2007 NO．9
· 44· Serial No．174 China Brewing
米曲霉高产蛋白酶的工艺探
沙惠琴 ，张彩莉 ，赵长新 木
(1．大连工业大学，辽宁 大连 l16021；2．石家庄珍极酿造集团有限责任公司，河北 石家庄 051530)
摘 要：利用固体培养基、液体培养基进行米曲霉高产蛋白酶的工艺探索，经三角瓶纯种培养，添加微量元素、激活剂、植酸等，
使米曲霉产蛋 白酶活力得到提高。
关 键 词：米曲霉；蛋白酶：酶活力；培养基
中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：2054—0571(2007)09—0044--03
Technical exploration in protease production with high yield by A spergillus oryzae
SHA Hui—qin ，ZI-IANG Cai—li ，ZHAO Chang—xin
(1．Dalian UniversityofIndustry,Dalian 116021，China；2．ShijiazhuangZhenjiBrewGroup Co．。Ltd．．ShijiazhuangO5153O,China；)
Abstract：The solid or liquid mediums were used for the technical exploration in protease production with high yield by Aspergillus ory~e．By
pure—strain cultivation in Erlenmeyer flask，the activity of protease production by A．oryzae was improved with the addition of microelements,
activating agent，phytic acid and SO on．
Keywords：Aspergillusoryzae；protease；enzymatic activity；medium
米曲霉是一种好氧微生物，具有很强的蛋白质、糖
化淀粉的能力，米曲霉系对原料成分分解的能力取决于
这2类酶的活性。酱油酿造过程就是利用曲培养米曲
霉，使其大量繁殖，分泌多种酶，其中最主要的是蛋白
酶和淀粉酶。米曲霉沪酿3．042用固体培养基、液体培养
基进行培养，并添加微量元素、激活剂、植酸等，使米曲
霉产生蛋白酶的活力增高。
1材料与方法
1．1菌种
米曲霉沪酿3．042。
1．2培养基
米曲霉活化斜面培养基：酵母膏5g，硫酸铵0．5g，
硫酸镁0．5g，琼脂20g，蔗糖20g，磷酸二氢钾lg，溶于
1000mL水中，调节pH值为6．0左右，121oC灭菌20rain后
摆成斜面。
液体培养基：见表l。
固体斜面培养基：A豆汁制备：选择新鲜、无虫蛀大豆
500g，洗净加水2000 g，浸泡8h，在火上加热煮沸3h-4h，
用纱布将其过滤得滤汁，要求豆汁5 oB6。
B培养基制备：豆汁500mL，琼脂10g，可溶性淀粉
10g，10％KH2PO45mL，MgS04·7H20 0．5g，10％ (NIL)2 SO4
2．5mL，加热至琼脂溶解，然后分装试管。
固体纯种三角瓶培养基：麸皮：水=l：(0．95～1)。
l-3 添加 剂
微量元素：硫酸亚铁0．5g，氯化钠5g，钼酸钠0．5g，硫
酸铜0．1g，硫酸锌0．5g，硼酸0．5g。硫酸锰lg，加入1000mL
的去离子水中溶解(用1000 mL的容量瓶定容)待用。
激活剂：l号激活剂：6一BA(6_苄氨基嘌呤)；2号激活剂：
激动素；39激活剂：6-BA：玉米素：吸哚乙酸=6：3：1；4号激活
剂：6-BA：玉米素：吲哚乙酸=l：1：1；5号激活剂：玉米素；
6号激活剂：吲哚乙酸。激活剂单独或复配的使用浓度
5mg／kg以下。
维生素：VB：、VB6、VB。、烟酸按0．5％LL例配制。
1．4试验方法
蛋白酶活力的测定：依照ZBX 66030—87进行检测。
米曲霉活化：将刚灭菌好的固体斜面培养基30。角斜
面(每管5 mL)晾凉，划线接种，将接种后的固体斜面放入
恒温培养箱中培养，30 C培养48h，放于冰箱内保存待用。
三角瓶纯种培养方法(液体)：摇床培养(200r／min)。
离心操作：精确称取一定量的培养液，900Of／rain离
，t~,8min，弃上清液并擦干离心管残水，精确称出粗酶量。
1．5试验仪器及设备
收稿日期：2007．05．29
作者简介：沙惠琴 (1971．)，女，河北石家庄人，工程师；赵长新 ，教授，通讯作者。
创新与借鉴
高压蒸汽灭菌箱，离心机，YPW一1回转
摇瓶柜，DZKW-D水浴锅，PH酸度计，721
HH．B1 1型电热恒温培养箱，202A型恒温
天平，无菌工作台。
2工艺试验探索及结果分析
2．1三角瓶液体培养米曲霉及酶活力测定
4种液体培养基用氢氧化钠调pH6．0，然后放入高
压蒸汽灭菌锅进行高压灭菌，冷却、接种后，置于28℃、
50r／min的摇床中培养48h。每种培养基分别作2组平行
对照试样，培养基的成分、酶量和酶活力见表1。
表1液体培养基组成及米曲霉酶量
Table 1．Composition of liquid medium and protease
production of Aspergillus oryzae
g／mL
项 目 l号培养基 2号培养基 3号培养基 4号培养基
从表1可知，上述培养条件没有产生酶，原因可能
是由于摇床的转速太低，而米曲霉是一种好氧的微生
物，转速太低，氧气供应不足。另外培养基的成分不适
合，需要改进。
改变表1中2号培养基的成分，把蔗糖换为0．05g／mL
糊精，使摇床的转速提高~200dmin，每种培养基做2组
平行试样(试样序号分别为1、1’、2、2’、3、3’、4、4’)，重
新试验。
在培养过程中，2号瓶明显产生菌丝球，4号瓶产生
很大的菌丝球。在测酶活时，1号和1’号瓶中米 曲霉的
生长情况相近，所以混合测平均样，序号为1 1’，3号和
3’号瓶也是这样，序号为33’其他生长差异较大，所以
分别测定2号、2’号、4号、4’号瓶酶活，结果见表2。
从表2数据可知，产生菌丝球的三角瓶中酶活都很
低，说明产生菌丝球会影响米曲霉产生蛋白酶的量。3
号培养基对米曲霉产生蛋 白酶效果最佳，以后的液体
oryzae after medium modulation
2．2激活剂对液体培养基培养米曲霉的影响
在米曲霉生长的液体培养基中加入激活剂观察对
机体产生的影响。3号培养基 (蔗糖、豆粉、酵母膏、蛋白
胨、磷酸氢二钾、硫酸镁、微量元素)对于米曲霉的生长
比较适合，蛋白酶的活力也比较高，所以在3号液体培
养基中加入1号～6号激活剂，分别以0．5％和1％的浓度
加入到培养基中，以不加激活剂为空白，pH值调至6．0，
接种后放于摇床内，30℃、200r／min培养48h。
0．5％和1％的1号激活剂对应的样 品序号为1和
2，0．5％和1％2号激活剂对应的样品序号为3和4，以此类
推，空白样中不加入激活剂，其序号为13。测定酶活力，
结果见表3。
表3 加入激活剂后液体培养米曲霉酶活结果
Table 3．Activity of pmtease from Aspergillus oryzae in liquid
medium after the addition of activating agent
2007 N0．9
·46· Serial No．174
由表3可以看出，3号、49激活
的作用。用3号和4号激活剂对3号液体培养基再试验，
且3号培养基中补充微量元素见表4。其中3 、3m、3 、3、
3。分别代表3号激活剂的加入量分别为0．5％、1％、1．5％、
0n不加微量元素的情况，49激活剂的添加量同3号
激活剂。
表4 改变3号、4号激活剂液体培养米曲霉的结果
Table 4．Activity of protease frOm Aspergillus oryzae in liquid
medium after the change of No3 or Na4 activating agent
序号 微量元素／nlL激活剂／nlL oD值 (
g． 盖 。)酶活／(U· )
由表4可以看出，微量元素的加入对液体培养米曲
霉有一定的抑制作用；激活剂浓度较低时，作用效果较
好，有利于提高米曲霉产生的蛋白酶活力。现在减小激
活剂浓度 ，3号、4号激活剂浓度分别为0．1％、0．3％、
0．5％，以不加激活剂为空白。39激活剂对应的序号分
别为3 、3，、3 ；49激活剂对应的序号为41．43,．4s，空白样
的序号为“__J’。培养后测定酶活，结果见表5。
表5 改变3、4号激活剂浓度液体培养米曲霉结果
Table 5．Result of protease frOm Aspergillus oryzae in liquid
medium after the change of concentration No．3 or
No．4 activating agent
作用最好；但从各组酶活的数值来看，酶活单位都很低，
这与固体培养法相比相差较远。
2-3三角瓶纯种固体培养及蛋白酶活力测定
2．3．1三角瓶纯种固体培养
将接种后的三角瓶，麸皮量lOOg(约lcm厚)放入恒
温培养箱中(30±1)cc恒温培养，约16h菌丝生长，曲料
发白结块，摇瓶1次，继续培养5h左右，再次结块，2次摇
瓶，继续培养5h左右扣瓶，扣瓶之后培养至成熟。当培养
68h～72h时可以见到全部长满黄绿色孢子，即可使用。成
熟后的三角瓶菌种放入4cc冰箱备用。
2-3．2三角瓶纯种固体培养成曲蛋白酶活力测定
取2g培养好的成曲，用去离子水稀释100倍，再将
稀释100倍后的粗酶液继续稀释成250倍、500倍和2000
倍，按照福林．酚法测定蛋白酶活力。将稀释500倍的酶
液测得吸光度值，由相关公式计算得出酶活为3800U／g。
2．4加入微量元素对固体培养种曲产生蛋白酶的影响
有资料表明，加入微量元素对米 曲霉菌体的生长
有一定的促进作用田，可提高酶的活力。在培养基原料的
基础上再加入一定的微量元素，其中以不加入微量元素
为空白对照，观察其对米曲霉的影响，结果见表6。
表6 固体培养基加入微量元素后对米曲霉产蛋白酶的影响
Table 6．Activity of protease frOm Aspergillus oryzae in solid
medium after the addition of microelements
由表6可以看出，加入微量元素对米曲霉产生蛋白
酶并没有起到促进作用，而是相应地产生了抑制作用。
表7 固体培养基加入激活剂后对对半曲霉产蛋白酶的影响
Table 7．Activity of protease frOm Aspergillus oryzae in solid
medium after the addition of activating agent
从表5可以看出，3号激活剂和4号激活剂均对米曲
霉产生蛋白酶有促进作用I3号激活剂当浓度低时的促 2‘5加入激活剂对固体培养种曲产生孝妻
2OO
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3．1感官指标
外观：浅绿
口感风味
的香醇味及芦
3．2理化指标
酒精度4％～6％；pH 5～6；总含糖量约6％。
3-3微生物指标
菌落总数≤100个／mL；大肠菌群≤3~ff／lO0 mL；致
病菌：不得检出。
4结论与讨论
4．1结论
40％芦荟汁加糖调糖度至12。Bx，酵母菌接种量为
lO％，在27℃发酵5d可制得具有芦荟独特风味的酒精发
酵饮料。
4．2讨论
酵母菌经不同芦荟汁培养基驯化时，发现芦荟汁
浓度高于40％，酵母生长速度较缓慢，镜检观察菌体不
壮实，可能是芦荟汁含有的抗菌成分，对酵母菌生长有
一 定的抑制作用。因此，试验使用的芦荟汁<4O％进行
参考文献：
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(上接第46页)
在米曲霉的液体培养时，3号和4号激活剂对蛋白
酶产生较强影响。为此在三角瓶纯种培养基的基础上，
分别加入0．5％、l％、1．5％3号和4号激活剂，观察其产蛋
白酶的情况，结果见表7。
从表7可以看出，3号激活剂对米曲霉产生蛋白酶
的影响较大。其中l％浓度对其产生非常显著地影响。
表8 加入植酸对固体培养米曲霉产蛋白酶的影响
Table 8．Activity of protease fr0m Aspergillus oryzae in solid
medium after the addition of phytic acid
2．6植酸对固体培养米曲霉产生蛋白酶的影响
在固体培养基中加入一定量的植酸，观察其对米
曲霉产生蛋白酶的影响，结果见表8。
从表8可知，植酸的加入量在O．06～0．18％时，对米
曲霉产生蛋 白酶的作用效果较好，酶活为3700U／g-
3900U／g，其促进作用非常明显，表明添加植酸可以提
高蛋白酶的活力，提高发酵过程中曲料的利用率。
3小结
米曲霉沪酿3．042采用液体培养基时，3号培养基对
米曲霉产生蛋白酶效果最佳；3Y和4号激活剂均对米
曲霉产生蛋白酶有促进作用，3Y激活剂当浓度时的促
进作用明显；4号激活剂的浓度较高为0．5％时的促进作
用最好。但从各组酶活的数值来看，酶活单位都较低。当
采用固体培养基时，加入微量元素对米曲霉产生蛋白酶
并没有起到促进作用，而是相应地产生了抑制作用；试
验中3号激活剂浓度为0．5‰ 1．O％时，对米曲霉产生蛋白
酶的促进作用最为明显；当植酸的加入量为Q0 Ql8％时，
对米曲霉产生蛋白酶的作用效果较好。为今后的生产
实践提供了参考价值。
参考文献：
[1】姜锡端，段 钢．酶制剂实用技术手册[M】．北京：中国轻工出
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