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乳清蛋白-木糖美拉德反应产物对水包油乳
状液乳化稳定性及氧化稳定性的影响#
汪姣玲，李玥，徐菲菲，钟芳**
基金项目：国家 863 计划项目(2013AA100203 和 2013AA102207）
作者简介：汪姣玲(1989 年),女,硕士研究生,食品加工与配料方向
通信联系人：钟芳(1972 年),女,教授,食品加工与配料方向
（江南大学 食品学院, 无锡 214122） 5
摘要：主要考察乳清蛋白、加热乳清蛋白、加热乳清蛋白与木糖的简单混合物，和 3 种不同
程度的乳清蛋白-木糖美拉德反应产物对水包油乳状液乳化稳定性及氧化稳定性的影响。结
果表明：中等反应程度的样品（pH9，95℃，90min）具有较好的乳化活性和乳化稳定性,其
所形成的乳状液，油脂颗粒较小且均一，并带有相对较高的负电荷，不易聚集分层；POV 及10
TBARS 实验均表明此样品能够提供良好的氧化稳定性，减缓油脂的氧化；分布在界面上的蛋
白可能是通过物理屏蔽，静电斥力和清除自由基延缓了脂肪的氧化。
关键词：乳清蛋白；美拉德反应；乳化性；抗氧化性
中图分类号：
15
Antioxidation and emulsifying property of Maillard reaction
products from whey protein -xylose in oil-in-water
Emulsions
WANG Jiaoling, LI Yue, XU Feifei, ZHONG Fang
(School of food science,Jiangnan University,Wuxi 214122) 20
Abstract: The antioxidation and emulsifying property of Maillard reaction (MR) products from
whey protein -xylose in oil-in-water(O/W) Emulsions was investigated, containing whey protein,
heated whey protein, the mixture of heated whey protein and xylose, and three different degrees of
whey protein - xylose Maillard reaction products (MRPs). The results showed, the sample
produced from middle degree MR (pH9, 95℃, 90 min) had a good emulsifying activity and 25
emulsification stability, resulting in the small, uniform and stable droplets of its emulsion, with a
relatively high negative charge; The POV and TBARS experiments have proved that the sample
could provide a good oxidation stability, slow the oil oxidation; Through the physical shielding,
electrostatic repulsion and scavenging free radicals, the protein on the interface may delay the
oxidation of the fat. 30
Key words: Whey protein; Maillard reaction; Antioxidation; Emulsification
0 引言
乳清蛋白是一种营养丰富的全价蛋白质[1]，适合作为食品加工的基料，但是由于其某些
不良的理化特性，从而限制了其应用范围。因此，加强和改善乳清蛋白的功能特性，扩大乳35
清蛋白在各领域的应用范围，成为国内外科学家们研究的热点[2]。目前，国内外已釆用很多
方法改善乳清蛋白的功能特性，主要有酶法、化学法、物理法和基因工程法[3]。但这些方法
都不是很理想，例如，化学法会产生一些毒副作用[4]；酶法会导致大量苦味物质的生成[5]；
物理法易使功能特性降低[6]；基因工程法可能存在安全危害。然而，糖基化反应修饰技术不
仅能够改善乳清蛋内的功能特性，又因为反应不需化学试剂，安全性较髙，被认为是一种有40
效改善蛋白质功能特性的绿色方法[7]。研究发现，蛋白质与糖的接枝物对于外部环境因素具
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有较高的稳定性，与以次级力相结合的蛋白质-糖非共价复合物相比，其结合不受热或 pH 值
的影响[8]。目前，国内外众多学者已对乳清蛋白与糖类化合物的接枝反应进行了深入研究。
结果表明，由于亲水性糖链的共价接入，蛋白质分子的乳化性、溶解性、热稳定性等功能特
性均有显著的提高[9]。但是，利用糖基化反应修饰技术，在保持乳清蛋白乳化性的基础上，45
提高其抗氧化活性的研究几乎没有，更缺少相应的基础理论研究，亟待阐明乳清蛋白糖基化
反应的乳化及抗氧化机制[10]。
本课题拟以乳清分离蛋白为研究对象，利用还原糖与乳清蛋白发生糖基化反应，制备出
兼具强抗氧化活性和乳化活性的乳清蛋白糖基化产物。利用粒径分析仪及激光共聚焦显微镜
等仪器，结合理化试验，考察乳清蛋白糖基化产物在水包油乳状液的乳化稳定性和抗氧化稳50
定性，阐明糖基化反应修饰后的乳清蛋白在乳状液中的抗氧化机理，从而为新型、天然具有
抗氧化特性的乳化剂在食品中应用提供技术支撑。
1 材料与方法
实验材料与仪器
乳清蛋白分离物(WPI)：北京 Milky Way 商业公司；无抗大豆油：实验室自制；木糖、55
十二烷基硫酸钠、冰乙酸、异辛烷、碘化钾、硫代硫酸钠、可溶淀粉、硫代巴比妥酸、三氯
乙酸、BHA、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、乙醇、牛白蛋白、考马斯亮蓝 G250、甘油酸：上海国
药集团，试剂为分析纯级；实验中所用的水均为去离子水。
超级恒温槽：上海-恒科技有限公司；pH 计 EL20：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；
Ultra-Turrax T18 高速分散器：德国 IKa 公司；HPH2000/4-SH5 超高压均质机：德国 IKA 公60
司；CF16RXⅡ高速冷冻离心机：日本日立公司；UV-2800 紫外可见分光光度计：上海尤尼
柯仪器有限公司；Nano-Zs90 粒径分析仪：英国马尔文（Malvern）仪器有限公司；LSM710
型激光共聚焦显微镜：德国 Zeiss 公司。
实验方法
乳清蛋白-木糖复合物的制备 65
将乳清蛋白和木糖按照 3︰2（质量比）的比例溶于水中，制成总固形物质量浓度为 30 g/L
的溶液，在一定的起始 pH 值和一定温度下，恒温水浴反应一定时间取出样品，冰水浴中迅
速冷却，-4℃下储存备用。
通过前期实验，筛选出 6 个样品进行制备。分别为乳清分离蛋白（WPI）；加热乳清蛋
白（WPIH）；加热乳清蛋白与木糖的简单混合物（MIX）；低等反应程度的乳清蛋白-木糖70
美拉德产物（W1），在 PH8，75℃，90min 条件下获得；中等反应程度的乳清蛋白-木糖美
拉德产物（W2），在 PH9，95℃，90min 条件下获得；和高等反应程度的乳清蛋白-木糖美
拉德产物（W3），在 PH10，95℃，90min 条件下获得。
乳状液的制备
用磷酸盐缓冲液（10mmol/L，）稀释各反应物到蛋白浓度为 10mg/mL，再将 10wt%75
大豆油和 90wt%水相溶液用高速乳化均质机在 20,000r/min 下乳化 2min，再将乳化液用高
压均质机在 40MPa 均质两次，得到的乳状液加入 NaN3(%，w/v)作为抑菌剂。
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乳状液中乳化颗粒性质的表征
乳状液中乳化颗粒的性质用粒径和ζ -电位来表示。为了避免浓度过高而导致的多重散
射效应，用 磷酸缓冲盐溶液 ()将制备好的乳状液稀释 20 倍后进行测定。对不同80
pH 的乳状液，用相应 pH 的缓冲液进行稀释。测定时使用马尔文 Nano-Zs90 粒径分析仪。
乳状液形态和结构的表征
（1）乳状液外观的观察
取 30mL 制备好的乳状液分装于 40mL 带盖的玻璃瓶中在 30℃下保存，在不同贮藏时间
时取出用数码相机进行拍摄，记录下乳状液在放置过程中的外观变化。 85
（2）激光共聚焦显微镜
将制备好的乳化液适当稀释 2 倍，取 mL 稀释乳化液分别加入 20 μ L 蛋白染料 FITC
和 10 μ L 油的染料 Nile Red，漩涡震荡混匀后避光染色 20 min。取 10 μ L 染色后样品滴
在载玻片上，用硅油密封盖玻片边缘。FITC 激发波长为 488 nm，Nile Red 激发波长为 514
nm
[11] 。 90
乳状液的氧化
在氧气充足条件下，将乳状液分装在 40mL 带盖的玻璃瓶中，用铝箔纸包裹玻璃瓶以避
光，然后将盛有样品的瓶子放入隔水式培养箱中在 30℃下氧化。定期测定体系的过氧化物
值 (POV)和丙二醛反应物含量(TBARS)。
(1)POV 的测定参考 GB/T5538-2005 的相关方法。 95
取 3mL 乳状液和 50mL 乙酸/异辛烷(3:2)混合，加入 饱和碘化钾溶液，暗处振荡
1 分钟，立即加入 30mL 蒸馏水终止反应，加入 %淀粉溶液，用 Na2S2O3滴定至
蓝色消失。同时做空白。
POV(meq/kg)=1000(V-V0)c/m
其中 V 和 V0 分别是样品和空白所消耗的 Na2S2O3 的体积(mL)；c 是 Na2S2O3 的浓度100
(mol/L);m 是样品的质量(g)。
(2)TBARS 的测定方法参考 Mei 等人[12]的方法。
硫代巴比妥酸的配制： 硫代巴比妥酸，15g 三氯乙酸， 和
水混合，加入 3mL2%BHA 溶液(溶于乙醇)混匀。取 2mL 上述溶液， 样品以及
水混匀，在沸水浴中加热 15min，取出在自来水中冷却到室温，5000r/min 离心 25min，取105
上清液在 532nm 处比色。以 1,1,3,3-四乙氧基丙烷做标准曲线，确定样品中的 TBARS 值。
乳清蛋白-木糖复合物在乳状液中的分布
取 1ml 乳状液在塑料离心管中，25℃下 15000g 离心 45min，取下层乳清夜 15000g 再
次离心 30min，小心吸取取下层清液，合并多个塑料离心管样品中的清液并过 μ L 滤膜，
得到的滤液稀释到一定浓度用考马斯亮蓝法[13]测定蛋白含量。 110
蛋白在两相中的分配系数的计算参考 Hunag 等人[14]的方法，公式如下:
PC=Vw×（Wt/Ww-1）/V1
其中 Vw 表示水的体积(mL)；V1 表示油的体积(mL)；Wt 表示总的蛋白含量(mg/mL)；
Ww表示水相中的蛋白含量(mg/mL)。计算油的体积时所用油的密度(g/mL)为 。水相中
WPI 占总的 WPI 的比例计算公式为(Ww/Wt)×100%；界面上 WPI 所占的比例通过总 WPI115
和水相中 WPI 的含量之差计算。
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数据统计分析
所有实验经过至少三次重复(n≥3)。每次重复实验都在不同时间进行，且每次重复实验
都进行了三次平行实验。实验得到的数据用 分析。显著性分析采用最小显著性法
（LSD）检验，p< 认为差异显著。 120
2 结果与分析
乳清蛋白-木糖复合物乳状液的显微镜结构
图 1 不同 MRPs 制备的乳状液的激光共聚焦显微图
Fig. 1 Confocal micrograph of samples of six O/W emulsions under 10x40 micro lens, prepared with native 125
whey protein isolate (WPI), heated whey protein (WPIH), the mixture of heated whey protein and xylose (MIX),
the low degree MRPs (W1), the middle degree MRPs (W2), and the high degree MRPs (W3) respectively
蛋白质具有双亲结构，即亲水性基团和亲油性基团同时存在于蛋白质分子之中，这种特
殊的结构决定了蛋白质具有表面活性，在实际应用中我们称之为乳化性能。乳清蛋白是一种
天然高分子乳化剂，具有良好的两亲性，即具有良好的乳化能力[15]。与小分子的单糖和双130
糖相比，尽管引入空间位阻较大的多糖能够对蛋白质的乳化特性带来显著的改善，但其接枝
难度大，反应活性较差，并且很难产生抗氧化活性物质，如类黑素等美拉德反应高级阶段产
物[16]。因此，考察乳清蛋白-木糖复合物在乳状液中的性质，首先要得到相对较为稳定的乳
状液。
由图 1 可以看到，中等反应程度下所获得的 W2 样品，可以将大豆油较好的分散在水溶135
液中，油脂颗粒较小且均一。但是，反应程度较低（如 W1）和反应程度过高（如 W3）的
美拉德反应产物（MRPs）都会产生一定的分层现象，且颗粒大小不均一。从图 1 我们还可
以发现，原料 WPI 已具有很好的乳化性能，而加热后的乳清蛋白（WPIH）使油脂颗粒变大，
出现明显的分层现象。以加热乳清蛋白与木糖的简单混合物（MIX）作为乳化剂制备的乳液，
稳定性最差，乳液颗粒容易发生聚集，絮凝和分层从而导致乳状液发生相分离。这或许是因140
为 WPI 和木糖的美拉德反应的特殊性所决定的，乳清蛋白在反应初期，温度升高导致蛋白
聚集现象的发生，故而乳化性能下降。随着程度加深，木糖以共价键形式接入乳清分离蛋白
肽链中后，蛋白质的表面疏水性降低，乳化能力有所提升，同时乳清蛋白一定程度的降解，
小肽或蛋白质发生了交联，一些糖和糖降解产物与蛋白反应所生成的产物也具有较好的乳化
能力。而随着反应程度的继续加深，美拉德产物会发生环化和降解等反应，导致分子量差别145
增大，从而影响产物的乳化能力。
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乳清蛋白-木糖复合物乳状液乳化稳定性
图 2 不同 MRPs 制备的乳状液的平均粒径、分散度 PDI 及 Zeta 电位
Fig. 2 Z-average diameter (Dz) and particle size distribution (PDI) (A), and ζ-Potential (B) of six O/W 150
emulsions prepared with WPI, WPIH, MIX, W1, W2, and W3 respectively
由图 2 可见，中等反应程度的 W2 样品所形成的乳状液的平均粒径最小，分散指数 PDI
值最小，Zeta 电位的绝对值最大，粒径均一，分布均匀。而样品 W1 与 W3 形成的乳状液颗
粒较大，粒子分散不均匀，Zeta 电位绝对值较低。这与图 1 中所得结论一致，进一步验证了
不同反应程度下的美拉德产物所得到的乳状液性质的差异。此外，Zeta 电位的数据还表明所155
有这些乳状液颗粒的表面都带有一定量的负电荷[17]。这些带负电荷的界血膜蛋白能够和带
正电的促氧化过渡金属离子发生静电相互作用，从而钝化过渡金属离子，对乳状液中油脂氧
化起到一定的抑制作用。
图 3 pH 对不同 MRPs 制备的乳状液平均粒径的影响 160
Fig. 3 The effect of pH on the z-average diameter (Dz) of six O/W emulsions prepared with WPI, WPIH,
MIX, W1, W2, and W3 respectively
如图 3 所示，在乳清蛋白的等电点附近（pH4~6），原料 WPI 所形成的乳状液均表现
出粒径增大、分层等脱稳现象，而 WPI-木糖复合物（W1，W2，W3）所形成乳状液的粒径
均没有显著变化，对 pH 表现出良好的乳化稳定性；在 pH=3 和 pH6~11 时，各乳状液全部165
具有高的稳定性。这是由于在等电点附近，一方面蛋白质的溶解度降低，从而导致其乳化能
力的下降，另一方面蛋白表面的电荷量降低，使得粒子间的静电排斥力下降，此时的乳状液
易发生絮凝或聚合，表现为乳状液粒径增大。但经过木糖糖基化后的乳清蛋白，其二级结构
发生变化，空间位阻效应增加，促使蛋白构象更加稳定。当 pH 远离等电点时，乳状液带负
电荷（pH=3）或带正电荷（pH≥6），此时乳液粒子之的间排斥力将大于相互吸引的范德华170
力，难以相互凝聚，从而使乳状液具有较高的稳定性[18]。
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乳清蛋白-木糖复合物乳状液氧化稳定性
图 4 不同 MRPs 制备的乳状液在储藏过程中 POV 值和 TBARS 值的变化
Fig. 4 Formation of POV and TBARS during storage (30 °C) of six O/W emulsions prepared with WPI, 175
WPIH, MIX, W1, W2, and W3 respectively
为研究乳清蛋白-木糖复合物对乳状液氧化稳定性的影响，选取过氧化物值（POV）和
丙二醛反应物值（TBARS）为评价指标。其中，POV 反映了油脂氧化的初级产物含量，TBARS
则反映了油脂氧化的次级产物含量。同时使用这两种评价指标，能够较为准确地考察油脂氧
化的程度。 180
由图 4 不难发现，随着贮藏时间的增加，6 个样品的乳状液的 POV 和 TBARS 值都呈现
增加趋势。通过美拉德反应，引入木糖分子的样品全部表现出较好的抗氧化性质，与未接枝
的样品相比，差异显著（P<）。这是由于乳清蛋白和木糖通过美拉德反应，能产生类黑
素等活性物质，可以清除自由基，螯合金属离子，并具有一定的还原力，从而延缓油脂的氧
化[19]。样品 W1 的反应程度较低，生成的抗氧化活性物质相对较少，因此其乳状液的 POV185
和 TBARS 值比样品 W2 和 W3 的高，氧化稳定性不佳。此外，尽管样品 MIX 与样品 WPI
和 WPIH 相比，乳化稳定性表现一般（上文中所述），但其氧化稳定性相对表现不错。这或
许是由于木糖的特殊性所导致的，木糖为小分子五碳糖，反应活性高，在较低的温度下，也
能够缓慢的发生反应，产生抗氧化活性物质，提高乳状液氧化稳定性。
乳清蛋白-木糖复合物在乳状液中的分布 190
表 1 MRPs 在乳状液水相中和界面膜上蛋白分布比例
Tab. 1 Partition of MRPs in the aqueous phase versus at the interfacial membrane of emulsions
样品 水相中蛋白（%） 界面上蛋白（%） 分配系数(油相/水相)
WPI ± a ± c
WPIH ± a,b ± b,c
MIX ± b,c ± a,b
W1 ± b,c ± a,b
W2 ± c ± a
W3 ± c ± a
注：abc表示同一列中显著性差异(P<)，数值表示为均值±标准偏差(n=3)。
在乳状液中，蛋白质在乳状液中的分布与其乳化特性和抗氧化性之间都存在一定的联系
[20]。从表 1 中可以看出，大部分乳清蛋白及糖基化产物分布在水相中，而只有少部分分布195
在油水界面上(19~22%)。其中，原料乳清蛋白（WPI）在界面上分布的为 %；中等反
应程度的 W2 样品在界面上分布的比例最高，达到了 %。尽管原料乳清蛋白在界面上
的含量最低，但其乳化特性在 6 个样品中却有着不错的表现，这说明了蛋白的乳化性质是有
多种因素共同决定的。
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研究乳状液的氧化稳定性，通常还需要考察蛋白在界面上的组成，因为油脂氧化后产生200
的一些过氧化物质，这些物质会富集在乳液的油水界面上，而乳液氧化产物的降解又常常先
发生在此界面上，因此要改变脂肪氧化速率能够通过改变界面上的组成来实现 [21]。乳清蛋
白经过美拉德改性，其产物分子量分布变宽，大分子量物质更多的吸附在油水界面上，可以
形成有效的阻隔层，起到物理屏障的作用。此外，吸附在界面上的 MRPs 带有较高的负电荷，
能够形成较强的静电斥力，阻止油滴聚集，和较强的亲和过渡金属离子的静电作用，阻止过205
渡金属离子与过氧化物的接触。由于乳状液中的油滴属于非连续性分布，自由基的传递需要
通过连续相的水来进行，因此在水相中分布的 MRPs 也可以通过阻碍自由基的传递，从而起
到很好的阻断脂肪氧化的作用[22]。MRPs 还可以通过自身的自由基清除能力，金属离子鳌合
能力和还原能力来阻断油脂的氧化途径，从而延缓初级氧化产物的降解，减少次级产物的生
成，抑制油脂氧化。 210
3 结论
本文给出了以下结论：通过美拉德反应使乳清蛋白与木糖分子发生共价结合，能够有效
地改善乳清蛋白的乳化性及抗氧化性，从而改善水包油乳状液的乳化稳定性及氧化稳定性。
随着美拉德反应程度的加深，抗氧化能力与乳化能力也随之增强，即乳状液的氧化及乳化稳
定性提升；但反应进行到一定程度后，氧化稳定性继续提升，而乳化稳定性则下降。此外，215
美拉德产物对乳状液的抗氧化机制，一方面是通过产物自身的抗氧化能力，即依靠还原能力，
清除自由基及螯合金属离子；另一方面是通过间接的作用，即在界面上的蛋白依靠物理屏蔽
和静电作用，水相中的蛋白则依靠阻隔自由基的传递，来延缓脂肪的氧化。
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