关于合成多肽药物中非对映异构体杂质的研究 123ूࡹđྷѢᇨđࡹდ(1.国家食品药品监督管理局药品审评中心，北京 100038；2.清华大学医院，北京 100850；3.解放军302医院，北京 100039) 摘要：目的 ฐษ؟ᥴކӮᇏ٤ؓ႘ၳܒุᄖᇉ֥࣮ބ॥ᇅb方法 ࢺക؟ᥴކӮᇏμࠎූཨ࿈֥ࠏᇅđՖކӮჰਘᇉਈ॥ᇅa۽ၜݖӱ॥ᇅބҩٚم࿊ᄴ֩ٚ૫ิ܂Ⴕၭࡹၰb结果 ҆ٳμࠎූཨ࿈Ӂള֥٤ؓ႘ၳܒุᄖᇉ൞ކӮ؟ᥴူႵܱᇉ࣮֥ᇗေଽಸᆭ၂b结论 ႋᇗ൪٤ؓ႘ၳܒุᄖᇉ֥࣮ބ॥ᇅb 关键词：ކӮ؟ᥴĠཨ࿈Ġ٤ؓ႘ၳܒุ 中图分类号： 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2010)05-0387-03 Control of the Diastereoisomeric Impurities in Synthetic Peptide Drugs 123KANG Jianlei, XU Bingzhu, LI Jianyu( for Drug Evaluation, SFDA, Beijing 100038, China; University Hospital, Beijing 100084, China; Hospital PLA, Beijing 100039, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To discuss the research and control of diastereoisomeric impurities in synthetic peptide drugs development. METHODS The racemic mechanisms during a peptide-bond-forming reation were introduced, recommendations were provided on quality control of synthetic materials, control of manufacturing process, and choice of analytical methods. RESULTS Diastereoisomers are important part of related substances in synthetic peptide drugs development. CONCLUSION More attention should be paid to the research and control of diastereoisomeric impurities. KEY WORDS: synthetic peptides; racemization; diastereoisomers 1963年，美国著名生物化学家Bruce 直接烯醇化机制 发明了多肽固相合成法，经过四十多年的发展，直接烯醇化机制见图1。在肽缩合条件下，碱催化的烯醇化机制(A)起重要作用，消旋速率依赖固相合成法已广泛应用于多肽和蛋白质的研究领于活化羧基α位质子的酸性、溶剂、温度及碱的域。固相合成法的基本原理是以连接于固相载体化学性质，氨基酸α位质子的酸性取决于取代基的第一个氨基酸为起点，经活化、耦合、脱保护的性质。 的循环过程，将保护氨基酸逐一“组装”形成目R标肽。由于氨基酸多为手性分子(甘氨酸除外)，在YX(A)－N肽合成的过程中不可避免的存在消旋化的可能，RHORYX+这可能导致肽分子部分甚至全部立体化学信息的YXBHB ++NNHORHO丢失。由于肽类药物的生物活性与其立体构型密YXN切相关，因此应对多肽合成中的氨基酸消旋化以HO－ (B)及非对映异构体杂质进行研究和控制，而非对映RRRRYXYXYX异构体杂质(特别是差向异构体杂质)的色谱行为YXNNNNHOHHOHOHHO+多与主成分非常接近，常规的有关物质检查方法++++－HAAHAHA 通常并不能将其良好检出，国内研究人员常常忽图1 活化的氨基酸和肽的碱催化消旋机制(A)和酸催化视此类杂质的研究，笔者将介绍多肽合成中氨基消旋机制(B) 酸消旋化的机制，并对非对映异构体杂质的控制αX−活化基；Y−肽链中的N保护基；B−碱；HA−酸；R−氨基酸侧链 Fig 1和研究中应注意的问题进行探讨。 Mechanisms of base-catalyzed (A) and acid-catalyzed epimerization (B) of activated amino acid and peptide 1 肽合成中氨基酸消旋化的机制 derivatives 多肽合成中氨基酸的消旋化主要有以下两种αX−activating group; Y−N-protecting group of peptide chain; B−base; [1]机制：HA−acid; R−amino acid side chain
5(4H)-噁唑酮机制 活化基X的活化能力及N-酰基R1-CO-的电子特征密5(4H)-噁唑酮机制见图2。5(4H)-噁唑酮(D/L-4)切相关。在此过程中，从L-型氨基酸形成的噁唑酮是由氨基酸活化产生，是多肽合成的重要活性中间L-4处于L-4，5和D-4的互变平衡之中。肽缩合反体，同时，由于其立体化学不稳定，也是氨基酸消应的消旋程度取决于噁唑酮的形成能力和它的氨解旋化的主要原因。形成噁唑酮的倾向与化合物1中速度，氨基组分的亲核能力/碱性也是一个重要因素。 图2 经由5(4H)-噁噁噁的消旋机制 R1−烷基，芳基和烷氧基；R2，R3−氨基酸侧链；B−碱；X−活化基 Fig 2 Racemization via 5(4H)-oxazolone formation R1−alkyl, aryl or alkoxy residue; R2, R3−amino acid side chain; B−base; X−activating group 2 非对映异构体杂质的控制和研究中应注意的当肽链中含有His，Cys，Phe等易消旋的氨基问题 酸时，更应注意对合成工艺进行研究，可考虑在 加强起始物料的质控 此易消旋氨基酸的缩合步骤，另采用D-构型的氨合成多肽的各手性中心直接来源于合成起始基酸制备差向异构体对照品，通过适宜的色谱条原料——各种保护氨基酸，因此应注意对合成起始件检验目前工艺条件下此氨基酸的消旋程度，以[2-3]原料光学纯度的质控，从源头进行控制。目前国指引此步骤氨基酸缩合工艺的优化改进。曾有申内注册申请人通常在起始原料的内控标准中仅对报单位对一个4肽片断(NH-His-Gly-Glu-Gly- 2比旋度进行控制，由于比旋度检查方法在专属性、COOH)固相合成中His缩合步骤的消旋情况进行灵敏度方面的限制，此项指标并不能有效的控制氨了研究，通过采用高效的缩合试剂、增加基酸的光学纯度，对于比旋度数值较小的保护氨基Fmoc-His(Trt)-OH的投料量的方式，加快肽键缩合酸更是如此，如Fmoc-Glu(OtBu)-OH为+˚ (±˚) 的速度，降低His消旋的风险，实测结果显示可将(C=1，乙酸乙酯)、Fmoc-Gln(Trt)-OH为−˚ (±˚) His的消旋程度降低一半左右。 (C=1，甲醇)。因此，建议采用专属性强的手性 选择合适的检测方法 对起始原料的光学纯度进行控制。 与其他合成药物的有关物质研究相同，合成 注意工艺过程的控制 多肽中非对映异构体杂质也可采用HPLC进行检多肽合成中肽键的形成与消旋是相互竞争查，最常用的是反相色谱(RP-HPLC)系统，采用[4]的，因此应结合消旋的机制，注意氨基酸侧链保C，C或C柱等。齐崴等采用C柱、水(% 188418护基、缩合试剂的选择，以及投料比、反应条件TFA)和乙腈( % TFA)梯度洗脱的色谱系统对使的考察，尽量降低消旋的程度。 用HBTU/Fmoc固相法合成的七肽HN-PFNSLAI- 2·388· Chin JMAP, 2010 May, 中国现代应用药学2010年5月第27卷第5期
COOH进行了研究，通过色谱条件的优化，可将4见国外研发机构使用类似方法控制合成多肽药物[6]种非对映异构体良好分离，并经MS进行了初步的的光学纯度，并且可以此为考察指标指引制备工鉴定研究。 艺的优化改进。 但随着肽链的增长，少数氨基酸消旋产生的非3 小结 对映异构体杂质采用反相色谱系统常常无法有效部分氨基酸消旋产生的非对映异构体杂质是检出，建议可根据产品的性质尝试考察其他不同原合成多肽药物中有关物质的重要组成部分，目前理的色谱系统，如离子交换色谱、毛细管电泳法国内研发人员多忽视此类杂质的研究和控制，希(HPCE)等。某多肽创新药物(30 肽以上)在研发的早望通过本研究引起同业人员对多肽合成中氨基酸期，采用RP-HPLC测定样品纯度为%，而采消旋问题的重视，加强源头(起始原料质控)和工艺用强阳离子交换色谱法(SCX-HPLC)测定纯度过程的控制，并采用适宜检查方法对非对映异构仅 %，其中His差向异构体杂质(相对于主峰的体杂质(多肽光学纯度)进行研究。 保留时间为)高达%，后经制备工艺的改进REFERENCES 优化，His差向异构体杂质得到了良好的控制。非[1] SEWALD N, JAKUBKE H D. Peptides: Chemistry and 对映异构体杂质通常较难分离，因此有关物质方法Biology [M]. Weinheim: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. 研究中也可作为色谱系统专属性验证的内容之一。 KGaA, 2002. [5][2] SFDA. Guidance on Chemistry, Manufacturing, and Controls Goodlett等采用HPLC-MS对多肽的光学纯Studies for Synthetic Peptide Drugs. (国家食品药品监督管理度进行测定。首先，多肽在DCl/CDCOOD中进3局. 合成多肽药物药学研究技术指导原则) [S]. 2005. [3] FDA. Guidance for Industry for the Submission of Chemistry, 行水解，再采用N-a-(2,4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨Manufacturing, and Controls Information for Synthetic Peptide 酰胺(FDAA，Marfey’s试剂)对水解后的氨基酸进Substances [S]. 1994. 行衍生化，使用普通的RP-HPLC或GC即可将衍[4] QI W, JIA C X, HE Z M, et al. Analysis of racemization products of synthetic heptapeptide by reversed phase high 生化后的D和L-构型的氨基酸良好分离，从而可performance liquid chromatography/mass spectrometry [J]. 检测多肽中消旋氨基酸的含量。使用氘(D)代试剂Chin J Anal Chem(分析化学), 2006, 34(9): 1244-1248. [5] GOODLETT D R, ABUAF P A, CROWTHER J B, et al. 进行水解是非常必要的，因为水解过程中产生的Peptide chiral purity determination: hydrolysis in deuterated 消旋氨基酸的α位质子为D，通过ESI-MS检测可acid, derivatization with Marfey’s reagent and analysis using high-performance liquid chromatography-electrospray 将多肽中原本的消旋氨基酸与水解过程中产生的ionization-mass spectrometry [J]. J Chromatogr A, 1995, 消旋很好的进行区分。研究者以胸腺五肽及其有707(2): 233-244. [6] ERMER J, GERHARDT J, SIEWERT M. Quality control of 关物质为例对检查方法进行了详细说明。此方法peptide drugs. Chiral amino acid analysis versus standard for 的优点在于专属性良好，且应用范围广泛，方法icatibant acetate [J]. Arch Pharm, 1995, 328(9): 635-639. 收稿日期：2009-12-08建立后可对各种肽类药物进行检测。审评中已常 《中国现代应用药学》网上投稿补充说明 《中国现代应用药学》在线编辑系统()自2009年1月1日正式投入使用以来，不但提高了编辑部的工作效率，也为作者投稿、查稿带来了很大的便利，受到了广大作者的欢迎。现就网上投稿有关事项作一说明，以便保证网上投稿系统正常运行。 1、作者在网络投稿前必须仔细阅读我刊投稿指南，投稿前请至下载已发表的文章阅读，并参照其格式书写。 2、投稿时请您务必准确详细地填写姓名、单位、所在科室、职称、通讯地址、邮政编码、联系电话、E-mail等。 3、网络投稿后，请将稿件处理费(每篇50元)通过在线支付系统在线缴纳，也可通过邮局汇款，汇款单上务必注明第一作者姓名及发票抬头。同时，请向编辑部邮寄单位介绍信、基金证明。 Chin JMAP, 2010 May, ·389· 中国现代应用药学2010年5月第27卷第5期
