食品科学 !"#$%%&,’()* $+,,(* !
收稿日期:$%%$ - %. - !.
基金项目:国家自然科学基金资助项目 / $.0#"%!0 1
作者简介:姚红娟 / !.#0 - 1,女,硕士研究生。
膜分离在蛋白质分离纯化中的应用
姚红娟,王晓琳,丁 宁
/清华大学化学工程系,北京 !%%%0+ 1
摘 要:以压力差为推动力膜分离过程 /过滤、超滤、纳滤、反渗透 1的分离性能由透过通量和截留率表征,其操作模式
分浓缩和渗滤两种。膜分离技术用于分离、纯化、回收和浓缩蛋白质,如乳清蛋白、血清白蛋白、蛋清蛋白、西蒙德木蛋
白、重组白红胞介素 - $ 包涵体以及二元蛋白质混合物等。
关键词:膜分离;微滤;超滤;浓缩;渗滤
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中图分类号:2Q%$#* # 文献标识码:R 文章编号:!%%$ 8 ""&% @$%%& C%! 8 %!"S 8 %T
具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已
必不可少,在医疗和食品领域已逐渐得到应用。蛋白质具有广泛
的功能性质,每一种性质都会给食品及其加工过程带来特定的
效果。因而可将这些功能蛋白质如乳清蛋白、蛋清蛋白、大豆蛋
白等添加到食品中制得各种功能性食品。正是由于蛋白质与人
类生活密切相关,所以对其质量和纯度要求也越来越高。蛋白质
常存在于复杂的混合体系中,且稳定性较差,对温度、4U值、机
械剪切力等非常敏感、易于变性。它们的提取与精制通常采用沉
淀、离心、萃取、离子交换和色谱等方法,但工艺过程复杂,且费
用通常高达生产成本的 T%V以上。膜分离技术具有设备简单,
常温操作,无相变及化学变化,选择性高及能耗低等优点。作为
一门新型分离技术日益受到人们的重视。选择适当分离膜、操作
参数和操作模式,即可实现蛋白质的浓缩、分离与纯化。本文将
近年来国内外膜分离技术在分离纯化蛋白质中应用的最新研究
进展作较为详细的介绍。
! 膜分离技术
膜分离过程以选择性透过膜为分离介质,通过在膜两侧施
加某种推动力 @如压力差、蒸气分压差、浓度差、电位差等 C,使得
原料侧组分选择性透过膜,达到分离提纯的目的。
!* ! 膜分离类型
以压力差为推动力的液化膜分离过程通常根据分离对象可
分为:微滤 @ABC、超滤 @EBC、纳滤 @,BC 和反渗透 @FGC 四种类
型。微滤用于截留直径为 %* %$!:到 !%!:大小的粒子,用于发
酵液除菌、澄清及细胞收集等。超滤可分离分子量从上千到数百
万的可溶性大分子物质,对应孔径约 $ W $%9:。超滤膜规格通常
不是以孔径大小作为标准,而是用截留分子量 @:()/=7)<5 0/.L3?
=7? 8 (>>D AXYGC 作为指标。纳滤集浓缩与脱盐为一体,膜平均
孔径约 ! W $9:,用于分离溶液中分子量为 $%% W !%%%Z< @全称
1<)?(9 C的小分子物质,如抗生素、氨基酸等。反渗透膜因其致密
的分离结构,对离子有效截留,主要用于海水脱盐,纯水制造以
及小分子产品浓缩等。
!* $ 膜分离性能
膜分离性能由截留率和透过通量来表征。透过通量是指在
一定工作压力和温度下,单位面积膜在单位时间内的透过液
量。截留率是指溶液中被膜截留的特定溶质的量所占溶液中该
特定溶质总量的比率。影响膜分离性能的主要参数有溶液状况
@料液预处理、料液浓度、4U及离子强度等 C、操作条件 @包括膜
两侧压差、温度、循环流速等 C 和膜表面特性 @包括膜表面的亲
水 [疏水性、电荷或电位、膜孔径大小及其分布等 C \! ]。这些参数
的优化对实际膜分离过程十分重要,一般是通过对一定的待分
离体系进行小试,测定不同条件下的透过通量和截留率,选择较
高的透过通量和满意截留率时的参数。
!* & 膜分离操作模式
根据具体分离任务和要求,在进行膜分离工艺设计时,主要
有浓缩 @ =(9=/9?5<?.(9 C和渗滤 @ 1.<>.)?5<?.(9 C两种操作模式。浓缩
是指在一定压力下,料液流过膜面时,溶剂和小分子溶质透过
膜,大于膜孔的大分子溶质被膜截留,从而被浓缩回收。渗滤是
指膜分离过程中,向料液 @或浓缩液 C中添加渗滤溶剂,小分子与
渗滤溶剂一同透过膜而被不断去除,直到料液中能透过组分的
浓度达到限定的数值。渗滤可以克服高浓度料液透过率低的缺
点,减少浓差极化和膜污染,广泛地应用于大分子的纯化,即大
分子与小分子的分离 \ $ ]。在实际操作中,常将浓缩和渗滤两种模
式结合起来,即开始采用浓缩模式,当达到一定浓度时,转换为
渗滤模式,其转换点应以使整个过程所需时间最短为标准。
$ 膜分离在蛋白质分离纯化中的应用
蛋白质为两性电解质,每一分子上带有多个正负电荷,具有
等电点。其相对分子量约 !%+ W !%"Z<左右,采用膜分离技术分
离蛋白质既可以基于蛋白质间分子量的差异,也可基于其带电
性不同。
$* ! 乳清蛋白
乳清主要成分为乳清蛋白质、乳糖和灰分等。在乳清蛋白质
中," 8乳清蛋白 @" 8 ^RC、# 8乳球蛋白 @# 8 ^_C和牛血清蛋白
@‘aRC是弱酸性蛋白质,等电点分别为 +* #、T* &和 T* !,分子量
分别为 !+* $NZ<、!#* "NZ<和 "SNZ<。而免疫球蛋白 @ bL_ C的分子
量大于 !T%NZ<,有较高的等电点 T* T W #* &。配糖巨肽 @_AcC具
有强酸性和亲水性,分子量为 SNZ<。膜分离技术可用于乳清蛋
白浓缩物 @XcY C的生产和乳清蛋白的分离。
‘<5;<\&, + ] 等采用螺旋卷式 R:.=(9 a!%d!% 膜 @AXYG
!%NZ<,再生纤维素 C 进行中试规模的两级逆流渗滤过程生产
XcY。乳清中蛋白质含量 !TV @蛋白质量与总溶质量之比 C,乳
糖 +$* #L [ ^,灰分 T* #L [ ^。渗滤操作主要是除去乳糖和灰分等,
从而制取高蛋白质含量的 XcY,但渗滤过程常消耗大量的水
"综述
食品科学 !"#$%%&,’()* $+,,(* !
-作为渗滤溶剂 .。多级逆流渗滤操作可降低水的消耗量,模拟计
算结果为:生产蛋白质含量为 #/* /0的 123,采用单级渗滤操
作,渗滤体积数 -所需渗滤水体积与原料液体积之比 .为 /* +;两
级渗滤操作时,渗滤体积数为 $* #;六级渗滤操作时,渗滤体积
数为 !* /。但当级数较高时,随级数的增加,水的节省并不很明
显。生产 123的流程为:乳清!酸化 -加硫酸 .!超滤浓缩 -取截
留液,其中蛋白质含量 $$0 . !第一级渗滤 -取截留液,其中蛋
白质含量 "&0,乳糖 +* 45 6 7 .!第二级渗滤 -取截留液,其中蛋
白质含量 8&0,乳糖 %* &/5 6 7 .!干燥!123。
9:));< =/ > 等采用无机超滤膜 -913? &%%@AB,C<?$ 6 ! D
E)$?& .从酸性的酪蛋白乳清中分离 ! D乳清蛋白,研究了不同操
作模式 -连续浓缩、间歇浓缩、连续渗滤及连续浓缩 D连续渗滤
组合 .对 ! D乳清蛋白的纯度和产量的影响。结果表明,组合操
作提高了透过液中 ! D乳清蛋白的纯度和产量。F:=" >等采用阴
离子交换树脂 GHE #& 和 EIJK(LM9!%% 超滤膜 -913? &%%@AB,
荷负电 . 分别对酸性酪蛋白乳清和牛乳清进行分离,得到 N92、
G5N和乳清蛋白分离物 -包括 ! D 7E、" D 7N和 OPE. 三个组
分。在 QR+* 4 时,GHE#&选择吸附带负电荷的 N92。超滤浓缩过
程中,G5N被膜截留,QR和 ,B3)浓度对乳清蛋白分离物透过率
均有影响。对浓缩后的截留液进行三次间歇渗滤操作,使更多的
乳清蛋白分离物透过膜。
$* $ 血清白蛋白
在 3(SL ;T B) 醇沉法制备人血清白蛋白 -分子量 9U V
"4@AB .最后一步,馏分 G’上层液中含有浓度 !/5 6 7的白蛋白,
乙醇浓度 +%0 -W 6 W .。XBYYJL=4 >等采用浓缩 D渗滤 D浓缩组合过
程使乙醇浓度小于 %* !5 6 7,白蛋白浓缩到 $!%5 6 7,以回收白蛋
白。采用超滤膜盒 -913?!%@AB,聚砜 .研究了循环流速、白蛋
白浓度、乙醇浓度对透过通量的影响,并对过程进行优化来确定
起始乙醇浓度和渗滤时白蛋白浓度,以使标准过程时间 -单位膜
面积上生产 !@5白蛋白所需时间 .最小。由于乙醇浓度较高时,
不仅透过通量降低,而且会损坏有机膜,所以也可采用耐乙醇的
C<?$ 无机膜 -913? !%@AB .处理白蛋白 D乙醇溶液 =8 >。
Z;<LBL[;=# > 等采用错流微滤 -孔径 \!#I. 和超滤 -913?
&%%@AB和 !/@AB,C<?$ D ]J?$ . 对牛血浆进行分离和脱盐后得到
牛血清白蛋白 - OPE.。微滤是为了除去没有被离心除去的固体
如细胞碎片。三级间歇渗滤过程从经过 913?!/@AB膜浓缩后
的截留液中除去盐和其它小分子杂质。最终 OPE浓度为起始浓
度的 &* # 倍,氯化物含量由 $* 85 6 7降到 $/% ^ &4% _ !% D ",平均
电导率值由 !$* 4IP降到 $* 8IP。实验流程为:牛血 -加抗凝血
剂 . !离心!微滤 -取透过液 . !超滤 - &%%@AB,取透过液 . !浓
缩 6渗滤 - !/@AB,取截留液 .!OPE。
$* & 蛋清蛋白
蛋清中,主要成分为卵清蛋白 -9U V +/@AB,等电点 QG V
+* 4,含量 /+0 ^ /40 .,伴清蛋白 -9U V 8%@AB,QG V "* / ^ "* 8,
含量 !$0 ^ !/0 .和溶菌酶 -9U V !+* 4@AB,QG V !!* %,含量 &0
^ +0 .。
‘SaBLJ =!% >等研究了 QR值、盐浓度和膜的改性对分离性能的
影响。由于静电排斥作用,采用紫外改性超滤膜 -913? /%@AB,
聚砜 .,在 QR+* 8 和很低盐浓度时透过液几乎为纯卵清蛋白。提
高盐浓度,静电斥力降低会引起溶菌酶透过率增大,但膜对大分
子伴清蛋白的截留率仍很高。因而,在 QR+* 8 和很低盐浓度下
进行渗滤操作,得到富集卵清蛋白的透过液;再在 QR+* 8和高
盐浓度下渗滤操作,得到富集溶菌酶的透过液和富集伴清蛋白
的截留液 = !! >。NS(aS=!$,!& >等研究了操作参数 -如错流速度、压差、
QR值、搅拌速度、溶液浓度等 .对透过通量和溶菌酶透过率的影
响。采用中空纤维超滤膜 -913? &%@AB,聚砜 .渗滤操作后,透
过液中溶菌酶纯度在 8+0 ^ 8#0之间。采用平板超滤膜 -913?
$/@AB和 /%@AB,聚砜 . 进行两级膜组件串联操作,即第一级用
913? /%@AB 膜截留其它蛋清蛋白,溶菌酶透过膜,第二级
913? $/@AB膜提纯溶菌酶,得到高纯度和高产量的溶菌酶。若
用肌红蛋白对 913? /%@AB聚砜膜预处理,可使溶菌酶透过率
提高 $"0,透过液中溶菌酶的纯度可达到 #"* "0 =!+ >。
$* + 西蒙德木蛋白
西蒙德木 - X(b(cB . 种子榨油后的残渣中含 $/0蛋白质,将
其中的 X(b(cB蛋白提取纯化后可作为化妆品成分。,Bc;TBLJ =!/ >等
采用微滤和超滤膜的浓缩 D渗滤组合操作方法提取和纯化 X(d
b(cB蛋白。膜组件由 9J))JQ(<;公司生产,微滤采用三个 R’22组
件 -孔径 %* +/#I,聚偏二氟乙烯膜 .串联,渗滤和浓缩均采用五
个 2]N3组件 -913? !%@AB,聚砜 .。当渗滤体积为 & 时,截留液
中糖的浓度由 %* /#@5 6 I&降到 %* !"@5 6 I&,蛋白质纯度 -蛋白质
浓度与总固体浓度之比 .从 %* $% 提高到 %* "";再将截留液浓缩
!+倍,X(b(cB蛋白纯度从 %* ""提高到 %* 8&。采用流程为:X(b(cB
粉末!两次水提取!离心 -取上清液 .!微滤 -取透过液 .!连续
恒容渗滤 -取截留液 .!浓缩 -取截留液 .!冷冻干燥!X(b(cB蛋
白。
$* / 重组白细胞介素 D $包涵体
包涵体主要由蛋白质构成,其中大部分 -占 /%0以上 .是克
隆基因的表达产物。大肠杆菌中包涵体平均大小从 %* %4#I-人
生长激素 .到 !* /#I-" D乳酸酶 .间变化。白细胞介素 D $ - <G7 D
$ . 大小约 %* $#I,采用微滤膜 -孔径为 %* !#I. 错流过滤提取
<G7 D $包涵体流程:湿细胞 -加缓冲液 E.!细胞破碎!稀释 !!
倍 -加缓冲液 E.!渗滤$-加缓冲液 E,取截留液 .!渗滤%-加
!* 4/9N: R3),取截留液 .!浓缩 -取截留液 .!复性。渗滤$除去
8/0 ^ #%0吸收 $8%LI波长的可溶性物质。渗滤%进一步溶解
和除去杂质,其间包涵体发生部分溶解,但 <G7 D $的损失小于
"0。该工艺 <G7 D $ 的收率达 !"&# e /%8 -I5 6 @5湿细胞 .,是离
心法 - /%8 e $+4 .的 & 倍。如果操作中省去渗滤%步骤,<G7 D $的
收率仅为 4/$ e $$+,是前者的约 ! 6 $ =!" >。OBJ);f=!# >等采用渗滤过
程从含有包涵体的重组大肠杆菌细胞溶解产物中除去可溶蛋白
质。首先根据透过通量、蛋白质透过率和清洗后膜通量和恢复情
况来选择膜。进一步研究膜压差对聚醚砜膜 -孔径 %* !#I.的透
过通量和蛋白质透过率的影响。在 /#@2B下进行连续恒容渗滤,
渗滤体积为 & 时,除去 4%0的染料结合蛋白质和 8+0的吸收
$8%LI波长的可溶性物质。
"综述
食品科学!"# $##%,&’() $*,+’) !
$) , 二元蛋白质混合物
对于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质,不仅与膜表
面的化学性质和料液特性有关,而且与流体力学、传质、蛋白质
间和蛋白质与膜间的相互作用有关。通过选择适当的分离参数
-如 ./,离子强度,蛋白质浓度,膜的改性等 0来实现分子量相近
的二元蛋白质混合物的分离。一些蛋白质混合物 -分子量之比
!) # 1 2) , 0的超滤分离结果如表 !。
% 展望
膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有非常广阔的应用
前景,并向工业化发展。当然,它也存在一定的问题,如在操作
中膜面会发生污染,使膜性能降低,故又必须采用与工艺相适应
的膜面清洗方法;而且单采用膜分离技术效果有限,因此有时需
将膜分离工艺与其他分离工艺组合起来应用。但是可以预见,
随着膜分离技术的进一步发展,其势必将取代那些耗能大、费用
高、处理不彻底、周期长、易造成环境污染的传统单元操作,如沉
淀、离心、过滤等,并使产品成本降低,质量提高。
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) R@. RAC ;DN S@ABD’(? $###? %, -* 0 3 28" 7 ,#%)
表 ! 超滤膜分离蛋白质混合物的研究进展
2) 29
2) 2
*) 8$
*) #2
%) !$
$) %$
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$) $2
$) #
!) %
!) $!
1 !) #
./ 值、离子强度、膜的改性
./值、膜的截留分子量
./值、离子强度、膜改性、蛋
白质浓度、气体鼓泡操作、超
声波照射膜组件
./值、离子强度、操作压力、
蛋白质浓度、膜材质
./值、离子强度、操作压力、
蛋白质浓度、旋涡流操作
./值、蛋白质浓度、膜改性、
脉动流操作
./值、离子强度、压力、流速、
蛋白质浓度、气体鼓泡操作
./值、离子强度、蛋白质浓度
./值、离子强度、操作压力
./值
蛋白质浓度、操作压力
./值、离子强度、膜材料、
膜改性、膜组件形式
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全分离
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千道尔顿
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分离用膜
蛋白质混合物
溶菌酶
乳铁蛋白
细胞色素 T
人血清蛋白
溶菌酶
牛血清蛋白
肌红蛋白
牛血清蛋白
溶菌酶
卵清蛋白
牛血清蛋白
! 7球蛋白
人血清蛋白
免疫球蛋白
牛血清蛋白
免疫球蛋白
牛血清蛋白单体
其二聚物
细胞色素 T
肌红蛋白
溶菌酶
肌红蛋白
牛血清蛋白
血红蛋白
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分离操作参数
分离
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搅拌池装置、聚砜 - S’Q’ \’MBC 0
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管式、E]!##、聚偏氟乙烯 -英国 ]Td 0
搅拌池装置、ZH@F;、聚醚砜
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中空纤维式、聚丙烯腈 -自制 0
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搅拌池装置、ZH@F;、聚醚砜
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搅拌池装置、Ge!##、聚丙烯膊 -G@H=<@c 0;^G!##、
再生纤维素 - _HCA’D 0;]S/X、改性聚砜 -GC((C.’<@ 0
参考
文献
"综述
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