 基 因编码的蟹白
蛋白水平及每天摄人量：在评价延熟番茄的安全性时，据计算aph(3’)一 基因的最高
表达量不超过总蛋 白的 0．1 ，APH(3’)一II蛋白在番茄果实总蛋 白中小于 0．08 。因此摄
人量为 25～74 ng／(kg体重 ·d)。
蛋白稳定性 ：Fuchs等” 纯化了大肠杆菌 中表达的 APH(3’)一II蛋白，认 为在化学和功
能上与转基因棉花种子、马铃薯块茎及番茄果实 中的 APH(3’)一II蛋白相当。在模拟胃的条
件下(古 胃蛋 白酶的溶液 ，pH1．2，37℃)，纯化的 APH(3’)一II蛋 白很快被降解 ，Western
杂交说明该蛋 白在 1Os内降解。同样 ，纯化的 APH(3’)一II蛋 白与模拟的小肠液在 37℃共培
养，5 min即失去活性。因此无论在 胃或小肠中，APH(3’)一II均很快被降解 ，即使不降解 ，
它也不会在投有 ATP及胃中pH酸性的条件下有功能，因为该酶需有 ATP作为辅因子才
有功能
APH(3’)一lI蛋白可能在下列条件下使饲料 中加入的新霉素硫酸盐失效 ：(1)该蛋 白在
胃肠中不被降解；(2)蛋白在胃肠中仍保持活性；(3)有足量ATP存在；(4)肠胃道可提
供发挥酶活性的适宜条件0 。Emlay等“ 研究转基 因棉籽粉和油菜籽粉中新霉素硫酸盐的
抗苗活性 ，将含 aph(3’)一Ⅳ 基 因的种子在 37℃贮存 8周，磨粉后分 析 APH(3’)一II无 酶活
性
2．2．1 蛋白毒性 基于下列理 由，APH(3’)一II对人体及动物无毒性 ：(1)APH(3’)一II与
已知毒素无明显同源性。(2)APH(3’)一II作为一种蛋白，其毒性很低，每天每公斤体重的
摄人量又极低。(3)用大肠杆菌中表达的APH(3’)一II蛋白作小鼠急性毒性试验，证明管饲
法的积累剂量达 5000 mg／kg体重时无不利影响 ，比食用含 APH(3’)一II蛋白的马铸薯或
番茄时的每天平均摄人量高百万倍 。
2．2．2 蛋 白的过敏性 Calgene公 司的数据证明，APH(3’)一II不是人体的过敏原0 ：(1)
与已知过敏原无明显同源性。(2)该蛋白无必需序列以转运至亚细胞位点而发生糖基化，
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6 中 国 农 业 科 学 30卷
因此它不会被糖基化并随后增加抗原性 。(3)对人体来说 ，APH(3’)一II不是一种新蛋白，
在正常肠胃道中即存在 Kan 细菌．可产生这种蛋白。(4)该蛋白在肠胃道中很快被降解，
因而减少了吸收的可能性。
2．2、3 基 因产物的功能 基因产物 APH(3’)一II抗 卡那霉 素(图 1)、新霉素、巴龙霉素
(paromomycin)、榱糖霉素(ribostamycin)、butirosin、庆大霉素 B及 geneticin(G418)。
卡那霉素与其他氨基糖苷类抗生素一样，可与接糖体蛋白结合从而抑崩蛋白质的合
成。APH(3’)一II酶可催化卡那霉素及其他氨基糖苷类抗生素氨基己糖上的 3'-羟基发生依
赖于 ATP的磷酸化，修饰后的卡那霉素分子不再能进人细胞并与 30S榱糖体亚单位结合
从而导致 mRNA的错译 。
卡那霉素的临床应用始于 1957年 。该抗
生素也可破坏细菌的细胞膜 ，导致细胞中低
分子量化合物的泄漏 ，最后杀死细胞 。因萁
有相当的副作用 (耳毒性导致听力丧失)，臼
前 已很少在临床上应用 ．只有在分支杆菌对
其他药物有多抗性时，卡那霉紊才用作结核
苗的抑制剂。新霉素也因同样 的原因在临床
上很少使用，有时在小肠手术前用作预 防小
肠感染 。这些抗生素在人医上已被其他更有
效的氨基糖苷类抗生素所取代，但它们在兽
医上仍有应用。G418则只用作体外试验。
2．2．4 蛋 白的底物专一性 许多氨基糖苷
类可披 APH(3’)一II磷酸化，但 APH(3’)一II
并不抗所有氨基糖苷类．因为不同的底物其
磷酸酸化效率不同。序列分析可将氨基糖苷
田 1 卡那■素殛其酶促反应的位置
Fig．1 Kanamycin and its position for catalytic
reaction by different enzymes
类修饰酶归成不同的家族，APH亚族包括所有已知 3'-磷酸化的酶，如APH(3’)一II。氨基
糖苷磷酸转移酶含有几个保守的功能域，位于蛋白羧端的 3个基元序列在磷酸化中可能具
有特殊的功能。
aph(3’)抗性基因的表达可能在离体哺乳动物细胞中改变几种内源基因的表达及代谢，
改变细胞内的磷酸化状态。但另一方面．已有报告说明 aph(3’)在人类细胞 中表达 ，基因治
疗中通过引人含转录活跃的完整 kan 基因后未发现有毒性和副作用。
2．3 卡那霉素抗性基因的安全性评价
如上所述．对 aph(3’)一 基因及 APH(3’)一II蛋 白已作过详尽的安全性分析 。l990年
l1月，Calgene公司提请 FDA对番茄中利用 kan 基因及 APH(3’)一II酶进行专家咨询，
1991年8月该公司又要求FDA对FLAVR SAVR 番茄作为食品作专家咨询。该公司集中
分析了与番茄果实成分有关的特性，包括关键性营养成分、 胡萝 h素、抗坏血酸及配糖生
物 碱如 n一番茄素及茄碱等 ，结论是未发现有成分变化 。1993年 1月 ，Calgene公司进一步要
求 FDA对培育延熟番茄中所用的标记基因作为一种食品掭加剂加以评价。1994年 5月
FDA 完成 了对 FLAVR SAVR 番茄及 APH(3’)一II的评价 ，批准 APH(3’)一II可作为一种
食品添加剂，结论认为APH(3’)一II可安全地用于培育番茄、油菜和棉花新品种。食品中的
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2期 贾 士荣 ：转基 因植物 食品中标记基因的安全性评 价 7
APH(3’)一II不会影响口服卡那霉素或新霉素的治疗有效性。
必须指出，目前至少已克隆了 16种 Kan 基因，编码三类不同的酶，即己酰转移酶、腺
苷基转移酶及磷酸转移酶 ，这三类基因／酶 之间并无结构相似性 ，且同一类酶 中的不同成
员之间甚至还有差异 ，因此 (^3’)一Ⅳ 及 APH(3’)一II可安全应用的结论 ，并不全部适用于
其他 Kan 基因及其产物
3 潮霉素抗性标记基因
潮霉素抗性标记基因的选择效率在某些作物(如禾答类)上比kan 基因高，其应用有增
加的趋势 。
3．1 潮霉素抗性基因
aph(4)一／a(或 )^基 因及 aph(4)一／b(或 g)基因，又称 f，提供潮霉素抗性 。 f基
因编码氨基糖苷 4一磷酸转移酶 APH(4)一I，又称潮霉素磷酸转 移酶。 ^ 的核苷酸序列及
APH(4)一1a和 APH(4)一Ib蛋白的序列已发表 。
aph(4)一la基因分离 自大肠杆菌 W677菌株的 pJR225质粒 ，aph(4)， 基因则来 自产
潮霉素 B的 Streptomyces hygroscopicus。这两个 aph(4)一I基因编码的氨基酸序列并无相关
性，只有 52 相似，18 相同，但有几个区高度保守，只有少数氨基酸序列与其他APH蛋
白同源 。
3．2 潮霉素抗性基因的功能
潮 霉素 B是 一种 原核 币ll
真核细胞中蛋白质合成的抑制
剂。APH(4)一1可将磷酸共价
地加到潮霉素 B的第 4位上 ．
从而提供潮霉索抗性 。
3．3 潮霉素抗性标记基因的
安全性评价
目前 尚无对潮霉素抗性标
记基因安全性评价的详细资料。
图 2 潮霉素 B为一种氨基糖苷类抗生素
big．2 Hygromyc~n B is an am[noglycoside antibiotic
因临床治疗中不用潮霉素，故作人的食品不存在安全性问
题。潮霉素只用于兽医临床，治疗猪和家禽的疾病。
了解 下列问题是评价潮霉素标记基因安全性的基础 ：(1)对人是 否是新的基因／产物 ，
即在人的小肠微生物区系中是否天然存在 (2)与已知基因／蛋白作详细序列比较，以明确
其是否有潜在毒性、过敏性或其他副作用。(3)肠胃道中是否有辅因子(如ATP)且能保持
酶活性。(4)观察植物材料中有无基因多效性 (次生效应)，重点是研究 细胞 中的磷酸化状
态及其可能后果。
经详 细研究分析后 可能不 至于带来新的安全性问题，因为该 基因编 码的蛋 白与 aph
(3’)一盯 基因的产物相似，同样都是分离自傲生物的磷酸转移酶，虽然两者之间没有显著的
同渌性．且无共同的底物。
4 Glufosinate抗性标记基因
除草剂抗性基因在植物遗传转化中可同时用作选择标记和培育抗除草剂的作物。膦化
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麦黄酮抗性基因已很快成为筛选可育的转基因谷类作物的方法，用以代替卡那霉素抗性筛
选。豌豆组织由于本身耐卡那霉素，因此用 Glufosinate抗性很有效。用广谱除草剂的解毒
或降解基因作选择，相对来说不会有基因型的依赖性。另一优点是在转基因后代中可通过
喷洒除草剂进 行纯合系的选择 ，并便于作环境释放 中的安全性分析 ，如研究花 粉扩散距
离 、与近缘野生种杂交的可能性等。
4．1 Glafosinate抗性基因
Glufosinate是一种谷酰胺合成酶的抑制剂。Glufosinate(或 bialaphos)抗性基因bar，
克隆自土壤细菌Streptomyces hygroscopicus。基因的核苷酸序列已发表。 “”。另一 Glufosi
hate抗性基因pat，克隆 自S．viridochromogenes 。该基因编码一种PAT酶，与bar基因
产物有相似的催化能力。
4．2 Glufosinate抗性基因的功能
在 S．hygroscopicus中，bar基 因提供对 除草剂 bialaphos(该菌产生的一种三肽抗生
素)的抗性 ，Biala~Ihos由膦化麦黄酮(PPT，L一谷氨酸的类似物)和两个 L一丙氨酸残基组成 ，
完整的三肽不具离体抑制活性，由细菌或植物中的肽酶除去两个 L一丙氨酸残基后，PPT释
出才有活性。PPT亦可化学合成 ，是市售非选择性除草剂 Basta@(Glufosinate 氨)的活性成
分。
PPT的毒性作用是抑制氨基 酸的生物合成 ，更特异的是 PPT是植物 中谷酰胺合成酶
(GS)的竞争抑制剂。
PPT
谷氨酸— 卜_一 谷酰胺
GS在植物的氨同化及氯代谢调节中起重要的作用，它是植物中唯一的解毒酶以解除
由硝酸盐还原、氨基酸降解及光呼吸中释出的氨的毒性。PPT抑制GS，导致氨快速积累及
植物细胞死亡 哺乳动物中也有GS，虽然PPT抑制细菌、植物及哺乳动物中的GS，但因它
不能通过血脑屏障，并在肾中很快被清除，因此对哺乳动物无毒性
bar和 pat基因编码膦化麦黄酮己酰转移酶(PAT)，PAT使 PPT的 自由氨基乙酰化
从而对 PPT解毒(图 3)
NH— Ac
因为在植物细胞中有大量的乙酰辅酶 A，它 噼化麦黄酮 乙阮_瞬化麦黄酮
是 PAT需要 的底物之一 。 Ph 岫 晡西n A嘲yl珊啪ph|natb c
4．3 Glufosinate抗性标记基因安全性评价 圈3 Bar爰pat基因产构脯化壹重一乙墨转葛一
编码 PAT蚤 自的 DNA 本身对 消费者 ⋯ 应
． ， ．
并不会增加危险性 。PAT是一种新酶，在人 。 nd df nes,phos h_n0t in acetyItra№
体中无内源的这种酶。PAT在植物中高表 ferase(PAT)
达时可达总可溶性蛋白的 0．1 。用模拟的胃及小肠液已研究了蛋白水解酶对 PAT的降
解，几分钟内即降解，大或稳定的肽段已不再存在，因此用实验动物进行急性毒性试验并
不能提供更多的安全性数据。PAT与已知的毒蚤白无同源性。资料证明PAT也不具有过敏
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原的特性，如热或水解稳定性、以及食物 中的浓度很高等。PAT与 已知的 120多种人体过
敏蛋 白无 同源性。该蛋自在植物中是否糖基化 尚不清楚 。
安全性上需考虑的一点是，由于 pat基因的引人，食品中可产生新的代谢产物即N一乙
酰基一PPT(图 3)。但若 PPT仅作为一种选择压 ，用作早期选择转化的植物细胞 ，在田间不
喷牺除草剂，则不需考虑PPT新的代谢产物，也不会有食品安全性问题。
5 草甘膦抗性标记基因
草甘膦是目前普遍使用的非选择性除草荆，可控制世界上绝大多数有害的杂草。该除
草剂对动物无毒性，很快被土壤微生物降解。草甘膦抗性基因已用作显性选择标记，在许多
作物的转基因中应用 ，例如用突变的 EPSPS酶 (5一烯醇一丙酮酰莽草酸一3一磷 酸合成酶)，或
使 EPSPS酶超量表达。还有一个新途径是用草甘膦氧化一还原酶(gox基因)对草甘膦解毒 。
5．1 草甘磷抗性基因
5．1．1 大肠杆菌及 Salmone肠 typhimurium 中的 印sps基因 大肠杆菌及 S．typhimuri-
m的多种’突变体含抗草甘膦的 EPSPS。对 Salmonella进行化学诱变，发现抗性突变是在
aroA基 因上。DNA序列分析说明有两种不 同的抗性突变 首轮诱变造成 aroA基因启动子
的突变，表达水平提高，但对草甘膦的抗性较低。第二轮诱变在aroA的结构基因部分产生
点突变 。
EPSPS主要定位在植物的叶绿体中，细菌的 aroA基 因由于没有 叶绿体转运肽序列 ，
故只能在细胞质中表达。突变的细菌 EPSPS酶靶 向叶绿体，可显著提高对草甘膦的抗性 ，
如大肠杆菌 中的突变 EPSPS与转运肽的 3’序列连接 ，使其靶 向叶绿体 ，转基因植物 对草
甘膦的抗性高于野生型epsps基因的超表达。
5．1．2 农杆菌中抗草 甘膦的 印sps基 因 Padgette等。 从农杆菌 CP4中分离出抗草甘膦
的 sps，该菌存在于土壤中作物的根区。CP4 EPSPS蛋白对草甘膦的抗性很高，草甘膦存
在与否都有相似的催化特性。CP4 epsps的基因序列及推导的氨基酸序列已确定。通过氨基
酸序列、活性区残基的同源性 比较 以及三维结构分析 ，已明确了CP4 EPSPS与其他 EPSPS
之间的结构关系。食物中存在不同的EPSPS，CP4 EPSPS的氨基酸序列与食物中的EPSPS
蛋白相似。CP4 epsps基因与拟南芥叶绿体 sps的转运肽序列融合，转人canola油菜后靶
向叶绿体 ，显示很高的草甘膦抗性 。含 CP4 EPSPS的转基 因大豆已在 田间进行 了大量试
验，选育出了可商用的品系。
5、1．3 植物中的 epsps基因 epsps基 因也已从抗草甘膦的植物中分离出来 。矮牵牛的 —
sps基因转人植物后 ，其草甘膦抗性 比田间杀死所有杂草的剂量高 4倍 。
5．2 草甘脯抗性基因的功能
绿色植物固定的碳，约有 2O 经莽草酸代谢途径，最终形成芳香族氨基酸、维生素、木
质素、生物碱及酚类物质。除草剂草甘膦(Monsanto公司注册的商品名为 “Roundup”)，是
EPSP合成酶的抑制剂。草甘膦阻止莽草酸转为分支酸，抑制芳香族氨基酸的合成，后者在
蛋白质合成中很重要。这一代谢途径仅存在于微生物及植物中，所有植物及微生物来源的
食物中都含有 EPSPS蛋白。哺乳动物从食物中获得芳香族氨基酸。
喷洒草甘膦后，抗草甘膦的植物由于抗草甘膦的EPSPS酶继续起作用，提供植物所需
的芳香族氨基酸，敞而不受影响(匿4)。但EPSPSs常表现出与其底物 PEP的结台能力降
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10 中 国 农 业 科 学 3O卷
低。只有农杆菌中分离的CP4 EPSPS不仅酶活性高，抗草甘瞵，而且紧密地与其底物 PEP
结合。
5．3 草甘脯抗性标记基因的
安全性评价
目前尚只有抗草甘瞵大
中CP4 EPSPS的安 全性评价
资料。Monsanto公司 1994
1月曾 向英国提出申请 ，要求
批准抗草甘膦大豆的商业化
基因：转基因大豆中仅 含
单拷贝的 CP4 epsOs基 因，其
DNA 序列 已知，插人基 因 的
稳定性 已用 Southern杂交及
PCR法证明
EPSPS蛋 白：所 有植物、
微生物及真菌来源的食物中均
含 EPSPSs，因此该 酶及其 活
(Gl ∞se)
0
II
HO---- P— CH2NHCHtcOOH
l
0H
— — ÷ 芳香族氯基酸
(Aromatic amino acids)
抗草甘脯的 CP4EPSPS(Glyphosa,e．,oI~ cP4EPSPS)
PEP一．霹酸蝽辞 |Ii酮酸盐 I SaP一 莽草 畦一3一礴酸 }EPSP一 5一烯辞 尉 酰莽
草酸一3·礴瞳 I Pi一无机礴瞳 ，CP4 EPSPS一抗 草甘辨的 EPSPS
PEP — phosphoenolpyruvat~I SaP ～ shikimate一3一phosphate‘ EPSP 一 5一
tnolpyruvylshlkimate一3-phosphate{Pi— inorganic ph0sph丑t I CP4 EPSPS—
glyphosate·tolerant EPSPS
圈 4 转基嗣檀糟囊达 CP4 EPSPS后抗簟甘一
Fig．4 Gtyphosate tolerance in transgenic plants expressing
CP4 EPSPS
性对食品而言并不是新的。CP4 EPSPS在抗草甘膦的大豆中表达很低 ，占大豆种子重量的
0．01 9 ～0．040 。为证 明CP4EPSPS蛋 白对哺乳动物的安全性 ，模拟消化试验显示其很
快降解 ，胃中的半衰期小于 15 s，小肠中小于 10 rain。急性毒性试验中用管饲法 ，剂量大
1000倍(572 mg／kg体重)时对小鼠无剐作用，在酸性胃液中无酶活性。CP4 EPSPS与1935
种已知的毒蛋白无氨基酸序列同源性，与已知的过敏蛋白特性如分子量大小、浓度、稳定
性、糖基化等及氨基酸序列相 比也无明显的同源性。尽管 以上任何一个单独的生化指标都不
能预测蛋 白是否是过敏原 ，但组合这些特性可得 出结论认为 CP4 EPSPS没有 明显的致敏
性。
多效性／次生效应：分析转基因大豆及对照中的营养成分 (如大量营养成分 ．特别是脂
肪酸、氨基酸、芳香族氨基 酸)、主要抗营养因子、内源过敏原的成分和数量，都说 明没有明
显区别 ，即 CP4 epsps转基因大豆与市售大豆具有实质等同性 。
1995年英国已批准抗草甘膦大豆作为食品，结论指出CP4 EPSPS蛋白可安全作为食
品及饲料
类似的实质等同性分析已用于延熟番茄(nptII基因)、抗草甘膦的canol$油菜、抗草甘
膦的棉花、Bt抗虫棉以及抗马铃薯甲虫的马铃薯等．经详尽分析，已肯定这些食品与传统
食品具有实质等同性 。
6 绿黄隆(Chlorsulfuron)抗性标记基因
绿黄隆抗性标记基因曾用于延熟番茄及为改进甜椒风味的转化。水稻上可用于代替潮
霉素抗性基因，转化效率相似，绿黄隆抗性的优点是所用浓度低，仅 10 nmol／L，与潮霉素
相比为 1}10000。
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2期 贾士荣 ：转基 园植物食 品中标记 基因的安 全性 评价 ¨
6．1 绿黄隆抗性标记基因
绿黄隆是一种磺酰脲除草剂(商品名Glean )，抑制 乙酰乳酸合成酶 的活性 。突变的als
基因可提供这种除草剂抗性，已从烟草、拟南芥、甜菜及玉米中克隆出来。由于相应的野生
型ALS酶是支链氨基酸台成中的重要一步．因此所有植物中都有 als基因，植物中的这些
分支氨基酸是动物所岿需的。
ALS是一种高度保守的酶。拟南芥、烟草及欧洲型油菜中als基因产物的氨基酸序列相
似性达 85％。als基因突变只有 1～2个氨基酸改变，如烟草 als突变体 C3由Pro196变为
Gin，另一烟草 突变体 S4一Hra有两个氨基酸改变．即 Prol96一AIa及 Trp573~Leu。上述
两种基因在氨基酸水平上的差异只有0．7 。拟南芥中的两个als突变体已经测序，其中抗
绿黄隆的突变体 csrl Pro197变为 Ser。
6．2 基因产袖的功能
als基因编码乙酰乳酸台成酶 ALS．又称乙酰羟酸合成酶 ALS是支链氨基酸亮氨酸、
异亮氨酸及缬氨酸合成途径中第一个共同的酶(图 5)。
匪 ~(Gtycotyds)
替氟酸 Glut~ ate
丁P龇hosp甜hinet hri
ine 辞氧酰ll耋Glutamine
Sulforiylureas
图 5 氨基酸生桕台成遮径中际草剂的靶位
FIg．5 Herbicide targets in amino acid biosynthetic pathways
在缬氨酸及亮氨酸台成过程中，ALS催化两个分子的丙酮酸缩合形成 2一乙酰乳酸，同
时释放COz。若一分子丙酮酸与2一氧合丁酸缩合，则生成异亮氨酸(图 6)。ALS催化的缩合
反应中要求有TPP(硫胺紊焦磷酸盐)及活泼的中间体羟乙基一TPP(HETPP)．还需有FAD
及金属离子如 Mg 、Mn 。
磺酰腮类化合物通过竞争抑制ALS，从而干扰支链氨基酸的台成。突变的ALS不受除
草剂的抑制．其催化活性及动力学参数不变。
6．3 绿黄隆抗性标记基因的安全性评价
绿黄隆的用量低，对动物毒性小。由于 ALS在植物中普遍存在，故在人的膳食中并不
是一种新蛋白。根据OECD的报告 ，若野生型酶和突变酶之间无其他差异，则从食品安
全性角度考虑，突变酶应与野生型酶具有实质等同性，因此不会引起附加的安全性问题。
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l2 中 国 农 业 科 学 30卷
丙酮酸 2
～nw acid
丙酮酸
Pyruvic acid
2一氧合丁酸
2~xobutyri~
acid
CH】
f。A乙ce酰to乳lac酸lic a呻cid· 城氰酸V l ■
I
—
cH1 亮氯酸 Lcucin。
COOH
硫胺紊攥磷酸盐 Thiarnine-pp
FAD
g++
亡=0
C0oH CH．
十 — — —
— — — — -_ ．
氍 ＼ 一嚣
S 、o butyric acid
田 6 乙t乳t台成酶(ALS)的僵化反应
Fig．6 The reactions catalyzed by acetolactate synthase(ALS)
7 GUS报告基因
gus作为报告基因由Jefferson等。 提出。该体系建立后 ，已获得上千种含 GUS的转
基因植物。其优点是检测方法简单，灵敏度高 鉴于植物中天然存在的 GUS酶的最适 pH
为 4．5，因此 GUS检测用 pH8．0时通常 内源 GUS很少被测出。
7．1 gus基 因殛其功能
gusA(前称 uidA)克隆自大肠杆菌 K12，编码 葡糖醛酸苷酶，是稳定的同源四聚体，
每亚单位的分子量为 68000。
GUS酶催化水解各种葡糖醛酸苷的O一糖苷键。人体中的GUS是一种溶酶体酶，酶匮
乏导致vI型粘液多糖病(MPSⅦ或称 Sly综合症)，原因是胰、肝、肾、脑及骨骼系统的溶酶
体中贮存未降解的氨基葡聚糖(glycosaminoglycans)。重组 GUS已考虑用作 MPSⅦ病人的
酶替代治疗，并作为融合蛋白的一部分用于肿瘤的抗体治疗。
GUS可用组织化学法或作定量分析。灵敏的显色底物有 X—Glue(5溴一4氯一3吲哚基一
葡糖醛酸苷)及 MUG(4一甲基一伞形酮基一葡糖醛酸苷)。
7．1．1 表达水平 脊椎动物及其伴随的微生物区系中有天然的 GUS活性，如大肠杆菌。
最初报告在绝大 多数高等植物中检测不到 GUS活性 ，但后来发现许多植物在特定的发育
阶段有类 GUS活性。Hu等“ 观察了52种种子植物，发现大多数植物种的胚胎、果壁、种壳
及胚乳中有类 GUS活性。Wozniak＆Owens。 报告在甜菜中有很高的内源 GUS活性。
7．1．2 GUS蛋白的稳定性 GUS酶很稳定，耐多种洗涤剂和各种离子浓度，作用时不需
辅酶，亦无任何离子要求，但因其可被某些二价重金属离子(Cu 及 Zn一 )所抑制，故在
分析时应考虑加 EDTA。
细菌的GUS酶可在任何生理pH下进行分析，最适 pH为 5．2～8．0，pH4．3时酶活性
约为 50 ，GUS耐热，55C 2 h衰减一半，人的 GUS酶最适 pH 为 4．0，热稳定性可达
68℃ 。
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2期 贾士荣：转基因植暂食品中标记基因的安全性评价 13
在活细胞及多数提取液中GUS高抗蛋白水解酶，半衰期很长，但在模拟胃消化系统
中极易降解，半衰期小于 15 s。
7．2 GUS报告基因的安全性评价
目前尚无 gus基因安全性评价的资料。由于人体组织及小肠细菌中有类似的基因，因
此gus基因及其产物不是新物质，在膳食中增加GUS不可能影响健康。在急性管饲法毒性
试验中，GUS蛋白与 APH(3’)一II蛋白一样，无有害效应，摄人的GUS蛋白超过安全系数
的 i000倍 。
g 基因的多效性及对植物代谢的次生效应仍需进一步研究。
8 可安全使用的标记基因
由于同一标记基因可用于不同的作物，因此将来不同植物食品中将含有同一标记基
因，从而增加该基因及其产物的日摄人量。同时在第二轮转化中，为选择新的转化体，又必
须用不同的标记基因，因此未来食物中又将含不同的标记基因。为此，有必要列出可安全
使用的标记基因名单。目前已获得的资料汇总于表 2。
可安全使用的标记基因是指：标记基因本身(启动子及终止子除外)及其主产物可安全
地作 为人的食品，不包括基因多效性及各种可能的次生效应，因为次生效应可 因插入位点
不同而异。 ·
裹 2
Table
鲁种标记基因安盒性评价资科的 总
2 Summary of the information missing Or avaiIabIe for the preliminary safety evaluation of the
marker genes
+：斑辩充分．无安生性问题{一：赘辑尚不充分
+：Information sufficient，nD heMth problems，一：Inf0rmation tlOt suff~ient
可安全使用有两种含义：一是无任何限制，该标记基因可 自由地用于其他作物的转
化，不需作进一步的安全性分析。二是在特定条件下采用，即有某些限制，包括：标记基因
／蛋白在转化作物 中的数量，如拷贝数。FDA(1994)确定对 aph(3’)一Ⅱ 基因在食 用作物中
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14 中 国 农 业 科 学 30卷
的拷贝数及表达水平无上限限制。因同一标记基因在不同作物中可能有不同的功能，因此
有的仅限用于某一科的植物种。在确定某一标记 基因可安全使用之前 ，必须证明它至少可
在 2～3个科的植物神中安全使用。若无理由证明基因结构的细微改变会明显影响基因／基
因产物 的特性，则可被接受 。
基 于上文讨论 ，目前可得出以下结论：
Kan 标记基因aph(3’)一Ⅱ (nptH)及其产物已经过详尽研究，可作为第一个安全使用
的标记基因，但其他 Kan 基因因有不同的底物专一性，故尚需补充资料，暂不能列人名单
中。如npt II基因一样，hpt 基因也编码磷酸转移酶，它们之间有某些相似性 尽管hpt 似
可作为安全使用的抗性标记的侯选者，但仍需补充资料，包括在人的小肠生物区系中是否
有该基因及其产物，是否有毒性及过敏性，是否有基因产物的多效性等。
确定标记基因安全性的一个重要标准是：新型性 Glufosinate抗性基因来自土壤放线
细菌 S．hygroscopicus，编码一个新蛋白，它在植物食品中的安全性仍需作进一步考虑，包
括毒性／过敏性及基因多效性等。
与Glufosinate抗性标记不同，草甘膦及绿黄隆抗性基因／蛋自在所有植物中都存在，
因此不是一个额成分，不需在不同科的植物中作进一步测试，是可供安全使用的候选标记
基因。
gus也不是新基因，因在人体细胞及小肠生物区系中均有相当的酶活性，因此逻辑上
应将 gus基因包括在可安全使用的标记基因中
综上所述，北欧部长委员会出版物中建议目前将下述两种标记基因列人可安全使用的
名单 中：
·aph(3’)一 J卡那霉素抗性标记基因
· 草甘膦抗性标记基因，编码 EPSPS
必须指出。随着科学数据和经验的积累，上述名单将会有所修正，因为科学上新的发
现必然会修正现有的看法和结论。
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Safety Evaluation of Marker Genes in Transgenic Food Plants
Jia Shirong
(Biotechnology Research Center，CAAS，Beijing 100081)
Abstract Marker genes are effectively used for selection of transgenic plants．Trans—
genic plants have been extensively field—tested，and some have been released f0r eommer—
cial production．Since marker genes are existed in almost all transgenic plants and the
same or different marker genes are already transferred to many food crops，the amount of
marker genes and their products in human diet wili be increasing that leads to the public
concern． InternationaI organizations such as FAO ，W HO ，OECD，FDA in USA ．and
Nordic Council of Ministers have paid、great attention to this issue and many monographs，
reports relevant to it have been published．The safety assessment of foods derived from ge—
netically modified organisms (GM0s)has not been extensively considered in China．
Therefore，it may be important and useful to have a review in this respect．This article de—
scribes the safety evaluation of marker genes in transgenic food plants according to the
published data by the international organizations，and the Nordic Council of M inistry in
particular．
Key words Transgenic plants I Marker genes I Food I Biosafety
一—_『■一
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