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比较两种方法提取黑豆皮花青素、总酚、总
黄酮清除#
程伟伟，郭善广，蒋爱民，黄航兴**
基金项目：博士学科点专项科研基金项目(编号:20114404110013)
作者简介：程伟伟（1991-），男，博士生，畜产食品加工与安全控制
通信联系人：蒋爱民（1957-），男，教授，畜产食品加工与安全控制. E-mail: 1501749965@
（华南农业大学食品学院，广州 510000） 5
摘要：探本文通过黑豆皮的干性分离法和湿性分离法两种不同的提取方法，测定黑豆皮提取
液清除 DPPH自由基的能力差异，研究不同的抗氧化物质在黑豆皮提取液清除 DPPH 自由基试
验中发挥的作用。根据实验结果，黑豆皮提取液对 DPPH 自由基的清除能力与其浓度具有明
显的线性关系，黑豆皮干性分离法最后测出花青素、总多酚、总黄酮含量分别为
为
高于湿性分离法提取液中各类抗氧化物质的含量，但等量的各类的抗氧化物质湿性分离法提
取液清除 DPPH 自由基能力要高于干性分离法提取液。。
关键词：黑豆；清除率；花色苷； 15
中图分类号：
Study on black bean anthocyanin clean DPPH free radical of
two extraction methods
CHENG Weiwei, GUO Shanguang, JIANG Aimin, HUANG Hangxing 20
(Food college，South China Agriture University，Guangzhou 510000)
Abstract: The separation of two different extraction methods by dry and wet separation of
Blackbean, determination of Pnaseolus extraction ability difference of liquid DPPH free radical
liquid antioxidant DPPH radical scavenging function test in black bean peel
extract. According to the experimental results, black bean peel extract DPPH radical scavenging 25
activity and concentration has a significant linear relationship between total polyphenol,
Blackbean dry separation method finally measured, anthocyanins, total flavonoids content were
mg•g-1, mg•g-1, mg•g-1, Blackbean wet separation was the final
measurement of anthocyanins, total polyphenols, total flavonoids content of mg•g-1,
mg•g-1, mg•g-1, extraction and separation of wet and dry separation of antioxidants than the 30
content of the higher the extraction of antioxidants in a variety of content, DPPH radical
scavenging capacity but the wet extraction separation method of antioxidants equivalent to, the
extraction is higher than that of dry separation method.
Key words: black bean;clearance rate；anthocyanins
35
0 引言
现代科学研究表明，自由基在人体的衰老和肿瘤的发病过程中起着非常重要的作用，尤
其是羟自由基和超氧阴离子与心血管疾病、癌症、高血压、炎症的休克等都有密切的关系[1]。
机体抗氧化酶的活性降低和过多自由基的生成，致使人体内积蓄了大量的氧自由基，活性氧
自由基的平衡被打破，从而过量地损伤细胞，进而危害人类的健康。黑豆皮提取物含有丰富40
的各种抗氧化物质，具有清除各种自由基，抑制脂肪氧合酶活力和抑制脂质过氧化链式反应
等抗氧化功效，能在一定程度上消除机体内多种生理功能障碍，延缓机体衰老，减少各种老
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年性疾病发生。因此，从黑豆皮中研究并开发高效低毒性的、能够保护人类机体免受过量自
由基损害的药物或者保健品，成为人们关注的热点。
长期以来对黑豆皮评价的研究主要集中于粗提取物的生理功能，但对其生理活性物质方45
面的研究比较少，大量文献指出黑豆皮中含有黄酮、多酚等多种生理活性物质，但对这些物
质进行定量分析的比较少，难以全面体现黑豆皮的抗氧化性与多酚、黄酮和花青素含量内在
关系。本研究从黑豆皮与豆肉不同的分离方法入手，因不同的分离方法引起黑豆皮中生理活
性物质的提取效率不同，导致其抗氧化活性也不同，从而研究黑豆皮的抗氧化性与活性物质
含量之间的内在关系。 50
1 材料与方法
材料
原料
黑豆：由阳江阳帆豆豉厂惠赠，分包真空包装-18℃以下保存；
主要试剂 55
一水合没食子酸 分析纯 广州化学试剂厂
芦丁标准样 分析纯 广州化学试剂厂
亚硝酸钠 分析纯 广州化学试剂厂
DPPH 试剂 分析纯 东京化成工业株式会社
硝酸铝 分析纯 广州化学试剂厂 60
氢氧化钠 分析纯 广州化学试剂厂
主要仪器
冷冻高速离心机 5804R 德国艾本德仪器公司
PL203 型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司
UV-1800 紫外可见分光光度计 岛津仪器有限公司 65
40 目筛 浙江飞达金属砂筛厂
方法
黑豆皮与黑豆肉的干性分离法
称取适量的黑豆清理干净，放入干燥箱中烘干，使水分减少，表皮变得酥脆易于剥开，以
提高人工剥皮的效率，并且也有利于下一阶段将黑豆皮打碎的进行。将剥开的黑豆皮用打浆70
机充分打碎，用 40 目筛获得粉碎程度足够的碎黑豆皮，确保黑豆皮足够粉碎是为了在下一
阶段的提取过程中保证黑豆皮与提取液之间的充分接触，提高提取效率。取 4g 干燥的黑豆
皮用浸提液进行浸提。
黑豆皮与黑豆肉的湿性分离法
称取适量的黑豆清理干净，置于 200mL 蒸馏水中浸泡 24h，使豆皮充分吸水，目的是降75
低人工为黑豆剥皮的难度，提高人工剥皮效率。浸泡 24h 后，将黑豆与浸泡液分离，再采用
人手工分离豆肉豆皮。这时豆皮豆肉已分离，但豆皮仍是湿的，为保证两种分离方法的一致
性，将湿豆皮置于干燥箱中干燥 12h，将干燥后的豆皮放入打浆机内打碎，取 4g 干燥并打
碎后的黑豆皮作为浸提原料。
浸提液的配制 80
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根据徐亚维等对黑豆皮原花青素提取工艺优化的研究[2]，乙醇浓度控制在 60％，添加料液
比量为 1：25 时，浸提液对黑豆皮花青素的提取效率最高，所以本研究按乙醇浓度 60%，
pH=3 配制浸提液。使用时以 1：25 的料液比使用。
干性、湿性分离法的浸提
分别精确称取干性、湿性分离法处理的黑豆皮粉末 ，按照 1：25 的料液比加入浸提85
液，在 50℃的水浴环境下浸提 3 次，每次浸提 1h。将 3 次浸提液集中后，放入真空旋转蒸
发仪中进行蒸馏浓缩，最后定容至 100mL。
pH 示差法测定花青素总含量
在待测样品溶液中准确量取定量溶液 2 份（干性取 mL，湿性取 ），分别用
的 HAc-NaAc（ mol/L KCl）缓冲溶液与 的缓冲溶液定容至 mL，定容后90
溶液避光密封放置 90 min，待稳定后分别在 530nm 和 700nm 测定溶液的吸光值[3,4]。
采用 pH 示差法对花青素进行定量分析，选取 pH( 和 )进行吸光值的测量，结合比尔
定律公式 A=ε bc，得经验计算公式如下：
1000TVFM
X
m
式中： X——黑豆皮花青素含量，mg/g； 95
△T——（530nm）缓冲液和 （700nm）缓冲液吸光值差
V——样品定容体积，L
F——测定稀释倍数
M——矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，；
ε ——为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，29600； 100
m——浸提样品质量，g
总酚含量的测定
没食子酸标准曲线的绘制：在 765nm 波长下测定系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，
得到回归方程 y = ，R2 = 。样品中的总酚以没食子酸的含量表示，单位为
mg• g-1。 105
样品总酚含量的测定：精确吸取干性分离法样品 1mL，移至 100mL 容量瓶中定容，则待
测溶液为原样品溶液稀释 100 倍；精确吸取湿性分离法溶液 ，移至 100mL 容量瓶中
定容，则待测溶液为原样品溶液稀释 25 倍。分别从两个容量瓶中吸取 待测液加入试
管中，其他步骤同标准溶液测定方法，根据标准曲线求得其浓度，并计算出总酚含量。
总黄酮含量的测定 110
采用硝酸铝—亚硝酸钠比色法。
芦丁标准曲线的绘制：以芦丁为标准品绘制标准曲线，在 510nm 波长处测定吸光度，绘
制标准曲线，求得回归方程为 y = ，R2 =。样品溶液总黄酮含量的测定：
根据标准曲线求得其浓度，并计算出总黄酮含量。
清除 DPPH 自由基能力 115
样品的前处理：取一定量打碎后的样品粉末，加蒸馏水配成一定的相同浓度，高速匀浆机
匀浆，抽滤后待用。
分别取 0mL， mL， mL， mL，1 mL， mL，2 mL，3 mL，4 mL 样品溶液加
入 4mL DPPH 溶液，最后用蒸馏水补足至 8mL，于 25℃水浴中放置 15min 后，
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在 517nm 测得试样吸光度（Ai），取 2mL 蒸馏水代替样品测得空白吸光度（A0），以 2mL120
样品中加入 2mL 蒸馏水测得样品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每个样品质量浓度做三个
平行，取平均值，按下列公式计算清除率。
清除率（%）=[ A0－（Ai－Aj）]/ A0×100%
数据分析
采用 Microsoft Excel 及 SPSS 等相关方法进行数据处理和分析。 125
2 结果与分析
不同的分离方法导致的花青素含量差异
表 1 干性分离法处理后豆皮中花青素的含量
Effect of dry separation of content of anthocyanin
样品序号 A
（pH=）
A
（pH=）
ΔT 花青素总含量
/mg·g
-1
平 均 值
/mg·g
-1
1
2
3
130
表 2 湿性分离法处理后豆皮中花青素的含量
Effect of wet separation of content of anthocyanin
样品序号 A
（pH=）
A
（pH=）
ΔT 花青素总含量
/mg·g
-1
平 均 值
/mg·g
-1
1
2
3
由表 1 和表 2 可以看出，干性分离法的提取液中花青素的含量远高于湿性分离法提取液中
的花青素含量，干性分离法提取液的花青素含量约为湿性分离法提取液中花青素含量的 14135
倍，这是因为花青素是一种易溶于水、乙醇的物质[5]，在湿性分离法中，用水浸泡黑豆皮时，
相当一部分的花青素溶于水中流失，并且在水中浸泡越久，流失就越严重。
不同方法对样品中总酚含量的影响
表 3 干性分离法处理后豆皮中总酚的含量 140
Effect of dry separation of content of total phenols
样品序号 A 总酚浓度/mg·L-1 总酚含量/mg·g-1 平均值/mg·g-1
1
2
3
表 4 湿性分离法处理后豆皮中总酚的含量
Effect of wet separation of content of total phenols
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样品序号 A 总酚浓度/mg·L-1 总酚含量/mg·g-1 平均值/mg·g-1
1
2
3
145
从表 3 和表 4 可以看出，干性分离法处理后豆皮中总酚的含量为 • g-1 黑豆皮，
而湿性分离法处理后豆皮中总酚的含量为 mg• g-1 黑豆皮，干性分离法处理后豆皮
中总酚的含量远高于湿性分离法处理后豆皮中总酚的含量，从数量来看，干性分离法处理后
提取液中总酚的含量是湿性分离法处理后提取液中总酚的含量的 倍。原因可能是因为
总酚是一大类物质，其中有些物质如花青素易溶于水，但也有许多其他物质不溶或难溶于水，150
因此两种处理方法得到提取液中总酚的含量虽然也有不小的差距，但不会像花青素那样用两
种处理方法得到的含量差异巨大。干性分离法处理后豆皮中总酚的含量与湿性分离法处理后
豆皮中总酚的含量相差 倍。
不同方法对样品中总黄酮含量的影响
表 5 干性分离法处理后豆皮中总黄酮的含量 155
Effect of dry separation of content of total flavonoids
样品序号 A 总黄酮浓度/mg·mL-1 总黄酮含量/mg·g-1 平均值/mg·g-1
1
2 120
3
表 6 湿性分离法处理后豆皮中总黄酮的含量
Effect of wet separation of content of total flavonoids
样品序号 A 总黄酮浓度/mg·mL-1 总黄酮含量/mg·g-1 平均值/mg·g-1
1
2
3
160
由表 5 和表 6 可以看出，干性分离法处理后豆皮中总黄酮的含量为 • g-1 黑豆
皮，而湿性分离法处理后豆皮中总黄酮的含量为 mg• g-1 黑豆皮，从数量来看，干性
分离法处理后豆皮中总黄酮的含量是湿性分离法处理后豆皮中总黄酮的含量的 倍。原
因与总多酚类似，总黄酮作为一大类物质其中不同的物质有不一样的理化性质，水溶性各不
相同。 165
不同提取方法提取的黑豆皮提取液的清除 DPPH 自由基能力
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图 1黑豆皮提取液清除 DPPH 自由基回归线
Blackbeans hull Scavenging DPPH radical ability
170
由图 1 可以看出，干性分离法提取液清除 DPPH 自由基时，回归方程为
y=,R2=；湿性分离法提取液清除同一浓度的 DPPH 自由基时，回归方程为
y=，,R2=。由回归方程可以算出，干性分离法提取液和湿性分离法提取液
对 DPPH 自由基清除的 IC50 分别为 和 。从数值上看，干性分离
法提取液清除 DPPH 自由基能力约为干性分离法提取液清除 DPPH 自由基能力的 倍。 175
干性分离法提取液清除 DPPH 自由基能力强于湿性分离法提取液的原因是干性分离法对黑
豆皮中抗氧化性物质的提取效率比较高，因为比起湿性分离法少了一个水浸泡的环节，所以
干性分离法中黑豆皮的抗氧化性物质流失比较少，最终通过乙醇提取液提取出来的的抗氧化
性物质含量比较多，从以上的图表和数据可以看出干性分离法中黑豆皮的花青素、总多酚、
总黄酮的含量分别为湿性分离法的 14 倍， 倍， 倍，除含量较少的花青素外，总多180
酚和总黄酮含量的变化趋势与两种提取方法的提取液清除 DPPH 自由基能力的变化趋势比
较接近。
不同提取方法样品液中的花色苷、多酚、黄酮清除 DPPH 自由基的效率比较
图 2 干性提取法中各种物质清除 DPPH自由基能力 185
Dry extraction of various substances scavenging DPPH radical ability
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图 3 湿性提取法中各种物质清除 DPPH自由基能力
Wet extraction of various substances scavenging DPPH radical ability 190
由图 2 可以得出，黑豆皮干性分离法提取液中花色苷、总多酚、总黄酮的回归方程分别为
y=,R2=、y=, ,R2=、y=，R2=，可以
算出花色苷、总多酚、总黄酮的 IC50 分别为
由图 3 可以得出，黑豆皮湿性分离法提取液中花色苷、总多酚、总黄酮的回归方程分别为195
y=,R2=、y=, ,R2=、y=，R2=，花色苷、
总多酚、总黄酮的 IC50 分别为
综合图 2、图 3 及相关数据可以看出，相同的 DPPH 自由基清除率下，干性分离法和湿性
分离法的提取液中花色苷、总黄酮、总酚的浓度并不相同，可以发现，湿性分离法的提取液
中花色苷、总黄酮、总多酚的浓度之和低于干性分离法的提取液中花色苷、总黄酮、总酚的200
浓度之和，去除实验误差等原因后可以说明，用湿性分离法提取的黑豆皮提取液中的花色苷、
总黄酮、总多酚等抗氧化物质清除 DPPH 自由基的效率要高于等量的用干性分离法提取的黑
豆皮提取液中的花色苷、总黄酮、总多酚等抗氧化物质，即湿性分离法提取的黑豆皮提取液
中的花色苷、总黄酮、总多酚等抗氧化物质的抗氧化评价高于干性分离法提取的黑豆皮提取
液。原因是湿性分离法的提取液中所含的抗氧化性物质大部分是脂溶性抗氧物质，水溶性抗205
氧化物质多溶于水流失，而干性分离法的提取液中所含的脂溶性抗氧化性物质与水溶性抗氧
化物质的比例并没有受到太大的影响，而抗氧化因子的抗氧化强度与低极性提取溶剂有关，
以甲醇或乙醇等有机溶剂提取时，脂溶性抗氧化因子的作用最强[6]，因此，在采用有机溶剂
提取法提取抗氧化物的本实验中，脂溶性抗氧化物含量较高的湿性分离法提取液中的抗氧化
物清除 DPPH 自由基效率要高于干性分离法提取液中的抗氧化物。 210
3 结论
本实验以干性分离法和湿性分离法分离黑豆的豆肉与豆皮，采用 40℃水浴，pH=、60%
盐酸乙醇浸提液对黑豆进行提取，测定黑豆皮中的花青素含量、总酚含量以及总黄酮含量，
并测定其清除 DPPH 自由基的能力并比较分析。综合数据和分析可知，酮含量分别为 mg
• g-1、 mg• g-1 、 mg• g-1，而湿性分离法处理后豆皮中花青素、总酚、215
总黄酮含量分别为 mg• g-1、 mg• g-1 、 mg• g-1，两者花青素、总
酚、总黄酮含量与 DPPH自由基清除能力变化比例为 14：：：，从数值上可以
看出花青素由于含量太低，在黑豆皮对 DPPH 自由基清除能力上作用不明显，总酚、总黄酮
含量变化情况与 DPPH 自由基清除能力变化程度相近，且含量较大，可初步判断在清除 DPPH
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自由基中发挥较大的作用。从花色苷、总黄酮、总多酚几种物质的绝对含量之和的比较可以220
看出，干性分离法约为湿性分离法的 倍；在相同的 DPPH 自由基清除率条件下，湿性
分离法提取液中的花色苷、总多酚、总黄酮含量比干性分离法提取液中的花色苷、总多酚、
总黄酮含量少，这说明湿性分离法提取液中的花色苷、总多酚、总黄酮等抗氧化物质清除
DPPH 自由基的效率比较高，湿性分离法中这几种物质的抗氧化评价比较高，以 IC50 计算干
性分离法提取的黑豆皮提取液中花色苷、总黄酮、总多酚几种物质的抗氧化评价，湿性分离225
法约为干性分离法的 倍。
由于干性分离法与湿性分离法抗氧化物绝对含量之比为 ，而湿性分离法与干性分
离法抗氧化评价之比仅为 ，远低于 的含量之比，因此干性分离法的抗氧化能力
仍远强于湿性分离法提取液，结合等体积干性分离法与湿性分离法提取液清除 DPPH 自由基
能力相差 倍，事实证明干性分离法要优于湿性分离法。 230
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