《药品微生物检验技术
》
模块三 药品有效性检查
项目二 抗生素效价测定
任务一 庆大霉素溶液的制备
任务二 双碟的制备与加药培养
任务三 数据处理与结果判断
目
录
项目二 抗生素效价测定
任务一 庆大霉素溶液的制备
任务引入
请 思 考
抗生素标准品的效价单位是明确标明的。配制标准品溶液
时称量的标准品数量无法预先确定，如何根据标准品的称量数
量计算出缓冲液的用量，配制出准确浓度的抗生素标准品溶液
？
某制药企业生产了一批硫酸庆大霉素片，为
了知道这批硫酸庆大霉素片的抗菌效力，需要进
行效价测定。用什么方法测定硫酸庆大霉素片
的效价？效价测定对环境、操作员有什么要求？
任务分析
本任务以庆大霉素标准品与供试品母液的配制为例，介
绍抗生素效价测定缓冲液、供试品溶液和标准品溶液的配制，
工作内容及要求见下表。
工作内容 工作要求 关键点
缓冲液的配制
选择正确缓冲液、配制
正确
计算、称量、调剂pH、分装、灭菌
供试品溶液的配
制
称量准确、稀释操作准
确
称量、溶解、定容、稀释
标准品溶液的制
备
方法正确、完成制备 称量、溶解、定容、稀释
相关知识-缓冲液的配制
庆大霉素标准品所需缓冲液为pH值为的无
菌磷酸盐缓冲液，其成分与配制方法如下：
取磷酸氢二钾 ｇ与磷酸二氢钾 ｇ，
加水使成 1000ｍＬ，滤过，在115℃灭菌30min。
缓冲液的配制流程
计算用量 称量 溶解 分装 灭菌
磷酸氢二钾 磷酸二氢钾
任务实施
一、制订工作计划
序号 工作内容 完成时间 成员 负责人
1 缓冲液的配制
2 供试品溶液的配制
3 标准品溶液的制备
根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。
任务实施
二、试验前准备
设备、器材、试剂 规格 数量 用途
高压蒸汽灭菌器 灭菌溶液
电子天平、无菌药匙 称量试剂
无菌烧杯、无菌玻璃棒、无菌研钵、无菌
容量瓶、无菌移液管
溶解、稀释溶液
无菌具塞容量瓶 分装溶液
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、蒸馏水 配制缓冲液
庆大霉素片、庆大霉素标准品、无菌水 配制供试品、标准品
无菌室、超净工作台、酒精灯、75%酒精 操作场所
冰箱 保藏溶液
补充1：
补充2：
任务实施
三、试验操作
序号 步骤 操作内容
1 选器具
高压蒸汽灭菌器、电子天平、1000mL烧杯、100mL无菌烧杯、无菌玻
璃棒、无菌药匙、容量瓶
2 取试剂 取磷酸氢二钾一瓶、磷酸二氢钾一瓶、蒸馏水
3 称量 电子天平称量磷酸氢二钾___g与磷酸二氢钾____g于小烧杯中
4 溶解 加水溶解，转移至大烧杯中，润洗___遍，加水使至____mL
5 分装 将上述配制好的缓冲液分装至____只___mL容量瓶中，加塞，包扎
6 灭菌 将包扎好的缓冲液放入高压蒸汽灭菌器中，___℃,灭菌___min
7 保藏 取出灭菌好的缓冲液，放至于_____保藏待用
无菌磷酸盐缓冲液的制备
任务实施
三、试验操作
记录供试品与标准品溶液的配制过程
序号 步骤 操作内容
1 选器具
电子天平、100mL无菌烧杯、无菌玻棒、无菌研钵、100mL无菌容量瓶、无菌移液管、
无菌药匙
2 选药品 庆大霉素片、庆大霉素标准品、无菌水
3 称量庆大霉素
取___片庆大霉素片，称量每片的重量，计算平均片重为______
将_____片药片放入无菌研钵中进行研磨，研细称取_____g药粉于____mL无菌烧杯中
4 缓冲液用量的计算
庆大霉素片每mg的单位为________U，根据称取的庆大霉素粉末的量，缓冲液应为
______mL
5 初溶导入容量瓶
加入移液管取____mL无菌水至烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌使药粉溶解，引流转移至
____mL容量瓶中
6 洗烧杯合并洗液 用定量的无菌水润洗烧杯____次，将润洗液转移至容量瓶中与初溶液合并
7 定容
用上述计算的缓冲液的量，减去初溶与润洗烧杯的量，得出应加入的缓冲液的余量，将
余量加入容量瓶即得
8 保藏 将配置好的母液放于______中备用
任务测评
序号 考核内容 考核标准 配分 得分
1
无菌磷酸盐缓冲
液的制备
正确计算并称量试剂 10
正确配制缓冲液 10
能完成缓冲液的灭菌操作 5
正确保藏无菌缓冲液 5
2 供试品溶液的配制
正确计算并称量药品 10
正确操作药品的溶解与定容 10
正确保藏供试品母液 5
3 标准品溶液的制备
正确计算并称量标准品 10
正确操作标准品的溶解与定容 10
正确保藏标准品母液 5
4 清场
能正确完成实训室的清场 10
能正确完成无菌室的清洁 10
合计 100
项目二 抗生素效价测定
任务二 双碟的制备与加药培养
任务引入
请 思 考
根据试验设计的不同，抗生素
微生物检定法中的管碟法分为二剂
量法和三剂量法。其中，二剂量法
测定抗生素效价的流程包括哪几步
呢？制备双碟时，不同的抗生素使
用的试验菌及其培养基又是如何确
定的呢？
管碟法
二剂
量法
三剂
量法
测定抗生
素效价的
流程？
任务分析
根据庆大霉素质量标准项下规定的检测方法，本任务参照《中国药
典》2020年版四部通则中抗生素微生物检定试验设计表，选择庆大霉素
对应的试验菌与培养基配方，进行双碟与不锈钢小管的检测与清洗、培
养基的制备与保藏、试验菌的培养及菌悬液的配制、双碟的制备、不锈
钢小管的放置等试验。具体见下表：
相关知识-双碟、 不锈钢小管的检测与清洗
1.双碟水平的检测
可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，
加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深
浅一致来判断双碟底面是否平整。
2.不锈钢小管的检测
用游标卡尺测量不锈钢小管的高度、内径和外
径， 要求其内径为+，高度
+，外径为+
3.双碟与不锈钢小管的清洗
在清洗时要注意多用流水冲洗，160℃干热灭菌
2h后备用。
相关知识-无菌培养基的配制
无菌培养基的配制流程
计算用量 称量 溶解 调节pH值 分装 灭菌
庆大霉素微生物检定所用培养基为pH值为的Ⅰ号培养基，其
配制方法如下：混合胨(5g)、牛肉浸出粉(3g)、磷酸氢二钾(3g)、水
(1000mL)，调节pH值使比最终的pH值略高，加入琼脂(15-20g),加
热溶化后过滤，调节pH值使灭菌后为，在115℃�灭菌30min。
相关知识
含菌培养基的制备
可庆大霉素微生物检定对应的试验菌为短小芽孢杆菌，其菌悬液制备方法如下：取短小芽
孢杆菌的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在 ３５�３７�培养
７天，用革兰染色法涂片镜检，应有芽孢 ８５Û以上。用灭菌水将芽孢洗下，在 ６５�加热
３０ｍĖｎ，摇匀，备用
双碟的制备
加底层 加菌层 加不锈钢小管
相关知识
抗生素溶液滴加及双碟培养
稀释抗生素标准品与
供试品溶液
滴加抗生素溶液
培 养
任务实施
一、制订工作计划
序号 工作内容 完成时间 成员 负责人
1 双碟、不锈钢小管的检测与清洗
2 无菌培养基的制备与保藏
3 含菌培养基的制备
4 双碟的制备
5 抗生素溶液滴加及双碟培养
根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。
任务实施
二、试验前准备
任务实施
三、试验操作
按照表 3-2-10记录双碟、不锈钢小管的检测与清洗过程。
任务实施
三、试验操作
按照表 3-2-11记录无菌培养基的制备与保藏过程。
任务实施
三、试验操作
按照表 3-2-12记录含菌培养基的制备过程。
任务实施
三、试验操作
按照表 3-2-13记录双碟的制备过程。
任务实施
三、试验操作
按照表 3-2-14记录抗生素溶液滴加及双碟培养过程。
任务测评
项目二 抗生素效价测定
任务三 数据处理与结果判断
任务引入
抗生素微生物检定法中，由于各种原因，可能出现某个数据缺失或个别数据
特别大、特别小的现象，在一定数量范围内，可以根据其他数据，通过计算补齐
或者用计算出的数据替代特别大或特别小的数据。如果由于操作不规范或其他原
因，测出数据的可信限率超过规定标准，说明误差过大，这种情况下测出的数据
能使用吗？是否需要重新试验呢？
误误差差过过大？大？
重新重新试验试验？？
请 思 考
任务分析
本任务的工作内容及要求见下表：
相关知识
1.将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，换上玻璃盖，用游标
卡尺测量抑菌圈直径。
2.或者将换好玻璃盖的双碟 ４个放入扫描仪相应的位置，
推入抽屉扫描测得抑菌圈直径，见右图。将测出的数据记录
于下表中。
一、抑菌圈直径的测量与记录
使用扫描仪进行抑菌圈的测量
相关知识
将测量完抑菌圈的双碟在高压蒸汽灭菌器中灭菌后，除去培养物，将培养
皿清洗、干燥后归位。
二、培养物的处理
三、数据处理
特大、特小值的剔除：在同一剂量组内的
各个反应值中，如果出现个别特大或特小的
反应值，应进行异常值检验，以确定其是否
应被剔除。检验异常值的方法很多，本任务
中建议使用狄克森 （Dixon)检验法。
样本量
（ｍ）
当可疑反应值是最小值
（ｙ１）
当可疑反应值是最大值
（ｙｍ）
3-7
8-10
11-13
狄克森检验法异常值的 J１、J2和J3计算公式
相关知识
三、数据处理
特大、特小值的剔除：如果计算得到的
J１、J2或J3值超出表3-2-21中给出的标准
值，则判断为异常值，可考虑剔除。当同
一组中的观察反应值数目大于13个时，本
方法不适用。
相关知识
三、数据处理
缺项补足：反应值被剔除或因故反应值缺失造成缺项，致各
剂量组的反应个数 ｍ不相等时，应根据试验设计类型补足缺
项 ｙ，使各剂量组 ｍ相等。
ｙ＝(ＫＣ＋ｍＲ－Ｇ)／［(Ｋ－１)(ｍ－１)］
式中:Ｃ为缺项所在剂量组内的反应值总和
Ｒ为缺项所在行的反应值总和
Ｇ为全部反应值总和 （均不包括剔除值）
Ｋ为标准品与供试品的剂量组之和
当剂量组内安排的区组数较多时，也可将缺项所在的整个区
组除去。
【例2】在例题１中的特大值剔除前，其所在剂
量组的反应值总和为，所在行的反应值
总和为，该次检测所得到的全部反应值
总和为。标准品与供试品各有4个剂量组。
请补足剔除异常值之后的缺项ｙ。
相关知识
三、数据处理
方差分析：根据表3-2-22的结果，计算
差方和Ｑ、自由度f、误差项方差s2等。
相关知识
三、数据处理
可靠性测验-剂间变异分析：通过对剂间变异的分析，测验标准品和供试品的剂量和反应的关系是否显著偏离平
行直线。（）法剂间变异分析包括试品间、回归、偏离平行３项，见表3-2-23。
注：表中S1、S2、T1、T2分别为标准品和供试品每一剂量组内反应值的总和，相
当于表3-2-22中 ∑y(k)各项；下角标1、2分别代表低剂量与高剂量。
相关知识
三、数据处理
可靠性测验-剂间变异分析：将方差分析结果进行可靠性测验，见表 3-2-24。
相关知识
三、数据处理
可靠性测验-可靠性测验结果判断：回归项应非常显著 （Ｐ＜），偏离平行应不显著 （Ｐ＞）。试品
间项不作为可靠性测验的判断标准，试品间变异非常显著者，重复试验时，应参考所得结果重新估计供试品的效价
或重新调整剂量试验。
效价（PT）及可信限（FL）计算：
可信限 （FL）标志检定结果的精密度，
Ｒ与PT的可信限率 (FL%)是其可信限
的高限 与低限之差除以 ２倍效价均值
后的百分率。 按表 3-2-25计算各数值，
代入公式计算Ｒ、PT、标准误 SM 以
及Ｒ、PT的FL、FL％等。
相关知识
三、填写检验报告
检验报告应包括抗生素的品种、剂型、规格、标示量、生产厂商、批号、检验目的、检验依 据、检验
日期、温度、湿度、标准品与供试品的称量、稀释步骤与核对人、抑菌圈测量结果。
任务实施
一、制订工作计划
根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。
任务实施
二、试验前准备
按照表3-2-28进行试验前准备。
任务实施
三、试验操作
按照表3-2-29记录抑菌圈直径的测量与记录、培养物处理过程。
根据抑菌圈直径测量结果进行数据处理与结果判断，填写检验报告。
任务实施
三、试验操作
操作提示：
1. 双碟培养一定时间后，要及时测量抑菌圈直径，否则会影响抑菌圈直径的测量结果。
2. 测量抑菌圈前，应检查抑菌圈是否圆整，如有破圈、不圆整及其他异常情况，应舍弃该碟；
切忌主观挑选双碟或抑菌圈，以免造成测定结果的偏倚。应保证标准品及供试品溶液高剂量
组所形成的抑菌圈直径大于低剂量组。
3. 完成抑菌圈直径的测量后，要将不锈钢小管与双碟按要求消毒灭菌，以免污染环境。
4. 测定效价低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，应调整供试品的估计效价，重新
试验。
任务测评
根据表3-2-30所列任务评分标准进行测评，并做好记录。
《药品微生物检验技术
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谢 谢
