第九章第九章 食品中食品卫食品中食品卫
生微生物的测定生微生物的测定
一、食品微生物检验的意义
食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。
(1)它是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检
食品能否食用的科学依据之一。
(2)通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫
生环境，能够对食品被细菌污染的程度做出正确的评价，为各
项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食
物中毒的防治措施。
(3)食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可
以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民
的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证
出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。
第一节 概述
二、食品微生物检验的种类
1、感官检验：通过人的感官检定，看食品的色泽、
气味、口味是否正常，有无霉变和其他异物污染。
2、直接镜检：包括菌体镜检和显微计数两种方法。
菌体镜检是直接对送检样品进行镜检；显微计数是
在显微镜下直接计算菌液中微生物数量的方法，可
以直接测定受检样品的带菌量。
3、培养检验：根据食品的特点和分析目的选择适
宜的培养方法求的带菌量。
第一节 概述
三.样品的采集
第一节 概述
（一）采样的目的和意义
1. 便于食品卫生质量监督管理
2. 鉴别食品中是否存在有毒有害物质。
3. 为新产品、新资源利用、新食品化工产品、
新工艺投产前进行卫生鉴定。
第一节 概述
（二）样品的种类
1. 大样，就是一整批；
2. 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，
一般为200g；
3. 小样，也称检样，做分析用的，一般为
25g。
第一节 概述
（三）采样的步骤
采样前调查→现场观察→确定采样方案→采
样 →样品封存 →开具采样证明
第一节 概述
（四）采样的要求
1、严格遵守样品采集的操作规程。
2、所采样品必须具有代表性。
3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。
4、不得加入防腐剂、固定剂等。
5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。
第一节 概述
（五）食品微生物检验采样方法
采样原则：
能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆
开包装取样的应按无菌操作进行取样.
第一节 概述
1、液体样品采样方法
充分混匀后，无菌操作打开包装，用
100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.
第一节 概述
2、半固体样品采样方法
无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖
取样品，放入无菌容器。
第一节 概述
3、固体样品采样方法
大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，
并注意其代表性；
小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，
放入无菌容器。
若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检
验食品品质的情况，应从深部取样。
第一节 概述
4、冷冻食品采样方法
大包装小块冷冻食品按小块个体采取；
大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌
手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。
若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验
食品品质情况，应从深部取样。
第一节 概述
5、生产工序监测采样
① 车间用水：从车间各龙头采样；
② 车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：
用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面
积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容
器中。
③ 车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板
分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，
然后盖盖送检
第一节 概述
（六）采样标签的填写
标签主要内容：
编号、样品名称、生产单位、生产日期、
产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、
采样人姓名，现场情况。
第一节 概述
×××××采样单
样品编号：━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━产品名称
（商品名）______规格型号__________注册商标_____________生产厂家
_______________通讯地址__________邮政编码□ □ □ □ □ □受检地点
_______________通讯地址__________邮政编码 □ □ □ □ □ □采样地点
_______________采样日期__________采样基数______________生产日期
_______________批 号__________产品依据标准__________有效成分及含量
____________________________________________________________检验目地
________________检测项目_____________________________
采样人仔细阅读以下句子，然后签字 我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被
该采样单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。
代表单位（章） 代表单位（章）
签字 签字
日期 年 月 日 日期 年 月 日
备 注
第一节 概述
四.样品的送检要求
1、要快速运送：不要超过3小时；
2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；
3、要注意防污染、防散漏、防变质；
4、要填写检验申请单。
第一节 概述
五.样品的处理方法
（一）液体样品
（二）固体样品
（三）冷冻样品
第一节 概述
(一)液体样品的处理
1. 瓶装液体样品的处理
2. 盒装或软塑料包装样品的处理
第一节 概述
1.瓶装液体样品的处理
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸
或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启
开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口
勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸
出后，取样25mL检验。
第一节 概述
2.盒装或软塑料包装样品的处理
将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子
剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在
剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌
容器中再取样25mL检验。
第一节 概述
（二）固体样品的处理
1. 捣碎均质法
2. 剪碎振摇法
3. 研磨法
4. 整粒振摇法
5. 胃蠕动均质法
第一节 概述
1.捣碎均质法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中
取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯
中，8000~10000r/min均质1~2min即可。
第一节 概述
2.剪碎振摇法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取
25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和
直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，
用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
第一节 概述
3.研磨法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检
样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL
无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。
第一节 概述
4.整粒振摇法
直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释
液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧
瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于
40cm。
第一节 概述
（三）冷冻样品
冷冻样品，先将中样在0~4 ℃下解冻，
时间不能超过18h，或在45 ℃下解冻，
时间不能超过15min。再取检样25g做
稀释处理。
第一节 概述
六、食品卫生微生物检验指标
一）菌落总数
二）大肠菌群
三）致病性微生物
第一节 概述
1、细菌总数
指一定数量或面积的食品样品．经过适当的处理
后，在显微镜下对细菌进行直接计数。其中包括各
种活菌数和尚未消失的死菌数。细菌总数也称细菌
直接显微镜数。通常以1g或1mL或1cm2样品中的细菌
总数来表示。
第一节 概述
第一节 概述
1）食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度
新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由
于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有
所不同。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度
就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。相反，
食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，
食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。
第一节 概述
2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间
一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，
食品耐放时间就越短，例如用O℃保存牛肉，菌落总
数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落总数增
至lO5cfu／cm2时则只能保存7天。另外，用0℃保存
鱼时，菌落总数为105cfu／cm2时可保存6天．而菌
落总数在103cfu／cm2时则可保存12天。
第一节 概述
3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况
一般认为日常食品的活菌数为104～107cfu／g。而当
活菌数达到108cfu／g则可认为处于初期腐败阶段。
例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到
×103cfu／cm2。而加工后马上检测可达
×104cfu／cm2。当菌落数为107cfu/cm2时表示确
已经腐败，鸡肉的细菌数达108cfu／cm2时可有气味
并变粘。
一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败变质
过程的进程，甚至可能引起食用者的不良反应。
第一节 概述
2、大肠菌群
大肠菌群系指一群在36℃条件下能发酵乳糖、产酸、
产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。
从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性
均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌
属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等．以埃希氏菌属
为主，
大肠菌群MPN（most probable number,MPN）是指在
1ml(或1g)食品检样中听含的大肠菌群的最近似或最
可能数。
第一节 概述
大肠菌群可作为粪便污染食品的指标菌；
1）大肠菌群主要来源于人及温血动物粪便、
人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方
。微量粪便污染不可能以化学方法检查出来，
在食品中大肠菌群的存在即使少量也很容易
而且准确的被检出。
2）大肠菌群可作为肠道致病菌污染食品的指
标菌
第一节 概述
3.致病菌
食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总
之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可
能污染食品。（以乳制品为例）
1）能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物：
沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口
蹄疫病毒等。
2）能产生毒素并引起食物中毒的微生物：
肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些
真菌，都会产生毒素。
第一节 概述
菌落总数测定——菌落总数的概念
菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积
（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养
基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数
第二节 菌落总数的测定
一、设备与材料
冰箱
恒温培养箱
恒温水浴锅
均质器或灭菌乳钵
药物天平
菌落计数器
放大镜
灭菌吸管 …….
第二节 菌落总数的测定
二、培养基和试剂
营养琼脂培养基
磷酸缓冲液
%灭菌生理盐水
75%乙醇
第二节 菌落总数的测定
三、培养程序
第二节 菌落总数的测定
四、操作步骤
1.检样稀释及培养
（1）以无菌操作，将检样25g（或25mL）剪碎以后，
放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻
璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳
钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以
8000r/min-100000r/min的速度处理1min，做成1：
10的均匀稀释液。
第二节 菌落总数的测定
（2）用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁
徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释的试管内
（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振
摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。
（3）另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍
递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL
灭菌吸管。
（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估
计，选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释
的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭
菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
第二节 菌落总数的测定
（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46 ℃ 营养
琼脂培养基[可放置在（（46±1）℃）水浴锅内保
温]注入平皿15mL-20mL，并转动平皿使混合均匀，
同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样
品）的灭菌平皿内作空白对照。
（6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃恒
温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目
乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。
第二节 菌落总数的测定
样品稀释程序样品稀释程序
第二节 菌落总数的测定
2.菌落计数方法
做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要
时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板
的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌
落总数
第二节 菌落总数的测定
3.菌落计数的报告
①平板菌落数的选择
选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一
个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状
菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平
板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半
个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长
时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌
落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌
落计。
第二节 菌落总数的测定
②稀释度的选择
a.应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释
倍数报告之。
b.若有两上稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，
则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告
其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。
c.若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按稀释度最
高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
d.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度
最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
e.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释
倍数报告之。
第二节 菌落总数的测定
f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中
一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落
数乘以稀释倍数报告之。
③菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采
用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入
方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表
示。
第二节 菌落总数的测定
第二节 菌落总数的测定
第二节 菌落总数的测定
大肠菌群系指一群在36℃条件下能发酵乳糖、产酸、
产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。
大肠菌群数MPN（most probable number,MPN）是指
在100ml(g)食品检样中听含的大肠菌群的最近似或
最可能数。
第三节 大肠菌群的测定
一、乳糖发酵法
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接
种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；
1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，
每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱内，培养
24+2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，
则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按
下列程序进行。
第三节 大肠菌群的测定
设备和材料：
恒温培养箱（36℃±1℃ ）、恒温水浴锅
（46℃±1℃ ） 、电子天平、显微镜
（10×~100×）、灭菌培养皿、灭菌试管。
培养基及试剂：
乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂平
板（EMB）、%灭菌生理盐水、革兰氏染色液。
第三节 大肠菌群的测定
第三节 大肠菌群的测定
1.检验程序
2.操作步骤
(1)检样稀释
a．以无菌操作将检样25克(或25毫升)放于含有225毫升灭菌生理盐水或
其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，
经充分振摇或研磨作成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以
8000～10000r／分钟的速度处理1分钟作成1∶10的均匀稀释液．
b．用1毫升灭菌吸管吸取1∶10稀释液1毫升，注入含有9毫升灭菌生理盐
水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，作成l∶100的稀释液。
c．另取1毫升灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀
释—次，换用—支1毫升灭菌吸管。
d．根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，
每个稀释度接种3管。
第三节 大肠菌群的测定
(2)乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1毫
升以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1毫升及1毫升
以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3
管，置36士1℃温箱内，培养48士2小时，如所有乳
糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠菌群阴性，
如有产气者，则按下列程序进行。
第三节 大肠菌群的测定
（3）分离培养
将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，置
36±1℃温箱内培养18—24小时，然后取出，观察菌落形态，
并作革兰氏染色和证实试验。
（4）证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰
氏染色。同时接种乳糖发酵 管，置36±1℃温箱内培养24+2
小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴
性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
（5）报告
根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表，报告
每100mL（g）大肠菌群的最近似数(MPN)。
第三节 大肠菌群的测定
第三节 大肠菌群的测定
二、ＬＴＳＥ快速检验法
１．原理
不同的细菌以不同途径分解糖类，在其代谢过程中
均能产生丙酮 酸及转变为各种酸类，大肠菌群能分
解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作 用于甲酸，产生氢
和二氧化碳气体，因此气体的产生是在产酸的同时
进一步分解酸而形成的。根据这个原理，将样品接
种到LTSEBOth内15h， 看结果有无产气现象，然后
加氧化酶试验和涂片革兰氏染色镜检结果 综合判断
是否有大肠菌群的存在。
第三节 大肠菌群的测定
仪器与材料
高压蒸气灭菌器 干热气菌箱 恒温箱
天平 均质器 显微镜 冰箱 接种环
载玻片 试管、童汉氏小管、刻度吸管等，置于干
热灭菌箱中160℃ 灭菌2h。
培养基和试剂
LTSE培养基肉汤（1号） 氧化酶试剂 革兰氏染
液
本方法中，除化学纯（BR）生化试剂外，所用的化
学 试剂为分析纯（AR）；试剂用水为蒸馏水。
第三节 大肠菌群的测定
2.操作步骤
第三节 大肠菌群的测定
一、沙门氏菌检验
1.沙门氏菌及其食品卫生学意义
沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏
期一般6-72小时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头
痛。病程一般1～2天或更长。感染剂量为15～20个菌，死亡率达1～4%。
最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。
污染源主要是人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类
和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设
施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品中，
包括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙
拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，
可可和巧克力
第四节 常见致病菌的测定
2.沙门氏菌检验流程
检样
前增菌法 直接增菌法
冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品
25g ＋ BP 225mL 25g ＋灭菌生理盐水25mL 制成检样均质液
（36±1）℃ 一般 4 h，干蛋品 18～24 h
10mL＋MM(或TTB)100mL 10mL＋SC 100mL 检样均质液的半量＋MM(或TTB)100mL 检样均质液的半量＋SC 100mL
42℃ 18～24 h （36±1）℃ 18～24 h 42℃ 18～24 h （36±1）℃ 18～24 h
BS DHL(或HE、WS、SS)
（36±1）℃ 40～48 h （36±1）℃ 18～24 h
挑取可疑菌落
TSI（斜面、底层、产气、H2S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（）、KCN、赖氨酸
H2S＋靛基质－ H2S＋靛基质＋ H2S－靛基质－ 非如左述的
尿素－KCN－赖氨酸＋ 尿素－KCN－赖氨酸＋ 尿素－KCN－赖氨酸＋/－ 各种反应结果
甘露醇、山梨醇 ONPG
沙门氏菌血清学实验 沙门氏菌血清学实验 非沙门氏菌 非沙门氏菌
报告
3.操作步骤
1）前增菌和增菌
冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取
25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内。固体食品
可先应用均质器以8000～ 10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨
碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±1℃培养4h (干蛋
品培养18h～24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫
酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18h～ 24h。同时，另取10mL，转种于
100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃培养18h～24h。
鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取
25g(25mL)加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接
种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培
养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于36℃±1℃
培养18h～24h。
第四节 常见致病菌的测定
2）分离
取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板
和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平
板)。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。
于36℃±1℃分别培养18h～24h(DHL、HE、WS、SS)
或40h～48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。
第四节 常见致病菌的测定
沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板 沙门氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 沙门氏菌Ⅲ（即亚利桑那菌）
BS琼脂
产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕
褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色
或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成
灰绿色的菌落，周围培养基不变
黑色带有金属光泽
DHL琼脂
无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色
或几乎全黑色
乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚
属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳
糖阳性的菌株为粉红色，中心带
黑色
HE琼脂
WS琼脂
蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌
落中心黑色或几乎全黑色
乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑
色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性
或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，
中心黑色或几乎全黑色
SS琼脂
无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落
中心带黑色，但不如以上培养基明显
乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚
属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳
糖阳性的菌株为粉红色，中心黑
色，但中心无黑色形成时与大肠
埃希氏菌不能区别
第四节 常见致病菌的测定
3）生化试验
自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接
种三糖铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验)、尿素琼脂
()、氰化钾(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养
基及对照培养基各1管，于36℃±1℃培养18h～24h，必
要时可延长至48h，按生化反应初步鉴定表判定结果。按
反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，
其他5种反应结果均可以排除。
第四节 常见致病菌的测定
肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果
斜面 底层 产气 硫化氢 可能的菌属和种
－ ＋ ＋/－ ＋
沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸
杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德
华氏菌
＋ ＋ ＋/－ ＋
沙门氏菌Ⅲ、弗劳地氏柠檬酸
杆菌、普通变形杆菌
－ ＋ ＋ －
沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、
蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，
普罗菲登斯菌属
－ ＋ － －
伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、
志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、
蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，
普罗菲登斯菌属
＋ ＋ ＋/－ －
大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克
雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗
劳地氏柠檬酸杆菌
注：＋阳性；－阴性；＋/－ 多数阳性，少数阴性
第四节 常见致病菌的测定
肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表
反应序号
硫化氢
（H
2
S）
靛基质 尿素
氰化钾
（KCN）
赖氨酸脱羧酶 判定结果
A1 ＋ － － － ＋ 沙门氏菌属
A2 ＋ ＋ － － ＋
沙门氏菌属（少见）缓慢爱
德华氏菌
A3 ＋ － ＋ ＋ －
弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异
变形杆菌
A4 ＋ ＋ ＋ ＋ － 普通变形杆菌
B1
－
－
－
－
－
－
－
－
＋
－
沙门氏菌属、大肠埃希氏
菌、甲型副伤寒沙门氏菌
大肠埃希氏菌、志贺氏菌属
B2
－
－
＋
＋
－
－
－
＋
－
大肠埃希氏菌
大肠埃希氏菌、志贺氏菌属
B3
－
－
－
－
＋/－
＋
＋
＋
＋
－
克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆
菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌
B4 － ＋ ＋/－ ＋ － 摩根氏菌，普罗菲登斯菌属
注1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。
注2：KCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。
注3：＋表示阳性；－表示阴性；＋/－表示多数阳性，少数阴性。
第四节 常见致病菌的测定
沙门氏菌检验——几点注意
冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进
行15min或在2-8℃，18小时内软化。
–为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取
足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。
进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化
反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行
生化试验。
–测试中应同时接种阳性对照菌株。
第四节 常见致病菌的测定
二、志贺氏菌检验
1.志贺氏菌及其食品卫生学意义
志贺式菌属的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性痢疾的病原菌。
临床上能引起痢疾症状的病原微生物很多，如志贺氏菌属、
沙门氏菌属、变形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、
鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的
细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌的易感性较高，所以
在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为
指标。
志贺氏菌属是由四个亚群组成，即A、B、C、D四个亚群。
第四节 常见致病菌的测定
2.检验程序
采样
↓
样品处理
↓
选择性增菌
↓
选择性平板划分
↓
生化实验
↓
镜检
↓
结果报告
第四节 常见致病菌的测定
3.操作步骤
1）增菌
称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口
瓶内，固体食品用均质器以8 000～10000r/min打碎
1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙
或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。培养时
间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时
即应中止培养。
第四节 常见致病菌的测定
2）分离和初步生化试验
A.取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平极或SS琼脂平
板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红
美蓝琼脂平板1个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌
在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
B.挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄
糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，
经36℃培养18～24h，分别观察结果。
第四节 常见致病菌的测定
C.述培养物可以弃去：
a.在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b.在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d.产气的培养物；
e.有动力的培养物；
f.产生硫化氢的培养物。
D.凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏
志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可
做血清学分型和进一步的生化试验。
第四节 常见致病菌的测定
3)血清学分型和进一步的生化试验
A.血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4
种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现
凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、
B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用
群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和
群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清
出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、
2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果
鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清
及各型因子血清检查。
第四节 常见致病菌的测定
B.进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：
葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，
尿素，KCN生长，以及水杨昔和七叶昔的分解。除宋内
氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为
阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应
为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，
即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志
贺氏菌属的培养物。
已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘
露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属4个
生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生
化特性与A群或C群相似，见表2。
4) 结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作
出报告。
第四节 常见致病菌的测定
三、病原性大肠埃希氏菌检验
大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌，是Escherich氏在
1885年发现的，在相当长的一段时期内，一直被当
作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。
直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大
肠杆菌对人和动物有致病性，尤其对婴儿和幼畜
（禽），常引起严重腹泻和败血症。随着大型集约
化养畜（禽）业的发展，病原性大肠杆菌对畜牧业
所造成的损失已日益明显。
第四节 常见致病菌的测定
检验程序
第四节 常见致病菌的测定
操作步骤
1）增菌
2）分离
3)生化试验
4）血清学实验
5）肠毒素实验
第四节 常见致病菌的测定
四、肉毒梭菌的检验
肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制
品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在
我国主要以发酵食品为主，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。检验食
品，特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒毒素或肉毒梭菌
（例如罐头等密封性保存的食品），至为重要。
肉毒梭菌为专性厌氧的革兰氏阳性杆菌，芽孢卵圆形、近端位，在庖肉
培养基中生长时，混浊、产气、发臭、能消化肉渣。
肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。
除G型菌之外，其它各型菌分布相当广泛。我国各地发生的肉毒中毒主要
是A型和B型菌。E型和C型菌也发现过肉毒中毒。至于D型和F型菌，我国
尚未见到由此而发生的肉品中毒事件。
肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭
菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。
第四节 常见致病菌的测定
第四节 常见致病菌的测定
肉毒梭菌的检验程序
五、葡萄球菌的检验
葡萄球菌（Staphylococcus)是微球菌科的一个属，在自然界分布极广，
空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动
物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病的腐物寄生菌，也有一些
致病的球菌。
葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌。其中金
黄色葡萄球菌(staphy aureus)为致病菌、表皮葡萄球菌偶尔致病
（staphy epidermidis)、腐生葡萄球菌（staphy saprophyticus)一般
为非致病菌。
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排
列，直径为~1μm，无芽孢、无鞭毛、无荚膜。在普通肉汤培养基上，
形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑的菌落，菌落色素不稳定，但多
数为金黄色。需氧或兼性厌氧；最适生长温度为30～37℃；最适生长pH
为6~7。耐盐性强，能在含7％～15％氯化钠的培养基中生长。对氯化汞、
新霉素、多粘菌素具有很强的抗性，多数产肠毒素的菌株在血琼脂平板
上能形成溶血圈，并能产生血浆凝固酶，这些是鉴定致病性金黄色葡萄
球菌的重要指标。
金黄色葡萄球菌流行病学及致病性
第四节 常见致病菌的测定
%E9%87%91%E9%BB%84%E8%89%B2%E8%91%A1%E8%90%84%E7%90%83%E8%8F%8C/%E9%87%91%E9%BB%84%E8%89%B2%E8%91%A1%E8%90%84%E7%90%83%E8%8F%
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葡萄球菌的检验程序
第四节 常见致病菌的测定
六、溶血性链球菌的检验
一般而言，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：
1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有
化脓性炎症时造成食品的污染；
2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎
或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染。
3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。
溶血性链球菌常可引起皮肤、皮下组织的化脓性
炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及
新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、
肾小球肾炎等变态反应。
第四节 常见致病菌的测定
第四节 常见致病菌的测定
溶血性链球菌的检验程序
（一）实验内容
样品处理→增菌培养→分离培养→
纯化培养→生化鉴定→报告
（二）实验过程
第四节 常见致病菌的测定
第一天前半天 预先准备并灭菌的器材
规格名称 数量
1、500mL广口瓶 2个
2、13×100mm试管 7支
3、10mL移液管 1支
4、5mL移液管 3支
5、1mL移液管 12支
6、直径为90mm平皿 28套
7、250mL量筒 1支
第一天 样品处理和增菌培养
第四节 常见致病菌的测定
第一天后半天
1、样品处理
无菌操作称取检样25g（mL)，加入装有225mL灭菌生
理盐水的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-
10000r/min打碎1min，制成混悬液 。
2、增菌培养
吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤（如
检样污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤），
36±1℃培养24h。
3、分离培养
混悬液直接划线于血平板36±1℃培养24h。
第四节 常见致病菌的测定
第二天 接种平板进行分离培养
从肉汤中接种血平板， 36±1℃培养24h。
第三天 分纯培养
从分离培养的血平板上，挑起乙型溶血圆形突起
的细小菌落，在血平板上分纯 ， 36±1℃培养24h。
血平板上菌落灰白色，半透明或不透明，表面光
滑，有乳光，直径约~，为圆形突起的
细小菌落，乙型溶血链球菌。周围有2mm~4mm界限
分明，无色透明的溶血圈。
第四节 常见致病菌的测定
第四节 常见致病菌的测定
第四天 鉴定
1、革兰氏染色，阳性，G+链状排列，符合者可做生
化鉴定。
2、生化鉴定
（1）链激酶试验（溶纤维蛋白酶试验）
吸取草酸钾血浆，加灭菌生理盐水，
混匀，再加入链球菌18-24h36±1℃肉浸液肉汤培养物
及%氯化钙，混匀，置于36±1℃水
浴10min,血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶
解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴
性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶
阳性的菌株做阳性对照。
第四节 常见致病菌的测定
（2）杆菌肽敏感试验
将分纯的乙型溶血性
链球菌接种血平板，在
划线处贴附杆菌肽纸片，
36℃，18h，出现抑菌带
为阳性，（可推测为乙
型溶血性链球菌）。
四、报告
根据培养后的形态，菌落特征及生化试验结果进行报告。
第四节 常见致病菌的测定
第五节 真菌学检验
一、霉菌和酵母计数
1 设备和材料
1．1 温箱：25～28℃。
1．2 振荡器。
1．3 平天。
1．4 显微镜。
1．5 玻塞三角瓶：300 mL。
1．6 试管：15 mm×150 mm。
1．7 平皿：直径 9 cm。
第五节 真菌学检验
1．8 吸管：1 mL 及 10 mL。
1．9 酒精灯。
1．10 载物玻片。
1．11 盖玻片。
1．12 广口瓶。
1．13 牛皮纸袋：121℃灭菌 20 min。
1．14 金属勺、刀等。
1．15 试管架。
1．16 接种针。
1．17 橡皮乳头。
第五节 真菌学检验
2 培养基和试剂
2．1 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基，附加抗菌素，按
GB 中 规定。
2．2 孟加拉红培养基：按 GB 中
规定。
2．3 高盐察氏培养基：按 GB 中
规定。
2．4 灭菌蒸馏水。
2．5 乙醇。
第五节 真菌学检验
3、检验程序
第五节 真菌学检验
4 操作步骤
4．1 采样：取样时须特别注意样品的代表性和避
免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，
如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属刀或勺等。在卫生
学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后
应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。
粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮）样品
的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定
点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同
点的样品，充分混合后，取500 g 左右送检。小量
存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合
样品。
第五节 真菌学检验
海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中
层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓
盛粮超过10000 t，则应加采一个样品。必要时采取
有疑问的样品送检。
谷物加工制品（包括熟饭、糕点、面包等） 、发酵
食品、乳及乳制品以及其
他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品 250 g
，装入灭菌容器内送检。
第五节 真菌学检验
4．2 以无菌操作称取检样 25 g（或 25 mL） ，
放入含有225 mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇 30
min，即为 1：10 稀释液。
4．3 用灭菌吸管吸取1：10稀释液 10 mL，注入
试管中，另用带橡皮乳头的1 mL灭菌吸管反复吹吸
50 次，使霉菌孢子充分散开。
4．4 取1 mL1：10稀释液注入含有 9 mL灭菌水的
试管中，另换一支 1 mL灭菌吸管吹吸 5 次，此液
为 1：100 稀释液。
第五节 真菌学检验
4．5 按上述操作顺序做10倍递增稀释液，再稀释
一次，换用一支1 mL灭菌吸管，根据对样品污染情
况的估计，选择 3 个合适的稀释度，分别在做 10
倍稀释的同时，吸取 1 mL 稀释液于灭菌平皿中，
每个稀释度做 2 个平皿，然后将凉至45℃左右的培
养基注入平皿中，待琼脂凝固后，倒置于 25～28℃
温箱中，3 d后开始观察，共培养观察 5 d。
第五节 真菌学检验
4．6 计算方法：通常选择菌落数在10～150之间的
平皿进行计数，同稀释度的2个平皿的菌落平均数乘
以稀释倍数，即为每克（或毫升）检样中所含霉菌
和酵母数。
4．7 报告：每克（或毫升）食品所含霉菌和酵母
数以个/g（个/mL）表示。
第五节 真菌学检验
二、常见产毒霉菌的鉴定
1 设备和材料
显微镜。
目镜测微计。
物镜测微计。
温箱。
冰箱。
无菌接种罩。
放大镜。
酒精灯。
接种钩针。
分离针。
滴瓶。
载物玻片。
盖玻片：18mm×18mm。
小刀。
第五节 真菌学检验
2 培养基和试剂
乳酸－苯酚液
察氏培养基
马铃薯、葡萄糖琼脂培养基
马铃薯琼脂培养基
玉米粉琼脂培养基
第五节 真菌学检验
3 操作步骤
菌落的观察：为了培养完整的巨大菌落以供观察记录，
可将纯培养物点植于平板上。方法是：将平板倒转，向上接
种一点或三点，每菌接种两个平板，倒置于25～28℃温箱中
进行培养。当刚长出小菌落时，取出一个平皿，以无菌操作，
用小刀将菌落连同培养基切下1cm×2cm的小块，置菌落一侧，
继续培养，于5～14d进行观察。此法代替小培养法，可直接
观察子实体着生状态。
斜面观察：将霉菌纯培养物划线接种(曲霉、青霉)或点
种(链刀菌或其他菌)于斜面，培养5～14d，观察菌落形态，
同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察孢子的形
态和排列。
第五节 真菌学检验
制片：取载玻片加乳酸－苯酚液一滴，用接种
针钩取一小块霉菌培养物，置乳酸－苯酚液中，用
两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免
破坏霉菌结构。然后加盖玻片，如有气泡，可在酒
精灯上加热排除。制片时最好是在接种罩内操作，
以防孢子飞扬。
镜检：观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、
孢子的排列等，并做详细记录。
报告：根据菌落形态及镜检结果，参照以下各
种霉菌的形态描述及检索表，确定菌种名称。
