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一种快速测定发酵液中 ε-聚赖氨酸的方法
程传荣，田丰伟，张灏，陈卫
江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡（214122）
摘 要：为了建立一种快速方便的 ε-聚赖氨酸检测方法，本研究基于 ε-聚赖氨酸与
Dragendorff’s 试剂的沉淀复合物可与硫脲产生显色反应，提出了一种利用分光光度计快速
检测 ε-聚赖氨酸的新方法。ε-聚赖氨酸含量与反应复合物吸光度在 ～，反应时间
在 45min 以内，具有较高的线性相关性。分光光度计测定波长为 435nm。ε-聚赖氨酸工作
曲线相关系数 R2=，线性范围为 ，RSD=%，检出限为
回收率为 %～%。该方法相比于 Itzhaki法具有较高的准确性。最后以该方法为
依据建立了一种利用 96孔板高通量快速检测 ε-聚赖氨酸的方法。
关键词：ε-聚赖氨酸；Dragendorff’s沉淀；分光光度法；96孔板
1. 引言
ε-聚赖氨酸（ε-PL）是白色链霉菌产生的代谢产物，抑菌效率高，热稳定性好，是一
种高效、无毒、安全、无副作用的食品防腐剂，具有良好的应用前景[1]。对发酵液中 ε-聚
赖氨酸的定量检测是 ε-聚赖氨酸产生菌选育及发酵调件优化的重要内容之一。目前 ε-聚赖
氨酸检测的常用方法为 Itzhaki 法，此方法影响因素较多，大批量样品分析较慢。根据 ε-
聚赖氨酸与 Dragendorff’s 试剂中铋的沉淀反应是 1：1，用硫脲定量沉淀中铋的原理，本文
中使用分光光度法和酶标仪快速测定发酵液中的 ε-聚赖氨酸，为 ε-聚赖氨酸的进一步研究
和开发提供了检测依据。
2. 材料与方法
仪器
紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；酶标仪，美国 Thermo 公司；其
他均为实验室常用仪器。
试剂
ε-聚赖氨酸对照品，产自日本窒素公司；五水硝酸铋，硫脲，Na2S 等均为国产分析纯。
实验方法
溶液的配制
Dragendoff’s 显色剂（DR 试剂）：溶液 1 与溶液 2 的混合液。溶液 1： 五水硝酸
铋溶于 40mL 去离子水中和 10mL 冰乙酸的混合液；溶液 2： 碘化钾溶于 20mL 去离子
水。
硝酸铋的标准储备溶液：10mg 五水硝酸铋溶于 5mL 浓硝酸，用去离子水稀释至
100mL。
3%的硫脲溶液：3g 硫脲溶于 100mL 去离子水中。
1%的 Na2S：1g Na2S 溶于 100mL 去离子水中。
ε-聚赖氨酸标准溶液：用去离子水配制 0，，，， 的浓度梯度。
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分光光度计方法
准确吸取含不同浓度 ε-聚赖氨酸样品 ，置于 5mL 离心管中，加入 的 DR
试剂，摇匀，沉淀形成，7000r/min 离心 10min，2mL 乙醇洗涤沉淀，7000r/min 离心 10min，
弃去上清液，加入 2mL Na2S，产生黑色沉淀，7000r/min 离心 10min，向沉淀中加入 2mL
浓硝酸，20min 后，待沉淀完全溶解，用去离子水稀释至 10mL，取出 1mL，加入 5mL 硫
脲溶液，以 20%硝酸溶液加入硫脲为空白，在 λ=435nm 处测定吸光值。
酶标仪测定方法
准确吸取 50uL 样品加入 50uL DR 试剂沉淀，3500r/min 离心 20 min，弃上清，加入
200uL 乙醇洗涤沉淀，3500r/min 离心 20 min 弃上清，加入 100uL Na2S 溶液 3500r/min 离
心 20 min，弃上清，向沉淀中加入 100uL 浓硝酸，20min 后加入 200uL 水稀释取出 50uL
加入 200uL 3%的硫脲在 λ=435nm 处扫描测定吸光值 A。
3. 结果与讨论
铋标准曲线
以硝酸铋五水合物的储备液为基础配制，从储备液中分别移出 1，2，3，4，5，6，7，
8，9mL 于 10mL 容量瓶中，去离子水稀释至刻度，取出 1mL,加入 5mL 硫脲溶液，此黄色
复合物溶液在 λ=435nm 处有最大吸收，测定吸收曲线，测定结果如图 1 所示。由该结果得
到的工作曲线方程为 y=，式中 x 为铋的摩尔浓度，y 为吸光度。相关系数为
R2=（n=3）。
0
0
铋摩尔浓度/mol﹒L-1
吸
光
度
A
图 1 铋标准曲线
The standard curve of bismuth
图 1 中此铋的标准曲线线性良好，所以用硫脲法标定铋的含量是可行的。
显色反应产物的稳定性
测定反应产物放置不同时间后的 OD 值，以确定其稳定性，结果见图 2。
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0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
时间t /min
吸
光
度
A
图 2 显色反应的稳定性
The results of stability of the color reaction
由图 2 可见，铋与硫脲的络合物在 45min 内是稳定的，所以测定时间应在 45min 内完
成。文献中报道铋的硫脲络合物的稳定时间与温度有关，最适宜的温度为 20～25℃，大约
可稳定 小时，时间过长容易浑浊[4]。
pH 的选择
将样品的 pH 调不同的值，测定 pH 对测定结果的影响，结果如图 3 所以。
0
0 1 2 3 4 5 6 7
pH值
ε
-聚
赖
氨
酸
浓
度
/g
·
L-
1
图 3 pH 对测定结果的影响
The influence of pH value on the results of determination
由图 3 可见，当调整样品的 pH 在 2～1 时，测定的结果极大地偏低，而 pH 在 2～5 时
结果较稳定。这可能是 ε-聚赖氨酸的生物碱沉淀在强酸性条件下不稳定，容易水解。发酵液
发酵结束最后的 pH 在 2～5 范围内，这方便了我们直接测定发酵液中的 ε-聚赖氨酸含量。
ε-聚赖氨酸标准曲线
准确吸取 ε-聚赖氨酸标准溶液和对照（去离子水），各 ,分别置于已编号的离心
管中，加入 的 DR 试剂，摇匀，沉淀形成，按照 中的方法处理，最后在 λ=435nm
处测定吸光度，与 ε-聚赖氨酸的浓度做标准曲线，测定结果见图 4。
由图 4 可知，ε-聚赖氨酸浓度在 0～ 范围内线性关系良好，检出限为
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得到回归方程为 y=+，式中 x 为 ε-聚赖氨酸的浓度，y 为吸光度。相关系数
为 R2=(n=3)。由标准曲线的斜率可知，此方法的灵敏度不高，但能满足试验的测定
要求。由标准曲线的回归方程直接算出待测样品中 ε-聚赖氨酸的浓度。
0
0 1 2
ε-聚赖氨酸浓度/mg﹒mL-1
吸
光
度
A
图 4 ε-聚赖氨酸工作曲线
The work curve of ε-polylysine
碘化铋钾试剂(Dragendoff 试剂，BiI3·KI)是一种生物碱沉淀剂，在酸性溶液中与生物碱
反应生成桔红色沉淀[Alk·KI·(BiI3)n，为一种络盐，Alk 表示生物碱]，此反应很灵敏。硫脲
与多数金属离子有颜色反应，如对 Bi3+特别敏锐。ε-聚赖氨酸也是一种生物碱物质，它被
DR 试剂（KBiI4）沉淀为（BiI3）(ε-PL·HI)，此沉淀在硝酸和硫脲的作用下，形成黄色的铋
-硫脲络合物{Bi[CS(NH2)2]}(NO3)，此络合物在 343nm 和 435nm 处有最大吸收[2]。反应式
如下：
BiI3·KI ＋ ε-PL→（BiI3）(ε-PL·HI)↓
碘化铋钾
Bi3+＋NO3-＋CS（NH2）2→Bi[CS（NH2）2] (NO3)
硫脲 黄色络合物
ε-PL 与铋反应是 1:1 的，图 4 中也说明了 ε-聚赖氨酸浓度与铋-硫脲络合物的吸光度之
间的线性关系。
样品测定及精密度试验
方法的重现性对于准确测定发酵液中的 ε-聚赖氨酸是十分重要的。产 ε-聚赖氨酸菌种
白色链霉菌 UN2-71 为本实验室保藏菌株。250mL 三角瓶中装 30mL M3G 培养基[5]，10%
接种量，30℃培养 72h。发酵液 7000r/min 离心 10min 后，根据 中的测定方法步骤，
对此株菌的发酵液进行处理，在 λ=435nm 处测定吸光度后，在标准曲线上查得 ε-聚赖氨酸
的浓度，并计算相对标准偏差（RSD），结果如表 1。
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表 1 精密度试验
Table 1 The result of precision experiments
发酵液样品 6 次实测值/g·L-1 平均/g·L-1 RSD
（n=6）
菌株 2-71
由表 1 可知，发酵液样品的 RSD 平均为 ，说明该方法的精密度较高。
回收率的试验
为了考察方法的准确度，对发酵液样品进行加标回收率实验，结果见表 2。
表 2 回收率试验（n=3）
Table 2 The results of recovery experiments(n=3)
发酵样品 测定值
/ g·L-1
加标量/g·L-1 加标后测定值
/ g·L-1
回收率/%
1
2
3
由表 2 可知，应用此方法测定发酵液中的 ε-聚赖氨酸含量准确度较高，能满足发酵液
中 ε-聚赖氨酸含量测定要求。
与 Itzhaki 法测定结果比较
本次试验中还将此方法与 Itzhaki 法[3]相比较。对同一发酵液，分别用此方法与 Itzhaki
法进行多次重复测定，结果见表 3。
表 3 Dragendoff’s 沉淀法与 Itzhaki 法的比较结果
Table 3 The result of comparision with Itzhaki’s method
发酵液样品 Dragendoff’s 沉淀法
/g·L-1
Itzhaki 法
/g·L-1
菌株 UN2-71 ± ±
对两种方法测定结果比较分析，说明该方法是相对准确可靠地。
在产 ε-聚赖氨酸菌种筛选中的应用
在上面分光光度计测定方法的基础上，我们使用 96 孔板代替离心管处理样品，最后使
用酶标仪扫描，通过对上述方法进行优化改进，大大增加了我们处理样品的量，使测定更
快速。我们将此改进的方法应用到 ε-聚赖氨酸产生菌株的筛选工作中，对出发菌株白色链
霉菌 UN2-71 的原生质体用硫酸二乙酯（DES）诱变后，我们选择了 500 多株菌进行摇试
管发酵（10mL试管中加入 3mL M3G 培养基，接种环挑取 1 环孢子接种，摇床转速 200r/min，
30℃培养 7d），发酵液用 中的方法测定。用此法初筛筛选了几株高产菌。结果见表 4。
事实证明，用此方法大大提高了菌株筛选的工作效率。因为此方法为生物碱沉淀法，所以
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发酵液中的生物碱类物质都可以用此方法快速检测。本方法也可以应用到其他产生物碱菌
株的筛选和测定中。
表 4 菌种筛选的部分结果
Table 4 Partial results of strain screening
菌株 ε-PL 浓度
/g·L-1
菌株 ε-PL 浓度
/g·L-1
原菌 2-71 3-43
1-42 3-32
2-22 5-63
2-114 5-56
4-39
4. 结论
用硫脲测定 ε-聚赖氨酸沉淀中铋的量来定量 ε-聚赖氨酸含量，分光光度计测定的最佳
条件为：在发酵液 pH2～5，反应时间在 45min 以内，分光光度计测定波长为 435nm。在
此测定条件下标准曲线的线性回归方程：y=+（ x 为 ε-聚赖氨酸的浓度，y
为吸光度），相关系数为 R2=(n=3)，RSD=%，线性范围为
聚赖氨酸浓度回收率为 %～%。该方法相比于 Itzhaki 法具有较高的准确性。
我们改进了上述分光光度计法，使用 96 孔板处理样品，利用酶标仪扫描吸光度，进而
建立了一种更快速，利用少量的发酵液，且可同时测定大批量样品测定方法。我们将此方
法应用到实际的高产 ε-聚赖氨酸的菌种筛选中，大大提高了工作效率。
用此方法测定 ε-聚赖氨酸的含量，具有很高的准确度，且简单、快速，对仪器的要求
不高，适合于工业生产中和菌种筛选时发酵液中 ε-聚赖氨酸的高通量快速测定。本方法对
以后的 ε-聚赖氨酸高产菌株的发酵和研究具有重要的意义。
参考文献
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[5] Shima, Sakai, H.: Polylysine produced by Steptomyces partⅡ. Taxonomy and fermentation studies[J].
Agric. Biol. Chem., 1981,45(11):2497-2502
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A Rapid Method to Determine ε-Polylysine in Fermentation
Broth
Cheng Chuanrong,Tian Fengwei,Zhang Hao,Chen Wei
(School of Food Science and Technology, State Key Laboratory of Food Science and
Technology,Jiangnan Univercity,Wuxi214122,China)
Abstract
In order to develop a new rapid and convenient detection method, based on the color reaction of
thiourea and precipited complex of ε-Polylysine and Dragendorff’s reagent, this research puts forward
a new rapid method using spectrophotometer. There was a linear relationship between ε-Polylysine
content and OD value when the fermentation broth pH was rejacted ～ and the reaction time was
below 45min. Its OD value was measured at 435nm. A linear work curve with R2= have been
achieved in the linearity range from to determination limit of the method was
its RSD of fermentation borth sample ware RSD=%, and recoveries ware %～
%. Comparision with Itzhaki’s method indicated that the method of this paper was rapid,reliable
and accurate. Finally, based on this method, we have established a high-throughput method using 96
well plate to determine ε-Polylysine in fermentation broth.
Key words:ε-Polylysine; Dragendorff’s precipitation; spectrophotometry; 96 well plate
作者简介：
程传荣，女，1984 年生，硕士研究生，主要研究方向是食品生物技术。
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