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降解组测序鉴定植物胁迫相关 miRNA 靶
基因的研究进展#
陈敏，陈慧，包海，王延伟**
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20110014120004）; 国家自然科学基金青年基金（31200511）
作者简介：陈敏 （1992-）, 女, 硕士研究生, 主要研究方向: 植物抗性分子机制
通信联系人：王延伟 （1979-）, 男, 副教授, 主要研究方向: 林木抗逆遗传及育种
（北京林业大学林木育种国家工程实验室，林木花卉遗传育种教育部重点实验室，国家林业5
局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室，北京 100083）
摘要：miRNA 是一类内源性的非编码小分子 RNA，通过介导靶 mRNA 的切割或翻译抑制
从而在植物生长、发育及适应多种逆境过程中发挥着重要的调控作用。最近，降解组测序已
经发展成为一种大规模实验鉴定 miRNA 对靶基因切割的有效方法，能全面、有效地检测10
miRNA::mRNA 配对切割并可高通量验证靶基因的存在。目前，研究者已成功地鉴定了拟南
芥、水稻、杨树和其它多种植物在逆境胁迫下 miRNA 的靶基因及其降解模式。本文简述了
降解组测序的原理、分析方法及其在植物逆境胁迫相关 miRNA 靶基因鉴定中的应用和进展，
并提出了展望，以期为深入理解 miRNA 遗传网络的分子机制及其在植物抗逆中的重要作用
提供一定的参考。 15
关键词：林木遗传育种；miRNA；降解组测序；逆境胁迫；靶基因
中图分类号：Q75
Advance in the identification and characterization of the
target genes of stress-responsive miRNAs in plants using 20
degradome sequencing
CHEN Min, CHEN Hui, BAO Hai, WANG Yanwei
(National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Key Laboratory of Genetics and Breeding in
Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education, Tree and Ornamental Plant
Breeding and Biotechnology Laboratory of State Forestry Administration, Bejing Forestry 25
University, Beijing 100083)
Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenous non-coding small RNAs that regulate
the post-transcriptional gene expression by miRNA-mediated target mRNA cleavage or
translational repression when partial or complete complementary to target mRNAs. Specifically,
miRNAs and their target genes play significant roles in plant growth, development, resistance and 30
adaptation to various biotic or abiotic stresses. Recently, degradome sequencing, a
high-throughput sequencing method, is developed to globally identify cleaved mRNA fragments.
Though high-throughput sequencing system, degradome sequencing becomes a comprehensive
and efficient approach to detect miRNA: :mRNA pairs and to validate target mRNAs. Using
degradome sequencing, the mRNA targets and patterns of mRNA cleavage had been successfully 35
detected and validated in Arabidopsis, Oryza sativa, Populus, and other plant species under stress
conditions. In this study, the principle and the protocols of degradome sequencing, the application
and advance in the identification and annotation of target genes of stress-responsive miRNAs in
plants were briefly reviewed in order to provide some help for understanding the molecular
mechanism of miRNA networks and the important regulatory roles of miRNAs of plants in 40
response to biotic or abiotic stresses.
Key words: Forest Genetics and Tree Breeding; miRNA; Degradome Sequencing; Stress; Target
Gene
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0 引言
逆境胁迫是影响植物生长、发育、产量和品质等的一种重要因素。逆境胁迫通常分为生45
物胁迫和非生物胁迫，生物胁迫主要包括病毒、病菌和害虫等的侵染；非生物胁迫主要包括
营养、干旱、水分、重金属、盐、高温、低温、机械和辐射胁迫等。大量研究表明，植物可
以对不同种类、不同程度的胁迫做出响应，通过调控相关基因的表达，进而改变体内相应的
代谢和生理状态以适应逆境。在植物感受各种生物胁迫和非生物胁迫，并产生适应性机制的
过程中，不同种类的 miRNA 及其调控的靶基因发挥了重要作用。新近利用降解组测序和小50
RNA 测序，研究者可以高通量地检测植物 miRNA 及其切割的靶基因，进而探索靶基因下游
的相关基因在生物学通路中的调控作用，有助于深入了解 miRNA 在植物逆境胁迫过程中发
挥的重要作用[1]。截至 2015 年，研究者已对 30 多个物种进行了降解组测序，包括一些模式
植物、农作物、树木和药用植物等，如拟南芥、水稻、大豆、棉花、玉米、萝卜、毛果杨、
台湾蝴蝶兰、二球悬铃木和茶树等[2-18] (表 1)。通过降解组测序和小 RNA 测序的联合应用，55
研究者不仅系统鉴定了多个植物中 miRNA 调控的靶基因 (表 2)，还发现了多种 miRNA 及
其靶基因对植物不同胁迫处理的差异性表达，证实了某些 miRNA 的靶基因在植物感受并适
应逆境胁迫过程中的重要作用，为深入研究 miRNA 的分子调控机制提供了丰富的信息，有
利于更加深入地阐明植物耐胁迫的分子机理，也为提高植物胁迫耐受性和培育优良品种奠定
了基础。 60
表 1 降解组测序用于植物抗逆性研究
Tab. 1 Application of degradome sequencing in the investigations of plant stress responses
物种 胁迫因子 参考文献
台湾蝴蝶兰 Phalaenopsis aphrodite 低温 [2]
西红柿 Lycopersicon esculentum 低温，病毒 [3]
大豆 Glycine max 镉、低磷、铝 [4]
大麦 Hordeum vulgare 高温 [5]
胡杨 Populus euphratica 高盐 [6]
地黄 Rehmannia glutinosa 病害 [7]
玉米 Zea mays 低氮 [8]
二球悬铃木 Platanus acerifolia 铅 [9]
萝卜Raphanus sativus 镉 [10]
棉花 Gossypium hirsutum 干旱、盐 [11]
蒺藜苜蓿 Medicago truncatula 重金属 [12]
茶树 Camellia sinensis 低温 [13]
毛果杨 Populus trichocarpa 干旱 [14]
毛白杨 Populus tomentosa 低氮 [15]
水稻 Oryza sativa 高盐、干旱、低温 [16]
拟南芥 Arabidopsis thaliana 低氮、低磷、低温、干旱 [17, 18]
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表 2 逆境胁迫相关 miRNA 及其靶基因 65
Tab. 2 Stress-responsive miRNAs and their target genes
miRNA 靶基因 相关逆境
156 SBP/SPL transcription factors 低磷
157 SBP/SPL transcription factors 低磷
159 MYB, TCP transcription factors 低氮、真菌
160 Auxin response factors (ARFs) 高温、干旱、水涝
164 NAC transcription factors 病菌
167 Auxin response factors (ARFs) 干旱、高温、低温
169 HAP2 transcription factors 干旱、低氮、高温
172 AP2 transcription factors 低氮、干旱
319 MYB, TCP transcription factors 低温、干旱、水涝
395 ATP sulfurylase, sulfate transporter 低硫、低磷
398 Copper/zinc superoxide dismutase, cytochrome c oxidase
subunit V 铜锌超氧化物歧化酶 1、2，细胞色素 c 氧化酶 V
亚基
氧化、低铜
399 Ubiquitin conjugase E2/UBC24 低磷
827 Ubiquitin E3 ligase NLA
SPX-MFS1, SPX-MFS2
低磷
2111 F-box protein 低磷
1 miRNA 的简介
微小 RNA (microRNA，简称 miRNA)是一类长度~21 个核苷酸的非编码小分子 RNA
(noncoding small RNA)，能在转录后水平高效调控多个靶基因的表达。1993 年, Lee 等在秀70
丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了第一个 miRNA lin-4，Ruvkun 等进一步发现第
二个 miRNA let-7 参与线虫发育的时序调控[19], 由于它们长度很短，作用时间又短暂，所以
一开始称之为 stRNA (small temporal RNA)。在 2001 年，术语 miRNA (microRNA)被正式命
名，指内源性的非编码小分子 RNA[20]。
通常，miRNA 基因首先由 RNA 聚合酶 II 转录产生包含数百个核苷酸的初级转录物75
(primary miRNA，pri-miRNA)，能折叠成二级茎环(stem-loops)结构。之后，pri-miRNA 在细
胞核中由类似于 Dicer 的酶(DCL-1)切割产生前体 miRNA (precursor miRNA，pre-miRNA)，
长度为 60-300 个核苷酸。pre-miRNA 再由 DCL-1 等通过酶切生成 miRNA: :miRNA* duplex。
之后，miRNA:miRNA* duplex 在 miRNA 甲基转移酶 HUA ENHANCER 1 (HENI)的作用下，
将 3'末端的核苷酸甲基化。成熟的单链 miRNA 通常在细胞核中由与 RNA 诱导沉默复合体80
(RNA-induced silencing complex, RISC)类似物结合形成 miRNP，再由 Exportin-5 同源蛋白
HASTY 介导出细胞核进入细胞质；也可能先由 HASTY 运送出细胞核，再与 RISC 类似物
结合，形成 miRNP[21]。最后，miRNA 通过碱基互补配对原则定位结合于靶基因 mRNA，形
成 miRNA: :mRNA 的双链互补结构，引导 RISC 沉默复合体在 miRNA 第 10 位和第 11 位碱
基之间特异性切割 mRNA ORF 区域或结合在 UTR 区对 mRNA 翻译过程进行抑制，从而实85
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现在转录后水平对基因表达的调控[22]。先前大量研究表明, miRNA 在调控植物的生长发育、
应对各种生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用。其中，对 miRNA 的靶基因的研究是
理解 miRNA 调控网络中至关重要的一环，对于研究植物相关基因的调控和表达机制有重要
意义。
2 降解组测序 90
降解组测序的原理
目前, 通过高通量测序技术，研究者可以快速、高效地检测并鉴定 miRNA，然而先前
对于 miRNA 所作用的靶基因以及其功能却知之甚少。导致这一状况的根本原因是传统的
miRNA 靶基因的鉴定方法很难高通量地检测并实验验证靶基因的切割。例如，生物信息学
预测可大规模地检测出 miRNA 的靶基因，但其结果却存在一定的假阳性[23]; AGO 蛋白免疫95
共沉淀[24]和荧光素酶法[25]等生物学方法操作繁琐，且不能大量检测 miRNA 的靶基因。
随着 miRNA 技术的发展，出现了一种新的检测 miRNA 靶基因的方法, 称为降解组测序
(degradome sequencing)。该技术又称为大规模平行末端分析(parallel analysis of RNA ends,
PARE)，是一种新出现的检测手段。它结合了高通量测序技术、cDNA 末端快速扩增技术(rapid
amplification of cDNA ends, RACE)和生物信息学分析的各自优势，对细胞或组织中由100
miRNA 介导降解 mRNA 的剪切片段进行深度测序分析，准确、高效地筛选出 miRNA 的靶
基因，为研究 miRNA 以及其对应的靶基因的相互关系提供了有效的手段。降解组测序一般
可分为 3 步: (1) 构建文库；(2) 高通量测序；(3) 生物信息学分析[26]。
其测序原理如下：在植物体内, miRNA 通常与靶基因 mRNA 进行完全或几乎完全配对,
引起 mRNA 的剪切，从而负向调控基因的表达。切割通常发生在 miRNA 与 mRNA 互补区105
域的第 10 位和第 11 位的核苷酸之间。靶基因 mRNA 经切割产生 5'剪切片段和 3'剪切片段。
其中 3'剪切片段包含有自由的 5'单磷酸和 3'polyA 尾巴, 可被 RNA 连接酶连接和磁珠富集,
连接产物可进一步用于下游高通量测序。对 3'降解片段的 5'端文库测序后产生的数据进行比
对分析，可以得到 mRNA 序列对应于 miRNA 剪切位点出现的降解片段峰。因此，降解组测
序技术结合生物信息学分析可以用来高通量实验鉴定 miRNA 的靶基因，且该技术已成功应110
用于多种植物的 miRNA 靶基因的检测，如模式植物水稻[16]、杨树[6，14-15] 和拟南芥[27]等。
降解组测序的技术流程
首先，富集 mRNA 序列被 miRNA 切割后产生的 3'剪切片段, 通过 T4 RNA 连接酶催化,
3'降解片段的 5'单磷酸与一个 5'RNA 接头连接。然后，由柱子 (如 Oligotex mRNA mini kit )
纯化后的连接产物与一个 oligod(T)引物结合,再由反转录酶（如 SuperScript II RT）催化进行115
反转录。生成的 cDNA使用Taq 酶进行 6次 PCR扩增(先 94 ℃/30 s, 再 60 ℃/20 s, 最后 72 ℃/3
min)。然后，PCR 产物被限制性内切酶 MmeI (NEB) 在 miRNA 剪切位点的下游 20 bp 处酶
切，生成双链的 5'剪切片段和 3'剪切片段。接着，一个双链的 DNA 接头被 T4 DNA 连接酶
连接到酶切生成的 5'剪切片段末端，连接产物经 10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。纯化产物
再进行 20 个循环的 PCR 扩增(先 94 ℃/30 s, 再 60 ℃/20 s, 最后 72 ℃/20 s)，添加一对正向引120
物和反向引物。最后，PCR 产物被凝胶纯化回收后，建立起包含经 miRNA 切割产生的靶基
因 3'端剪切片段的文库。该文库被用于高通量测序(如 Illumina HiSeq 2000) (图 1)。其后，通
过生物信息学方法确定 miRNA 的靶标 mRNA。
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图 1 降解组测序实验流程[26]
Fig. 1 The workflow of degradome sequencing modified from previous research[26]
生物信息学分析流程
通过分析 Illumina HiSeq 2000 测序的降解组数据，研究者可以寻找 mRNA: :miRNA 配130
对，鉴定植物中 miRNA 的靶基因 mRNA。首先，采取 SE50 测序策略，产生长度约为 49 nt
的 raw reads。下机数据首先经过预处理，去除低质量数据、5'/3'接头序列和小于 18 nt 的序
列后，得到 clean tags。通过比对植物数据库对 clean tags 进行分类注释，进一步排除非 mRNA
来源的小片段，得到 mRNA 的降解片段。比对参考基因以及参考 miRNA 来鉴定
mRNA-miRNA 作用位点。其具分析流程如下图所示(图 2)。选取长度为 20-21 nt 的目的序列，135
采用分析软件 (如 CleaveLand)，将目的序列与测序物种的 genome 或 cDNA 进行比对，使降
解组测序得到的序列与测序物种的 mRNA 序列配对，得到被切割 mRNA 完整的序列信息。
其原理是：miRNA 介导的 RISC 导致靶标 mRNA 被剪切成 5'剪切片段和 3'剪切片段。由于
切割常发生在互补位点的第 10 和第 11 位核苷酸之间， mRNA3'剪切片段的 5'末端会存在一
段约 10 nt 长与 miRNA 互补的核酸序列。因此，将 mRNA3'剪切片段的 5'末端与测序物种的140
genome 或 cDNA 进行比对，就可确定完整的 mRNA 候选互补序列。再将这些 mRNA 序列
及其延伸部分与 miRNA 数据库比对，就可确定 miRNA 降解的靶标 mRNA。然后以基因为
单位，对定位其上的 tags 做出 t-plot 图，以不同颜色代表不同 category 的候选位点，并完成
后续的相关功能注释。
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图 2 降解组测序数据分析流程
Fig. 2 The workflow of bioinformatics analysis for degradome sequencing
3 降解组测序在植物胁迫相关 miRNA 靶基因鉴定中的应用 150
miRNA 靶基因与低氮胁迫
氮 (N) 是植物生长发育所需最重要营养元素之一，是限制植物生长、发育和产量的首
要因素。N 不仅构成了植物~2％的干物质，还构成了细胞的关键分子，如蛋白质 (氨基酸)、
核酸、叶绿素、ATP 和次生代谢产物，而且它还参与了调节生物过程包括碳代谢、氨基酸
代谢以及蛋白质合成等过程[28]。缺氮会导致植物体内多种重要的化合物无法正常合成，导155
致植物光合作用下降、生长矮小、生物量降低、枝叶枯黄和叶片早衰等[29]。研究发现，低
氮胁迫会引起某些 miRNA 表达变化，进而导致其靶基因表达发生改变，从而调控相应的基
因以应对低氮环境。例如，在杨树中，利用降解组测序和小 RNA 测序，笔者系统鉴定了 175
个已知的 miRNA 及其 64 个靶基因，并具体分析了其中 11 个氮胁迫相关的 miRNA (miR159、
miR169、miR172、miR395、miR396 等)及其靶基因响应氮胁迫的分子机制[15, 30]。在水稻[31]、160
拟南芥[32]和玉米[33]等植物中，miR156 和 miR157 在氮胁迫下被诱导上升，而其对应的靶基
因 SBP 和 SPL 的表达则相应降低。已知转录因子 SBP 和 SPL 可以调控多个控制植物叶片形
成、营养生长转变、开花和生殖相关基因的表达。通过转基因实验验证，在植物体内过量表
达 miR156，导致 SBP 和 SPL 表达下调，造成植物矮化、营养生长期延长和开花延迟等。并
且，miR156 过量表达会导致其靶基因 SPL9 和 SPL10 的切割降解，进而导致 miR172 的减少，165
而靶基因 AP2 的表达则相对升高，从而抑制植物开花[34]。另外，降解组测序和小 RNA 测序
鉴定发现，miR169 在氮胁迫下被抑制，因而造成其靶基因编码核因子-Y 亚基 A 家族成员
(nuclear factor-Y subunit A [NF-YA]) 的积累以应对缺氮环境。在拟南芥中，一些编码硝酸盐
转运蛋白( 和 )的基因参与抑制侧根的发育，以响应环境中的高 C:N 比
[35]。 170
miRNA 靶基因与低磷胁迫
磷(P) 是植物三大营养元素之一，有增强植物抗性 (如抗寒、抗旱能力等)、促进根系生
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长的作用，是植物生长发育必不可少的另一重要矿质元素。土壤有效磷缺失是限制植物生长
和生物量的一个重要因素，缺磷会导致植物多种代谢和生理过程受到抑制，植株矮小、生长
缓慢、延迟成熟、结实不良等[36]。通过大量小 RNA 测序，研究者已经发现了一些响应低磷175
胁迫的 miRNA，如 miR395、miR398、miR399、miR827 和 miR2111 等；基于降解组测序和
转录组水平的研究，研究者进一步全面检测和验证了 miRNA 的靶基因，揭示了多种 miRNA
及 其 靶 基 因 响 应 低 磷 环 境 的 调 控 通 路 ， 特 别 是 在 多 种 植 物 中 广 泛 存 在 的
miR399-UBC24/PHO2 通路[37]。多种植物中的研究证实，PHR1-miR399-UBC24/PHO2 的信
号通路高度保守，如拟南芥、水稻、大麦、玉米等。PHR1(phosphate starvation response 1) 为180
MYB 型的转录因子，可通过与一些基因 (如 IPS1) 启动子区的顺式作用元件 (如 P1BS) 结
合，促进下游基因的表达。在低磷胁迫下，PHR1 被强烈诱导，促进 miR399 的含量上升，
导致其靶基因编码蛋白泛素结合酶 (UBC24/PHO2)下降，这对植物磷由根到茎的运输分布，
维持植物体内磷的稳定具有重要意义[38, 39]。
miRNA 靶基因与低温胁迫 185
低温胁迫包括冷害和冻害，通常会造成植物组织冻伤、发育延缓，从而制约植物的生长
发育，进而限制植物的空间分布[10]。为了抵御外界的寒冷胁迫，植物能从多个水平对基因
表达模式进行调节，从而维持自身正常的的新陈代谢、生理变化以及生长发育[40]。近年来，
许多研究报道了 miRNA 介导的基因表达调控在植物适应低温胁迫中起着重要作用，例如
miR398-CSD(Cu/Zn 过氧化物歧化酶) 参与的 ICE1 介导的抗冻调节[41]。在低温胁迫下，植190
物中一系列的 COR(Cold-regulated genes)基因可以参与调控相关生物学过程以提高植物的抗
寒、抗冻能力。通常，一些转录因子如 CBFs (CRT binding factors) 或 DREB1s (DRE binding
factors) 能够通过与 COR 基因上的 DRE/CRT 顺势作用元件结合，从而诱导 COR 基因的转
录。在转 CdICE1 基因的拟南芥中，miR398 的含量下降，而其靶基因 CSD 在低温胁迫下被
显著诱导[42]。该结果显示，miR398-CSD 参与了由 ICE1 家族基因调控的对植物低温胁迫能195
力的提高。植物受到冷害和冻害等胁迫会诱导电子传递链产生过量的活性氧(Reactive oxygen
species, ROS)，对细胞造成毒害，而 CSD 是植物抵御氧化毒害的主要酶之一。这些研究表
明，miR398 通过对 CSD 的负调控在植物抵抗和适应低温环境，维持自身生长发育中起着重
要作用[43]。近年来，降解组测序已经鉴定了茶树中低温相关的 91 个 miRNA 和 763 个靶基
因[13]；在低温胁迫下，西红柿中的 42 个保守的 miRNA 及其 62 个靶基因(如抗胁迫蛋白、200
抗氧化的酶和一些参与细胞壁形成的基因) [3]也得以鉴定。
miRNA 靶基因与重金属胁迫
重金属包括非必需重金属如镉 (Cd)、汞(Hg)、铅(Pb)、砷(Cr)和一些有一定毒性的必需
重金属如铜(Cu)、铁(Fe)、镍(Ni)等，而非必需重金属元素和过量的必需重金属均会引起土
壤污染，严重影响植物的生长发育，目前，已在多种植物中进行了镉胁迫相关研究。利用降205
解组测序，研究者在镉胁迫甘蓝型油菜中鉴定了 37 个 miRNA 家族及其 802 个靶基因[44]；
在镉耐受的大豆品种 HX3 和镉敏感的 ZH24 中，共检测出了 204 个 miRNA 和 376 个靶基因，
其中 14 个镉相关的 miRNA 可以切割 55 个靶基因[45]。另外，通过降解组测序和小 RNA 测
序，15个已知的和 8个新的镉相关miRNA以及其对应的靶基因已经在萝卜中被鉴定出来[10]。
其中，miR159/ABC transporter protein，miR393/PCS1(phytochelatin synthase 1)和 miR166/iron 210
transporter protein 与植物中重金属的转运和抗氧化胁迫有关。而在高铜、高铁胁迫下的拟南
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芥中，miR398 的表达被抑制，从而导致其靶基因编码的 Cu/Zn superoxide dismutases
(cytosolic CSD1 and chloroplastic CSD2)含量上升，提高了植物对重金属等氧化胁迫的耐受性
[46]。
miRNA 靶基因与干旱胁迫 215
干旱胁迫是最普遍的植物逆境因子，是制约植物生长和产量最重要的因素之一。目前已
有较多的研究阐述了植物干旱胁迫的信号转导途径及分子机理，而关于 miRNA 及其靶基因
参与应对干旱胁迫也在多种植物中有相关的报道，如拟南芥、烟草、水稻、胡杨、银白杨等。
植物应对干旱胁迫是个多基因、多途径调控的复杂生物学过程，研究发现有多个 miRNA 及
其调控的靶基因均有参与。 220
在干旱胁迫下，毛果杨中的 274 个 miRNA 和相关的 72 个靶基因 (包括一些转录因子
编码基因、参与胁迫反应和脂类代谢的基因) 通过降解组测序和小 RNA 测序鉴定出来。在
水稻种子萌发过程中，共鉴定了 17 个下调的 miRNA (包括 osa-miR171b/c-3p/d-3p/e-3p/f-3p)
及其 57 个靶基因和 11 个上调的 miRNA (osa-miR166i-3p/j-3p，osa-miR396a-5p/b-5p)及其 59
个靶基因[14]。一些 miRNA 的靶基因编码蛋白如 AP2/EREBP、bZIP、NAC 和 MYB 等类型225
的转录因子、蛋白激酶和 cytochrome P450 家族蛋白等均参与了植物合成渗透保护和修复脱
水伤害。在杨树中，miR159 的靶基因 MSR (methioninesulfoxidereductase) 可通过参与调控活
性氧化物 ROS (reactive oxygen species)的积累，清除自由基等来提高植物的抗旱性。在拟南
芥中，miR159 受干旱胁迫诱导表达，而其靶基因编码的转录因子 MYB 被降解，从而引起
其它相关基因的表达变化，以适应干旱环境[47]。 230
4 问题与展望
miRNA 是植物中的一类重要调控因子, 它们通过切割靶标 mRNA 进而在转录后水平下
调靶基因的表达, 在植物的生长、发育、胁迫应答和新陈代谢等方面具有重要作用。目前, 通
过小 RNA 高通量测序可以大规模检测植物中的 miRNA，并系统研究植物逆境胁迫相关的
miRNA。但目前发现的大多数 miRNA，其靶基因尚未得到系统的实验鉴定, 这为进一步研235
究相关 miRNA 的具体功能带来了困难。以往研究多借助于生物信息学的方法进行 miRNA
靶基因的预测，其结果存在着一定的假阳性。而且，植物中某些 miRNA 的靶基因很难通过
生物信息学的方法进行预测。RACE 技术为 miRNA 靶基因的鉴定提供了可靠的实验证据，
但其一次只能对一个或部分 miRNA 的靶基因进行实验求证，效率较低。已知植物中的
miRNA 对靶基因的调控方式多为切割调控，降解组测序技术的出现为全面、有效的检测240
miRNA 对靶基因的切割带来了极大的方便，使多种植物 miRNA 的靶基因被迅速鉴定出来。
而且，研究者还可结合 GO、KEGG 通路和表型性状等，对植物 miRNA-靶基因的调控通路
进行由上而下的整体性分析，深入研究植物抗逆境胁迫的功能基因，进一步了解植物抗性的
生理、生化过程和分子机理。
此外，RNA 沉默技术和过表达技术也被广泛应用于相关靶基因的负向和正向的功能验245
证，以更准确地鉴定功能基因在抗逆过程中的调控作用。而在鉴定靶基因之外，降解组测序
还提供了更加深入、准确的研究方法，可以应用于发现新的 miRNA、验证 miRNA*的生物
学功能、检测 miRNA 对其前体的调控作用及其自我调控功能等。
降解组测序已经成为一种非常成熟的实验技术，而降解组数据的分析方法和思路也正在
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不断发展更新，正在为广大研究者提供新的广阔视角，为深入研究植物胁迫相关 miRNA 调250
控网络和基因调控机制提供更全面的信息，为植物抗性的提高，基因工程改良和优良品种选
育提供理论依据。降解组技术采用测序的方法寻找 miRNA 对靶基因的切割位点，而特定
miRNA 对特定靶基因的切割，还需要结合一定的生物信息学的方法进行鉴定，比如先前使
用的 PairFinder，到后来广发使用的 CleaveLand，鉴定效率不断提高。随着更多植物中胁迫
相关 miRNA 的广泛鉴定和生物信息技术的发展，降解组测序技术将日益广泛地应用于植物255
miRNA 及其靶基因的鉴定中，并揭示 miRNA 介导靶基因调控的机制，促进植物抗逆分子
遗传学的发展和分子机制的阐明，最终为增强植物的抗逆性提供一定的理论指导。
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