- 1 -
中国科技论文在线
植物乳杆菌 luxS 基因敲除载体的构建与应
用#
郑慧琦，庞雪辉，朱宗涛，孟祥晨**
基金项目：基金项目：教育部博士学科点专项科研基金（20122325110017）；哈尔滨市杰出青年人才基金
（2014RFYXJ006）
作者简介：郑慧琦(1991-),女,硕士研究生,主要研究方向:食品微生物
通信联系人：孟祥晨（1970-），女，教授，主要研究方向：乳品科学与技术，食品微生物
（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030） 5
摘要：构建植物乳杆菌 的 luxS 基因敲除载体并实现基因敲除。以植物乳杆菌
的基因组为模板，采用 PCR方法扩增 luxS侧翼序列 luxSL、luxSR并分别克隆
至 pMD 19-T Simple中，鉴定正确后酶切，与敲除载体 pNZ5319连接，鉴定正确后转入大
肠杆菌 DH5α 保存。采用电转化方方将敲除载体导入植物乳杆菌 ，构建 luxS
基因敲除菌株。结果表明，植物乳杆菌 luxS基因敲除载体 pNZ5319-luxS构建成功，测序结10
果证实该菌 存在两个 luxS基因且成功敲除一个。该结果为进一步研究 luxS基因在植物乳
杆菌 代谢和群体感应 的重要作用奠定基础。
关键词：植物乳杆菌；luxS；基因敲除
中图分类号：请查阅《中国图书馆分类法》
15
Construction and application of Lactobacillus plantarum
KLDS homologous recombination vector
ZHENG Huiqi, PANG Xuehui, ZHU Zongtao, MENG Xiangchen
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education ,Northeast Agricultural
University,Harbin 150030) 20
Abstract: To construct the Lactobacillus plantarum KLDS homologous recombination
vector and achieve gene knockout. Using genome as template, the flanking sequences of luxS
gene were amplified by PCR and cloned into pMD 19-T Simple Vector. After colony PCR
identification, these two recombination vectors pMD19-T Simple-luxSL、pMD19-T Simple-luxSR
were digested by different restriction enzymes and cloned into pNZ5319. After identification, the 25
homologous recombination vector pNZ5319-luxS was transformed into DH5α.The
luxS knockout strain was constructed by using the method of
electroporation. The results showed that the luxS gene knockout vector pNZ5319-luxS was
constructed successfully, and the sequencing results showed that one of the two luxS genes was
successfully knocked out. The important role of luxS in metabolism and quorum sensing of 30
L. plantarum will be based on this work.
Key words: ; luxS gene; gene knockout
0 引言
luxS基因在多种菌属中序列保守，其编码的 LuxS蛋白酶能够在甲基循环中合成 AI-2，
AI-2 是群体感应中的一种信号分子[1]。“群体感应”由 Fuqua 等于 1994 年首次提出[2]，指35
菌体能够通过感应细胞密度而调控基因的转录[3]。目前已报道在超过 80 种细菌中广泛存在
luxS 基因[4-5]，不仅致病菌能够产生 AI-2，许多益生菌如双歧杆菌属和乳杆菌属也含有 luxS
并能够生成 AI-2[4,6-7]。由于在乳酸菌中 luxS 既能够编码甲基循环途径中的重要酶，又能编
码信号分子 AI-2的关键酶，因此确定 luxS 基因的功能是当前面临的难题。基因敲除技术的
- 2 -
中国科技论文在线
快速发展为研究 luxS 基因功能提供了有效途径。常用的基因敲除技术包括同源重组、插入40
失活和 RNA 干扰三种类型，同源重组方方应用最为广泛[8]。Buck 等构建了嗜酸乳杆菌
(Lactobacillus acidophilus)的 luxS突变菌株，通过对比发现突变株不生成 AI-2信号分子，且
影响了生物膜的合成[9]。Gerald W. T[10]等和 Lebeer[11]等分别构建了 L. reuteri100-23的 luxS
缺失菌株和鼠李糖乳杆菌 LGG的 luxS突变株，通过与野生型菌株进行基因表达和代谢分析
上的对比，证实 luxS 在代谢中扮演重要角色。本实验室前期研究表明，植物乳杆菌45
中存在 luxS基因并能够合成 AI-2，而且植物乳杆菌 与某些乳酸菌
共培养后，细菌素的生物合成量显著升高[12]，但是该菌 luxS 基因与细菌素生物合成的关系
尚不明确。本研究应用质粒 pNZ5319构建 luxS基因同源重组敲除载体从而敲除植物乳杆菌
的 luxS基因，为进一步研究 luxS基因调控群体感应现象和和细菌素合成代谢奠
定基础。 50
1 材料与方方
材料与仪器
植物乳杆菌 、大肠杆菌 E. coli DH5α 感受态细胞，本实验室保存；质粒
pNZ5319，江南大学堵国成教授惠赠；
细菌基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收 DNA 试剂盒、Universal 55
DNA 纯化回收试剂盒、MarkerⅣ，购自天根生化科技有限公司；Prime STARTM DNA
Polymerase、DNA Ligation Kit 、DL5000 DNA Marker、pMD19-T Simple Vector ，
TaKaRa 公司；氯霉素（CAP）、氨苄青霉素（Amp），美国 Amresco公司；限制性内切酶
XhoΙ、PmeΙ、Eco53kΙ、Bgl ΙΙ ，美国 NEB公司；其余试剂均为国产分析纯。
9700 PCR仪美国 Applied Biosystems公司；UVP 凝胶成像系统仪 美国 UVP 公司；60
MicroPulser电穿孔仪 美国 Bio-Rad公司；GL－21 M 高速冷冻离心机 上海市离心机械研究
所；ZHWY200B 型全温度恒温培养摇床 上海智城分析仪器制造有限公司。
实验方方
pNZ5319-luxS敲除质粒构建的技术路线如图 1所示.
- 3 -
中国科技论文在线
65
图 1 敲除载体 pNZ5319-luxS的构建
Construction of recombinant vector pNZ5319-luxS
本实验所使用的引物见表 1。
表 1 本实验应用的引物
The sequences of primer used in this study 70
引物名称 引物序列（5´-3´） 退火温度（℃）
luxS-L-F
luxS-L-R
luxS-R- F
luxS-R-R
pNZ5319-L-f
pNZ5319-L-r
pNZ5319-luxS-f
pNZ5319-luxS-r
luxSqs-f
luxSqs-r
CCGCTCGAGCGGTTTATCCCACT
AGCTTTGTTTAAACATTGCCCGTTATT
GAGCTCGGTGTACGCAAAGTCGT
GGAAGATCTAATTCCATGTTCACCAGC
GAGCAGAATGTCCGAGAC
CGGCTAAAACGACCTTAA
TGTTGCCGATTCCGCTAG
ACCCCGTCAGCTTTAGG
GTGAAAACGGTGGTGAGGTC
TCTTTATGTGCTTTGAGCAATA
57
63
55
57
60
同源臂的扩增及纯化
应用细菌基因组提取试剂盒提取过夜培养后的 Lactobacillus plantarum 基
因组。根据 GenBank中已登录植物乳杆菌中 luxS基因侧翼序列，通过比对分析显示 luxS基
因侧翼序列具有一定的保守性，应用 软件设计引物扩增上下游约 1100bp的侧翼片
段 luxSL、luxSR，用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系：75
μL，5×Taq DNA polymerase buffer（含Mg2+）μL，dNTP（
DNA模板 μL，上、下游引物（10μmol/L）μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（
- 4 -
中国科技论文在线
μL。反应程序：94℃、3min；98℃、10s，退火温度、15s，72℃、70s，30 个循环；72
℃延伸 10min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，用天根生物试剂公司的
离心柱型普通琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒回收目的片段。 80
目的基因与测序载体的连接及转化
由于 PrimeSTAR HS DNA Polymerase扩增出的 PCR产物为平末端，为了 PCR产物与
载体 pMD19-T Simple可进行连接，需在 PCR产物 3′端加 A。PCR反应条件为 72℃，10～
30min，冰中静置 1～2min。用普通 DNA产物纯化试剂盒纯化 PCR产物。
将纯化后 PCR产物与克隆载体 pMD19-T Simple应用 DNA Ligation Kit 在 16℃85
连接 1h，构建重组质粒 pMD19-T Simple-luxSL、pMD19-T Simple-luxSR，转化到大肠杆菌
DH5α感受态细胞中。
重组质粒的筛选及鉴定
挑取单个菌落，以 pMD19-T Simple测序通用引物 RV-M和M13-47进行菌落 PCR。挑
取 PCR后琼脂糖凝胶电泳结果正确的单菌落于 Amp浓度为 100μg/mL的 LB培养基中，3790
℃，100r/min振荡培养 16h。用质粒小提试剂盒提取重组质粒，用 XhoΙ、PmeΙ酶切 pMD19-T
Simple-luxSL，用 Eco53kΙ、Bgl ΙΙ酶切 pMD19-T Simple-luxSR。将鉴定结果正确的重组质粒
送吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定，测序结果进行比对。
目的基因与敲除载体的连接及转化
将 pMD19-T Simple-luxSL和敲除载体 pNZ5319分别经 XhoΙ和 PmeΙ双酶切，酶切后的95
片段经胶回收后按比例混合，以 DNA Ligation Kit 于 16℃连接过夜，转入大肠杆菌
DH5α感受态细胞中，应用引物 pNZ5319-L-f、pNZ5319-L-r进行菌落 PCR鉴定，质粒提取
后进行双酶切鉴定及测序。所得重组载体命名为 pNZ5319-L。
将 pMD19-T Simple-luxSR和 pNZ5319-L载体分别经 Eco53kΙ和 Bgl ΙΙ双酶切，酶切后操
作同上。应用引物 pNZ5319-luxS-f、pNZ5319-luxS-r 进行菌落 PCR 鉴定，质粒提取后进行100
双酶切鉴定及测序。所得重组载体即为敲除载体 pNZ5319-luxS。
luxS基因缺失突变株的构建
采用电转化的方方制作感受态细胞及外源基因的转化[13]。电转化参数略做改动：电场
强度 kV/cm，电压 100Ω，复苏培养时间 。复苏培养后涂布于含有氯霉素浓度为
4μg/mL的MRS平板，挑取阳性单菌落，应用引物 luxSqs-f、luxSqs-r进行 PCR验证，成功105
后回收电泳条带进行序列测定。
2 结果与分析
同源臂的克隆及 PCR产物的纯化
根据 GenBank 报道，所设计引物扩增的两同源臂大小分别为 1079bp、1121bp，以
KLDS 基因组为模板，分别扩增 luxS基因同源臂 luxSL、luxSR。将 PCR110
产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳，发现在 1100bp左右有明显的单一条带，与预计大小一致（图
2a）。将目的条带切割后纯化回收，经 1%琼脂糖凝胶电泳获得与 PCR扩增大小一致的条带
（图 2b）。
- 5 -
中国科技论文在线
（a） （b) 115
图（a）M: DL5000 DNA Marker；1：luxS-R基因片段；2：luxS-L基因片段
图（b）M: DL5000 DNA Marker；1：luxS-L基因片段；2：luxS-R基因片段
图 2 PCR扩增同源臂（a）及胶回收目的条带（b）电泳结果
The electrophoretogram of PCR amplification of luxSL、luxSR（a） and agarose gel recycling（b）
同源臂与测序载体连接及转化 120
转化后的大肠杆菌 DH5α在含有 100μg /mL Amp的 LB平板上经培养 18h，有单菌落生
长（平板图略）。挑取阳性克隆菌落进行菌落 PCR，琼脂糖凝胶电泳结果表明 PCR产物大
小与目的基因大小一致（图 3a）。
将鉴定正确的单菌落扩培后提取质粒，用 XhoΙ和 PmeΙ、Eco53kΙ和 Bgl ΙΙ分别对提取的
质粒 DNA进行双酶切，酶切产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。线性 pMD19-T simple大小为 125
2692bp，两条同源臂约为 1100bp，双酶切结果显示条带大小正确，连接转化成功（图 3b、
3c）。将重组质粒送往吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定，测序结果进行比对，与
Lactobacillus plantarum WCFS1（GenBank序列号为 NC004567）luxS 侧翼片段序列相似度
分别达 100% 、99%( 比对结果略) ，判定重组质粒构建成功。
130
(a) (b)
图（a） M：DL5000 DNA Marker；1：pMD19-T Simple-luxSR菌落 PCR ；
2：pMD19-T Simple-luxSL菌落 PCR
图（b） M：DL5000 DNA Marker；1：pMD19-T Simple-luxSL质粒提取；
2-3：pMD19-T Simple-luxSL经 XhoΙ、PmeΙ双酶切 135
(c)
图（c） M：DL5000 DNA Marker；1：pMD19-T Simple-luxSR质粒提取
- 6 -
中国科技论文在线
2：pMD19-T Simple-luxSR 经 Eco53kΙ单酶切
3：pMD19-T Simple-luxSR经 Eco53kΙ单酶切回收后经 Bgl ΙΙ单酶切 140
图 3 阳性克隆菌落 PCR（a）及重组质粒 pMD19-T Simple-luxSL（b）和 pMD19-T Simple-luxSR（c）双酶
切电泳结果
Colony PCR identification of positive clones（a） and the electrophoretogram of enzyme digestion results
（b、c）
同源臂与敲除载体 pNZ5319的连接及鉴定 145
敲除载体 pNZ5319 经 XhoΙ和 PmeΙ双酶切，酶切后的产物进行胶回收。将重组质粒
pMD19-T Simple-luxSL双酶切后胶回收片段 luxSL，两种片段连接后转化到大肠杆菌感受态
细胞中培养 18h，挑取在含有 20μg /mL 氯霉素的 LB 平板上正常生长的阳性转化子进行菌
落 PCR（图 4a）。提取质粒 pNZ5319-L，进行双酶切鉴定及测序（图 4b）。测序结果经比
对，表明同源臂 luxSL成功连接至敲除载体 pNZ5319上。 150
（a） （b）
图（a）M：DL5000 DNA Marker；1：pNZ5319-L菌落 PCR验证
图（b）M：DL5000 DNA Marker；1-2：pNZ5319-L质粒提取；3-4：pNZ5319-L经 XhoΙ、PmeΙ双酶切验证
图 4 pNZ5319-L菌落 PCR验证（a）、质粒提取及双酶切（b）结果 155
Colony PCR identification of pNZ5319-L and the electrophoretogram of enzyme digestion result
将 pNZ5319-L与 pMD19-T Simple-luxSR经 Eco53kΙ和 Bgl ΙΙ分步双酶切，两种片段连接
后转化到大肠杆菌感受态细胞中培养 18h，挑取在含有 20μg /mL 氯霉素的 LB 平板上正常
生长的阳性转化子进行菌落 PCR（图 5a）。提取质粒进行双酶切（图 5b），将鉴定正确的
质粒送样测序。测序结果经比对，表明同源臂 luxSR 成功连接至重组载体 pNZ5319-L 上，160
敲除载体 pNZ5319-luxS构建成功。
（a） （b）
图（a）M：DL5000 DNA Marker；1：pNZ5319-luxS菌落 PCR验证
图（b）M：Marker Ⅳ ；1：pNZ5319-luxS质粒提取；2：Eco53kΙ单酶切 pNZ5319-luxS； 165
3：Bgl ΙΙ单酶切 pNZ5319-luxS
图 5 pNZ5319-luxS菌落 PCR验证（a）及酶切验证（b）
Colony PCR identification of pNZ5319-luxS and the electrophoretogram of enzyme digestion results
- 7 -
中国科技论文在线
植物乳杆菌 基因缺失突变株的构建
提取敲除质粒 pNZ5319-luxS，取 5μL 的 pNZ5319-luxS 重组质粒与 80μL 植物乳杆菌170
电转化受体菌悬液混匀后电转化。挑取在含有氯霉素的抗性 MRS 平板上生长
的单菌落过夜培养，提取基因组后 PCR验证。PCR结果显示打靶片段成功同源重组至基因
组上，但仍存在与野生型菌株相同大小的扩增片段（图 6）。胶回收两条片段后进行序列测
定，测序结果经过比对显示（结果略）：植物乳杆菌 具有两个 luxS 基因，且
成功敲除了一个 luxS基因，植物乳杆菌 单基因缺失突变株构建成功。 175
M：DL5000 DNA Marker；；1：luxS基因缺失突变株；2：野生型菌株
图 6 luxS基因缺失突变株 PCR验证
PCR identification of luxS knockout mutant
3 讨论 180
目前，质粒 pUC18、pUC19、pGID023、pIL252、pORI28和 pNZ5319等作为敲除载体
已成功应用于乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌 LGG、植物乳杆菌 NC8 和罗伊氏乳杆菌
100-23[10,14-18]等多种乳酸菌的基因敲除。由于质粒 pNZ5319含有氯霉素抗性基因和红霉素抗
性基因，且已多次成功应用于敲除植物乳杆菌的不同基因，因此本研究选择质粒 pNZ5319
作为敲除载体，可省略向载体中插入抗性基因这一步骤，简化了实验操作。另一方面，提高185
同源重组效率是实现基因敲除的又一关键。同源重组的效率与同源臂长短有关，在一定范围
内，同源臂越长重组效率越高，但同源臂过长又会降低重组载体在电转化中穿过细胞壁孔洞
而进入细胞的概率。通常乳酸菌基因敲除的同源臂大小约为 200bp 到 2000bp[10,14-18]，鉴于
植物乳杆菌 属革兰氏阳性菌，同源重组效率较低，本研究分别设计扩增 luxS
基因上、下游同源臂各 1100bp，提高同源重组效率，结果成功敲除了
的 luxS基因。
4 结论
本研究成功构建 敲除载体 pNZ5319-luxS 并完成植物乳杆菌
单基因敲除，为后续研究 luxS基因在 细菌素生物
合成等方面的功能奠定了基础。 195
[参考文献] (References)
[1] 杨瑞宁, 操敏, 李先富, 等. 细菌中 LuxS/AI-2 密度感应系统分子机制研究进展[J]. 检验医学, 2013,
28(9): 856-861.
[2] Fuqua W C, Winans S C, Greenberg E P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell
density-responsive transcriptional regulators[J]. Journal of bacteriology, 1994, 176(2): 269. 200
[3] Miller M B, Bassler B L. Quorum sensing in bacteria[J]. Annual Reviews in Microbiology, 2001, 55(1):
165-199.
[4] Sun J, Daniel R, Wagner-Döbler I, et al. Is autoinducer-2 a universal signal for interspecies communication: a
- 8 -
中国科技论文在线
comparative genomic and phylogenetic analysis of the synthesis and signal transduction pathways[J]. BMC
Evolutionary Biology, 2004, 4(1): 36. 205
[5] Bassler B L, Losick R. Bacterially speaking[J]. Cell, 2006, 125(2): 237-246.
[6] Altermann E, Russell W M, Azcarate-Peril M A, et al. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid
bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 2005, 102(11): 3906-3912.
[7] Kleerebezem M, Boekhorst J, van Kranenburg R, et al. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum 210
WCFS1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(4): 1990-1995.
[8] 李今煜, 陈健铭, 彭振坤. 几种常用的基因敲除技术[J]. 武夷科学, 2008, 23(1): 187-190.
[9] Buck B L, Azcarate‐Peril M A, Klaenhammer T R. Role of autoinducer‐2 on the adhesion ability of
Lactobacillus acidophilus[J]. Journal of applied microbiology, 2009, 107(1): 269-279.
[10] Tannock G W, Ghazally S, Walter J, et al. Ecological behavior of Lactobacillus reuteri 100-23 is affected by 215
mutation of the luxS gene[J]. Applied and environmental microbiology, 2005, 71(12): 8419-8425.
[11] Lebeer S, Claes I J J, Verhoeven T L A, et al. Impact of luxS and suppressor mutations on the gastrointestinal
transit of Lactobacillus rhamnosus GG[J]. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15): 4711-4718.
[12] Man L L, Meng X C, Zhao R H. Induction of plantaricin MG under co-culture with certain lactic acid
bacterial strains and identification of LuxS mediated quorum sensing system in Lactobacillus plantarum 220
[J]. Food Control, 2012, 23(2): 462-469.
[13] Landete J M, Arqués J L, Peirotén Á, et al. An improved method for the electrotransformation of lactic acid
bacteria: A comparative survey[J]. Journal of microbiological methods, 2014, 105: 130-133.
[14] Lebeer S, De Keersmaecker S C J, Verhoeven T L A, et al. Functional analysis of luxS in the probiotic strain
Lactobacillus rhamnosus GG reveals a central metabolic role important for growth and biofilm formation[J]. 225
Journal of bacteriology, 2007, 189(3): 860-871.
[15] Hoefnagel M H N, Starrenburg M J C, Martens D E, et al. Metabolic engineering of lactic acid bacteria, the
combined approach: kinetic modelling, metabolic control and experimental analysis[J]. Microbiology, 2002,
148(4): 1003-1013.
[16] Barthelmebs L, Divies C, Cavin J F. Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus 230
plantarum reveals the existence of two other inducible enzymatic activities involved in phenolic acid
metabolism[J]. Applied and environmental microbiology, 2000, 66(8): 3368-3375.
[17] Maldonado-Barragán A, Ruiz-Barba J L, Jiménez-Díaz R. Knockout of three-component regulatory systems
reveals that the apparently constitutive plantaricin-production phenotype shown by Lactobacillus plantarum on
solid medium is regulated via quorum sensing[J]. International journal of food microbiology, 2009, 130(1): 35-42. 235
[18] Lambert J M, Bongers R S, Kleerebezem M. Cre-lox-based system for multiple gene deletions and
selectable-marker removal in Lactobacillus plantarum[J]. Applied and environmental microbiology, 2007, 73(4):
1126-1135.
