167※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
响应曲面法优化小黄鱼ACE抑制肽的酶解条件
蔡丽丽，徐 鑫 *，刘国艳，何佳易，魏晓蕊，王之颖
(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)
摘 要：以小黄鱼为原料，利用酶解技术制备高活性的ACE抑制肽。通过单因素及响应曲面分析，确定胰蛋白
酶()的酶解工艺，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定酶解产物( pH值、
温度、时间、底物质量浓度、酶与底物比等因素对 A C E 抑制肽活性的影响。结果显示：最佳工艺条件为
、温度 50℃、时间 、底物质量浓度 9‰，酶解产物ACE抑制率达 %。
关键词：小黄鱼；胰蛋白酶；ACE抑制肽；响应曲面法；反相高效液相色谱(RP-HPLC)
Optimization of Hydrolysis Conditions for Preparation of Small Yellow Croaker-derived Angiotensin-I Converting
Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides Using Response Surface Methodology
CAI Li-li，XU Xin*，LIU Guo-yan，HE Jia-yi，WEI Xiao-rui，WANG Zhi-ying
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)
Abstract ：In this study, small yellow croaker meat was hydrolyzed by trypsin (PTN ) to prepare angiotensin-I converting
enzyme (ACE) inhibitory peptides with high activity. Using one-factor-at-a-time method and response surface analysis (RSA),
the optimal hydrolysis conditions for maximum ACE inhibitory rate of hydrolysates were determined as follows: pH , 50 ℃,
h hydrolysis time, g/100 mL substrate concentration, and 9‰ enzyme/substrate ratio. The ACE inhibitory rate of the
hydrolysate obtained under these conditions was determined by RP-HPLC to be %.
Key words：small yellow croaker；trypsin；ACE inhibitory peptides；response surface methodology；RP-HPLC
中图分类号：TS218 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)23-0167-05
收稿日期：2011-06-30
基金项目：江苏省科技型中小企业技术创新资金项目(BN2008207)；江苏省研究生科研创新计划资助项目(CXLX11-1017)
作者简介：蔡丽丽(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品资源开发与利用。E-mail：277242051@
*通信作者：徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为功能性食品资源开发与利用。E-mail：xuxin@
血管紧张素转化酶 ACE(angiotensin convert ing
enzyme，ACE)在血压调节过程中发挥了重要的生理作
用[1]，抑制其活性是实现降血压的有效方法。临床降压
药物大多为化学合成品，有不同程度的副作用[2]。以天
然蛋白为原料制得的 AC E 抑制肽，无毒副作用，安全
性高，是未来开发降血压药物的重要方向之一。据报
道，已在大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等天然蛋白的
酶解物中发现了多种 ACE抑制肽[3-10]。此外，很多研究
小组对罗非鱼、金枪鱼、沙丁鱼等鱼蛋白酶解液的ACE
抑制活性进行了不同程度的研究[11-13]。但是，以小黄鱼
鱼肉为原料制备 ACE 抑制肽还未见报道。
在已报道的ACE抑制活性体外评价方法中，Cushman
等[14]建立的紫外 -可见分光光度法是最常用的方法，但
是该方法中底物Hip-His-Leu及残留的溶剂乙酸乙酯在检
测波长 228nm处有较大吸收[15]，会导致分析结果偏高；
液质联用法 [ 1 6 ]分析成本较高，不便普及使用。本研究
在Wu等[15]报道的双梯度法HPLC-UV基础上，采用更简
便的单梯度洗脱，测定小黄鱼酶解物的 ACE抑制活性。
通过单因素及响应曲面试验优化酶解条件，以期为小黄
鱼的精深加工、扩展 A C E 抑制肽的蛋白源提供参考。
1 材料与方法
材料与试剂
小黄鱼 连云港墟沟农贸市场；胰蛋白酶
(× 104U/g) 丹麦诺维信公司。
马尿酰组氨酰亮氨酸醋酸盐(Hippuryl-His-Leu acetate
salt，HHL)、血管紧张素转化酶(angiotensin-I convert-
ing enzyme，ACE)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、马
尿酸(hippuric acid，HA) 美国 Sigma公司；水、甲醇
和三氟乙酸(TFA)均为 HPLC级。
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仪器与设备
524型恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦公司；旋转蒸
发仪、5804R高速离心机 德国Eppendorf公司；Delta320
pH计 梅特勒 -托利多仪器(上海)有限公司；Alphal-2 LD
Plus冷冻干燥机 德国 Christ公司；LC-20AT高效液相
色谱仪、SPD-20A UV-Vis紫外检测器 日本岛津公司。
方法
ACE抑制肽样品制备工艺
小黄鱼→去头、内脏→绞成肉泥→双蒸水溶解→加
酶→恒温酶解→灭酶(沸水浴 10min)→ 4℃、10000r/min离
心 30min→取上清→旋转蒸发浓缩→冷冻干燥→ACE抑
制肽样品冻干粉
酶解工艺条件的单因素试验设计
固定酶解温度 5 0℃、时间 8 h、底物质量浓度
3g/100mL(以小黄鱼蛋白作为底物)、、酶与底物比
1‰中的 4个因素，按照表 1设计改变其中一个因素，进
行单因素试验。
试验号
因素
温度/℃ 时间 /h 底物质量浓度 /(g/100mL) 酶与底物比/‰ p H
1 3 5 3 1 0. 1 6. 0
2 4 0 8 2 0. 2 6. 5
3 4 5 1 3 3 0. 4 7. 0
4 5 0 1 8 4 1 7. 5
5 5 5 2 3 5 2 8. 0
6 6 0 2 8 6 4 8. 5
7 6 5 3 3 7 1 0 9. 0
表 1 单因素试验设计表
Table 1 One-factor-at-a-time experimental designs
酶解工艺条件的响应曲面试验设计
水平
因素
A温度 /℃ B时间 /h C底物质量浓度 /(g/100mL) D酶与底物比/‰
－ 1 4 0 8 2 1
0 5 0 1 6 4 5. 5
+ 1 6 0 2 4 6 1 0
表 2 响应曲面试验设计表
Table 2 Coded values and corresponding actual values of the
optimization parameters used in responses surface analysis
取 10μL ACE溶液和 50μL
品混合，于 37℃水浴 5min，然后于同一温度条件下加
入 80μL的HHL溶液水浴反应 30min，最后在混合体系
中加入 200μL1mol/L HCl终止反应[17]，样品经 μm的
滤膜过滤后进样。
色谱条件：Intertsil ODS-SP柱(× 250mm，
5μm)；流动相[18]：50%甲醇(甲醇与超纯水体积比 1:1)，
其中包含 %三氟乙酸(TFA)；流速：1mL/min；检测
波长：2 2 8 n m；柱温：2 5℃ [ 1 9 ]；检测时间：2 0 m i n；
进样量：10μL；定量方法：外标法。
抑制率计算公式[20 ]如下：
Ac－As
抑制率 /%＝————× 100
Ac－Ab
式中：A c是 ACE 抑制剂不参加反应的条件下测得
的吸光度(空白样品组)；As是ACE及ACE抑制剂都存在
条件下测得的吸光度(样品组)；Ab是 ACE不参与反应的
条件下的吸光度(底物 HHL组)。
数据处理
响应曲面实验数据采用 Design Expert 软件绘图
并作方差和显著性分析等。
2 结果与分析
单因素酶解试验结果
酶解温度对ACE抑制率的影响
图 1 酶解温度对 ACE抑制活性的影响
Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory activity of
hydrolyzed small yellow croaker meat
84
80
76
72
68
抑
制
率
/%
温度 /℃
35 40 45 50 55 60 65
由图 1 可知，胰蛋白酶酶解小黄鱼制备 ACE 抑制
肽的最适酶解温度为 50℃左右，当温度低于 50℃时，随
着酶解温度的升高，酶促反应速率加快，产物 ACE 抑
制率也逐步上升；而当温度高于 50℃时，胰蛋白酶活性
减弱，产物的 AC E 抑制率也由此下降。据此，在相应
曲面试验设计中选择 50℃为中心温度。
酶解时间对ACE抑制率的影响
由图 2 可知，酶解产物的 ACE 抑制率随着酶解时
根据 Box-Behnken设计原理，以酶解产物的ACE抑
制率为响应值，选取温度、时间、底物质量浓度、酶
与底物比为影响因素，进行四因素三水平分析，共 2 9
个试验点，其中 5 个为中心点。
ACE抑制活性的测定
将HHL和ACE分别溶于 的HEPES缓冲液。
169※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
间的延长，呈现先上升后下降的趋势，在 0～18h 内上
升趋势比较明显，18h后抑制率开始下降。这一结果与
Mullally等[21]报道的结果相类似，在最初的酶解阶段，
ACE抑制活性能够被逐步释放出来，但是长时间的酶解
会使ACE抑制肽水解成氨基酸，由此减弱了产物的ACE
抑制活性。据此，在相应曲面试验设计中选择 16h为中
心酶解时间。
图 2 酶解时间对 ACE抑制活性的影响
Effect of hydrolysis time on ACE inhibitory activity of hydro-
lyzed small yellow croaker meat
84
82
80
78
76
74
72
70
抑
制
率
/%
时间 /h
0 5 10 15 20 25 30 35
底物质量浓度对ACE抑制率的影响
图 3 底物质量浓度对 ACE抑制活性的影响
Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of
hydrolyzed small yellow croaker meat
84
83
82
81
80
79
78
77
76
抑
制
率
/%
底物质量浓度 /(g/100mL)
1 2 3 4 5 6 7
由图 3 可知，底物质量浓度在 1～3g/100mL范围
内，A C E 抑制率随着底物质量浓度的增加而上升，底
物质量浓度大于 3g/100mL时，抑制率下降。当底物质
量浓度较小时，反应底物与胰蛋白酶的结合浓度相对较
低，不利于酶解反应的快速进行，导致产物 ACE 抑制
活性不高，当底物质量浓度比较高时，酶解体系比较
黏稠，使得酶与底物结合的几率降低，产物对 ACE 抑
制率下降 [ 2 2 ]。
酶与底物比对 ACE抑制率的影响
由图 4可知，酶与底物比也是影响酶解产物ACE抑
制率的重要因素之一，随着酶添加量的增加，A C E 抑
制率上升，之后趋于平缓。出现这种趋势的原因可能
是酶量较少时，底物不能完全与酶结合，产生具有ACE
抑制活性的产物较少，故 AC E 抑制率不高；随着酶量
的增加，产生的抑制肽增加，抑制率上升；到达一定
程度时，底物完全与酶结合，继续添加酶，作用不明
显，所以抑制率趋于平缓。所以，酶与底物比为 4‰，
A C E 抑制率最高。
图 4 酶与底物比对 ACE抑制活性的影响
Effect of enzyme/substrate ratio on ACE inhibitory activity of
hydrolyzed small yellow croaker meat
85
81
77
73
69
65
抑
制
率
/%
酶与底物比 /‰
0 2 4 6 8 10
pH值对ACE抑制率的影响
由图 5可知，pH值在 ～范围内小黄鱼酶解液
上清冻干粉对 AC E 抑制率影响效果不显著，综合考虑
后，在响应曲面设计中，选择 为最佳 pH值，不
考虑 pH 值的变化对酶解产物 ACE抑制率的影响。
响应曲面法优化酶解条件结果
响应曲面试验结果
响应曲面法的试验设计及结果见表 3。Design
软件分析ACE抑制活性回归模型的显著性，方差分析见表
4。结果显示：模型的F值为 ，P＜ ，表明该
回归模型极显著。失拟项的 P 值为 ，说明失拟项
不显著，该模型有较好的拟合度。根据回归系数，可得二次
多项回归方程：Y＝ ＋ ＋ ＋
＋ － ＋ －
－＋－－
－ － ，其中 R2＝ 。
图 5 pH值对 ACE抑制活性的影响
Effect of pH on ACE inhibitory activity of hydrolyzed small
yellow croaker meat
95
90
85
80
75
70
抑
制
率
/%
pH
2011, Vol. 32, No. 23 食品科学 ※生物工程170
响应曲面分析与条件优化
试验号
A温 B时 C底物质量浓度 / D酶与底 Y ACE
度 /℃ 间 /h (g/100mL) 物比 /‰ 抑制率 /%
1 50 24 4 1
2 60 16 4 1
3 60 16 4 10
4 60 16 6
5 50 16 6 10
6 40 16 4 1
7 40 16 2
8 50 16 2 1
9 50 16 4
10 60 24 4
11 50 8 4 1
12 60 16 2
13 50 8 6
14 60 8 4
15 50 16 4
16 40 8 4
17 50 16 4
18 50 8 4 10
19 50 24 2
20 50 16 6 1
21 50 16 4
22 40 16 6
23 50 24 4 10
24 50 24 6
25 40 16 4 10
26 40 24 4
27 50 16 4
28 50 16 2 10
29 50 8 2
表 3 响应曲面法优化酶解条件的试验设计与结果
Table 3 Experimental design and results for responses surface
analysis
图 6列出了各因素间交互作用的响应曲面图(AB项
不显著，被剔除)，A C、B C、B D 项响应曲面弯曲程
度相近，在此以 A C 项为代表，如图 6 a 所示。由曲面
的弯曲程度和等高线可以看出，响应值的变化相当复
杂，各个具体的试验因素对响应值的影响不是简单的线
性关系，而是二次关系。
模型优化的最佳酶解条件为：温度 5 0 . 0 9℃、时
间 、底物质量浓度
‰，用胰蛋白酶在体系为 时酶解小黄鱼，多
肽产物 ACE抑制率为 %。
采用优化的条件对小黄鱼进行验证实验，为方便操
作，条件设为温度 5 0℃、时间 1 6 . 5 h、底物质量浓度
9‰、，结果发现，这
一条件下得到多肽的 ACE抑制率为 %，与模型估
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 13 ＜
A温度 1
B时间 1 ＜
C底物质量浓度 1 ＜
D酶与底物比 1 ＜
AC 1 ＜
AD 1 ＜
BC 1
BD 1 ＜
CD 1 ＜
A2 1 ＜
B2 1 ＜
C2 1 ＜
D2 1 ＜
剩余项 15
失拟项 11
误差 4
总和 28
表 4 方差分析表
Table 4 Variance analysis for ACE inhibitory activity of hydrolyzed
small yellow croaker meat
86
82
78
74
70
抑
制
率
/%
C底物质量浓度 /
(g/100mL)
6
5
4
3
2
60
55
50
45
40
A温
度 /℃
87
82
77
72
67
抑
制
率
/%
D酶与底物比 /‰
60
55
50
45
40
A温
度 /℃
图 6 各因素交互影响 ACE 抑制活性的响应曲面和等高线图
Response surface and contour plots for the interactive effects of
four hydrolysis conditions on ACE inhibitory activity of hydrolyzed
small yellow croaker meat
抑
制
率
/%
D酶与底物比 /‰
6
5
4
3
2
C底
物质
量浓
度 /
(g/1
00m
L)
171※生物工程 食品科学 2011, Vol. 32, No. 23
计值 %相比，相对误差为 %，说明采用响应
曲面法优化得到的酶解工艺条件参数准确可靠，利用本
实验建立的模型在实践中进行预测是可行的。
3 结 论
胰蛋白酶酶解小黄鱼制备 ACE 抑制肽的最优工艺
为：的体系下，温度 50℃、时间 、底物质
量浓度 9‰、。此时，
获得的多肽 ACE抑制率最高，达 %。验证实验表
明此模型具有较好的预测能力。研究成果对于拓展ACE
抑制肽的天然蛋白来源和开发小黄鱼源降压功能性食品
具有重要的理论价值和广阔的应用前景。
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