目 录
一、层析柱的装填
1. 装填前的准备工作
a. 装填的一般考虑
b. 小颗粒的去除
c. 缓冲液平衡
d. 匀浆准备
2. 装填步骤
a. 恒流速/半恒压装填法
b. 可供选择的装填方法
3. 平衡与柱效评价
二、层析柱的操作
1. 柱层析
a. 分子尺寸排阻层析（SEC）
b. 离子交换层析（IEC）
c. 疏水反应层析（HIC）
d. 亲和层析（AFC）
2. 填料的清洗
3. 填料的保存
4. 灭菌/热原的去除/防腐剂的清除/柱筛板
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层析工艺树脂填料
TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW的装填指南
关于 TOYOPEARL 和 TSK-GEL 5PW 的简介
TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW大孔树脂型填料应用
于生物分子层析工艺，非常适合实验室和工业级大规
模生产中球状蛋白、多肽、核酸以及其他生化衍生物
的分离纯化。这种树脂型填料为改性的聚甲基丙烯酸
酯，由于醚及羟基的存在使其具有亲水性的表面，并
且具有了更好的耐压性能、流动特性及 pH稳定性。
一、层析柱的装填
图 1. 装填所需要的装置
1. 装填前的准备工作
a. TOYOPEARL 和 TSK-GEL 5PW 装填的一般考虑
TOYOPEARL 的 装 填 压 力 最 好 为 ~3bar
（7~45psi）；TSK-GEL 5PW 的装填压力最好为
3~10bar（ 45~140psi）。尽管 TOYOPEARL 和
TSK-GEL 5PW 填料也可以通过重力沉降法进行装
填，但这并不值得提倡。TOYOPEARL的装填压力不
应过高（<5bar），TSK-GEL 5PW的装填压力不应超
过 20 bar。
成功装填 TOYOPEARL 和 TSK-GEL 5PW 所需要的
设备有（参照图 1）：泵（HPLC或蠕动泵）、压力表、
水平仪、玻璃/聚丙烯酸/PEEK或不锈钢层析柱、储槽
（可选）等。
b. 小颗粒的去除（我们建议最好去除小颗粒）
在匀浆后的胶体中所存在的小颗粒会阻塞筛板或烧结
板，最终会导致整个柱子的压降增大。通过下列过程
可将匀浆后胶体中所存在的小颗粒去除。
（1）通过一根搅拌棒或桨激烈搅拌包装容器内的树脂
填料，将其搅拌成悬浮液（请不要使用磁力搅拌器，
这会磨碎树脂填料并产生小颗粒）。一旦成为悬浮液
后，立刻将需要量的悬浮液（大概 4体积的悬浮液=3
体积的树脂填料）倒入某个容器内，容器的体积应不
小于需要装柱填料体积的 4 倍。加入蒸馏水或者缓冲
液至 4倍填料体积，并一直保持搅拌。
（2）静置匀浆液 静置时间取决于容器的直径、匀浆
溶剂和填料的粒径大小。TOYOPEARL 和 TSK-GEL
5PW填料用水匀浆时，平均静置时间如下。
（3）一旦填料静置完成后，小心倒出表面的悬浮液。
图 2. 倒出表面的悬浮液 图 3. 再次悬浮
（4）加入 3倍填料体积的蒸馏水或者缓冲液，轻轻在
填料表面搅拌使其重新悬浮。请不要使用磁力搅拌器，
这会磨碎树脂填料并产生小颗粒。
（5）重复步骤（3）和步骤（4）至少 3次以上，直到
悬浮液不再浑浊。
在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液（参见 c.
缓冲液平衡）进行填料的平衡，如此可节约时间。
举例：
5L树脂填料（装柱需要量）= 7~8L悬浮液
（65~70%匀浆浓度）
因此，您至少需要准备 20L的容器。
TOYOPEARL
Coarse C级：100μm 15-30分钟
Medium M级：65μm 30-45分钟
Fine F级：45μm 45-60分钟
Superfine S级：35μm 60-90分钟
TSK-GEL 5PW
30μm 90-120分钟
20μm >120分钟
-1-
c. 缓冲液平衡
对于所有的 TOYOPEARL和 TSK-GEL树脂填料，我
们建议装填时使用高离子强度的缓冲溶液。尽管这些
填料可以用水装填，但相对于用同样装填方法而使用
盐溶液作为缓冲液的层析柱而言，塔板数较低并且不
对称性因子较高。
对于疏水层析柱用水装填时，相对于高离子强度的缓
冲溶液，更容易在柱内壁形成沟槽。这些沟槽的存在
非但不是必须的，更会对柱子的性能造成不良影响。
当选择装填缓冲液时，最好根据经验来选择，因为根
据您特定的应用而选择最优化的填装缓冲液是最为合
适的。总的来说，分离纯化步骤（包括清洗和消毒步
骤）中将使用到的最高离子强度的流动相，是装填缓
冲液的首选。一些常见的装填缓冲液请参见表 1。
表 1. 典型的装填缓冲溶液
分子尺寸排阻（SEC）
Toyopearl HW-40, HW-50,
HW-55, HW-65, HW-75
Na2SO4, NaNO3 或
NaCl溶于 50mM磷酸盐或
Tris缓冲液
离子交换（IEC）
Toyopearl DEAE, QAE, SuperQ,
CM, SP, MegCap SP-550
TSK-GEL SuperQ-5PW,
SP-5PW, DEAE-5PW
1M NaCl溶于 50mM磷酸
盐, Tris或醋酸盐缓冲液
疏水反应（HIC）
Toyopearl Ether, Phenyl, Butyl,
Hexyl-650, PPG-600, Super
Butyl-550
TSK-GEL Ether-5PW,
Phenyl-5PW
2M Na2SO4, (NH4)2SO4或
NaCl溶于 50mM磷酸盐缓
冲液
亲和（AFC）
Toyopearl AF-Epoxy-650,
AF-Tresyl
NaCl 溶 于
NaHCO3或磷酸盐缓冲液
Toyopearl AF-Formyl-650,
AF-Amino-650, AF-Carboxy-650
1M NaCl溶于100mM磷酸
盐或 NaHCO3缓冲液
Toyopearl AF-Chelate-650,
AF-Blue HC-650, AF-Red-650
NaCl或 甘氨酸
溶于 20mM 磷酸盐或 Tris
缓冲液
d. 匀浆准备
填料中的小颗粒被去除后，需要进行匀浆液浓度的调
节。匀浆液的浓度等于静置胶体积除以匀浆后的总体
积。其调节按如下步骤进行：
（1）均匀搅拌上述步骤所得、已去除小颗粒的填料浆
液，并将其倒入一个预先准备的量筒。（参照图 4）
（2）将浆液静置过夜（>12 小时），以便获得最佳装
填效果。
图 4. 静置中的填料浆液
（3）对于 TOYOPEARL 树脂填料，确定静置胶体积
后，加入或去除装柱缓冲液，以便将匀浆液浓度调节
至 30~50%；对于 TSK-GEL 5PW树脂填料，最常用
的匀浆液浓度范围为 25~70%，并且当匀浆液浓度在
40~50%的范围内时效果最佳。
（4）对于装填一根给定的空柱，可按表 2中所推荐的
内容确定装柱所需的静置胶体积。
表 2. 装柱所需的静置胶体积
Toyoperal HW-40, HW-50,
HW-55, HW-65, HW-75F
使用约 倍柱体积的静置胶
Toyopearl Ether-650,
Phenyl-650, Butyl-650,
Hexyl-650, PPG-600, Super
Butyl-550, DEAE-650,
SuperQ-650, CM-650,
SP-650及所有亲和填料
TSKgel DEAE-5PW,
SuperQ-5PW, SP-5PW,
Ether-5PW, Phenyl-5PW
使用约 倍柱体积的静置胶
Toyopearl QAE-550C,
SP-550C, Toyopearl MegCap
使用约 倍柱体积的静置
胶
-2-
可供选择的匀浆准备方法
（1）均匀搅拌上述 c中步骤所得、已去除小颗粒的填
料浆液，并将其倒入一个预先准备的布氏漏斗或类似
容器中。
（2）使用水泵进行抽滤，直至匀浆液成为一块湿滤饼
（所有剩余的溶剂被去除）。
（3）称取填料滤饼的大概重量（1g湿滤饼≅1mL静置
胶体），并使用表 2确定装柱用胶量。
（4）将滤饼转移至一个大口杯中，加入足够量的装柱
缓冲液，调节匀浆液浓度至 30~50%。
2. 装填步骤
表 3. TOYOPEARL填料的装填及操作流速
柱尺寸 装填流速 操作流速填料类型
(.×L) 填料等级 (cm/hr) (cm/hr) (mlLminj)
SEC HW-40 ×60 S(30μm) 30-40 10-25
F(45μm) 60-80 25-50
C(75μm) 120-160 50-100
HW-50 ×60 S(30μm) 25-35 10-20
F(45μm) 50-70 25-35
HW-55 ×60 S(30μm) 25-35 10-20
F(45μm) 50-70 25-35
HW-65 ×60 S(30μm) 20-75 10-15
F(45μm) 40-150 15-30
HW-75 ×60 F(45μm) 40-150 15-30
IEC* DEAE-650 ×20 S(35μm) 400-600 45-65
SuperQ-650 M(65μm) 800-1000 80-130
CM-650 C(100μm) 800-1200 80-600 -40
SP-650
SP-550 ×20 C(100μm) 700-1000 80-240 -15
QAE-550
MegCapSP-550EC EC(100-300μm) 800-1200 80-500
HIC* Ether-650 Hexyl-650 ×20 S(35μm) 400-600 45-65
Phenyl-650 PPG-600 M(65μm) 800-1000 80-130
Butyl-650 Super Butyl-550 C(100μm) 800-1200 80-500
AFC* AF-Amino-650 AF-Tresyl-650 ×20 M(65μm) 800-1000 30-130
AF-Carboxy-650 AF-Blue-650
AF-Formyl-650 AF-Chelate-650
AF-Epoxy-650 AF-Blue HC-650
TOYOPEARL填料的装填，应区别于传统的软凝胶。为了获取最佳效果，请尽量在较高流速和压力下进行 TOYOPEARL的装填。
*并不是所有类型的填料均具有各种规格等级.
表 4. TSK-GEL 5PW树脂填料的装填及操作流速
柱尺寸 装填流速 操作流速填料类型
(.×L) 填料等级 (cm/hr) (cm/hr) (mlLminj)
SEC/ TSK-GEL 5PW ×20 20μm 100-400 50-300 -119
HIC ×20 20μm 100-400 50-300 -458
×30 30μm 100-500 50-400 163-1307
21×30 30μm 100-500 50-400 289-2309
30×20-30(DAC*) 20-30μm (N/A) 50-400 589-4712
*DAC=Dynamic Axial Compression at applied piston pressure≥3bar. 动态轴向压缩柱、柱塞压力≥3bar
-3-
以下描述适用于一般的装填过程。如果您使用其他设
备或一次装填量超过 5L时，请与我们的技术支持部门
联系。（TOSOH上海公司：021-6270-2810）
a. 恒流速/半恒压装填法
（1）如果使用储槽/罐，请将其装于层析柱上。柱子
及储槽的总容积必须确保足够将匀浆液一次性注入。
（2）将柱底筛板用装填缓冲液润湿，并将缓冲液放空
一部分以便赶走所有的气泡。关闭柱出口，并在柱底
部留出 1~2cm高的缓冲液。（参照图 5）
图 5. 柱底筛板的浸润等
（3）再次将浆液搅拌均匀，以确保填料的均一。（参
照图 6）
图 6. 填料浆液的再悬浮
（4）小心将匀浆液倒入层析柱中，并注意避免倒入时
产生气泡。（参照图 7）
（5）将匀浆液倒入后，用喷壶清洗层析柱的内壁。
（6）立即将进样分配器放置于匀浆液表面。注意在分
配器与溶液间不应有气泡存在。（参照图 8）
（7）打开层析柱出口，开启泵。最初，应让缓冲液缓
慢流过层析柱。
图 7. 小心将匀浆液倒入层析柱中
图 8. 将进样分配器放置于匀浆液表面并准备开启泵
（8a. 恒流速装填法）缓慢增加至最终流速，这可以
避免液压对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床
形成的不均匀。流速可以阶段性地增大，增加量取决
于层析柱的柱尺寸和目标流速。表 5 中列举了部分例
子。
表 5. 恒流速装填法中流速的增加量举例
柱尺寸 目标流速 增加量 保持时间
(.×L) 填料类型 (mL/min) (mL/min) (min)
×60cm HW-55S 2
9cm×30cm QAE-550C 300 50 2
25cm×30cm DEAE-650M 2000 400 3
（8b. 半恒压装填法）缓慢增加至目标压力，这可以
避免液压对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床
形成的不均匀。可以通过手动操作减少流速来获得形
成柱床所需要的稳定压力。对于 TOYOPEARL树脂填
-4-
料而言，最合适的装填压力约为 3bar（44psi）。
（9）当柱床最终形成后，关闭泵，并关闭层析柱出口。
（10）装填中，如需要使用储槽/罐时，应保证柱床形
成于层析柱的低端部分。使用吸液管或泵，利用虹吸
原理将储槽/罐中的悬浮液吸除。最后，移走上层的储
槽/罐以及配套的密封圈。
（11）小心将进样分配器置于柱中，离柱床约 2~3cm，
同时避免将空气带入层析柱中。（参照图 9）
图 9. 小心将进样分配器置于柱中
（12）确保分配器就位后，参照步骤 8 开启泵，并同
时将层析柱的出口打开。（参照图 10）
图 10. 打开层析柱的出口并开启泵
（13）柱床将进一步被压缩。当压缩完成并且压力稳
定后，停泵并关闭层析柱出口。
（14）小心松开分配器密封圈，小心将分配器降至柱
床表面。在移动分配器时，一定注意不要扰动柱床。
最终，分配器应直接接触柱床。（参照图 11）
图 11. 小心将分配器降至柱床表面
（15）重复步骤 12~14，直到柱床无法被进一步压缩。
最终，柱床与分配器间的距离应小于 。这可能
需要重复上述步骤 2~3次，直到柱床稳定。
（16）层析柱装填完毕后，准备进行柱效的评价。（参
见下文）
b. 可供选择的装填方法
由于受硬件所限，有时可能没有储槽 /罐来进行
TOYOPEARL填料的装填。以下方法适用于没有储槽
/罐时的装填。
（1）调节浆液浓度至 50%，从顶部轻轻搅动浆液使
其重新悬浮。注意不要使用磁力搅拌器！
（2）如图 12 所示，将一蠕动泵连接至层析柱底部出
口。（参照图 12）
（3）确保层析柱水平并已适于装填。
（4）当泵向上工作时，将缓冲液向下加入至层析柱中，
直到大约 50%柱高为止，停泵。
（5）当泵以期望的流速向下工作时，慢慢向层析柱中
加入均匀的浆液。注意将浆液沿着层析柱壁倒入，以
避免产生气泡。
（6）当柱床基本形成、缓冲液高出柱床大约 2~3cm
时，停泵并关闭层析柱的出口。
（7）轻轻地用装有缓冲液的喷壶冲洗层析柱的内壁。
（8）小心将进样分配器放入层析柱，并使得分配器刚
好接触到缓冲液表面。
（9）当分配器就位后，将泵放置于柱前。注意排除管
路中的空气。
-5-
图 12. 将一蠕动泵连接至层析柱底部出口
（10）开启泵并以低流速运行，同时打开层析柱底部
的出口。
（11）缓慢将流速增加至目标流速，这可以避免液压
对于所形成的柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不
均匀。流速可以较先前装填时增加数毫升/分钟。流速
具体的增加量，取决于层析柱的柱尺寸和目标流速。
表 6中列举了部分例子。
表 6. 可供选择的装填法中流速的增加量举例
柱尺寸 目标流速 增加量 保持时间
(.×L) 填料类型 (mL/min) (mL/min) (min)
×60 HW-55S 2
9×30 QAE-550C 300 50 2
25×30 DEAE-650M 2000 400 3
.：cm；L：cm
（12）当柱床稳定后，关闭泵，并关闭层析柱出口。
（13）小心松开分配器密封圈，小心将分配器降至柱
床表面。在移动分配器时，一定注意不要扰动柱床。
（14）重复步骤 10~13，直到柱床无法被进一步压缩，
柱床与分配器间的距离应小于 。
（15）层析柱装填完毕后，准备进行柱效的评价。（参
见下文）
3. 平衡与柱效评价
对于 TOYOPEARL填料：柱子的装填一旦完成后，首
先用 5~10倍柱体积的低离子强度缓冲液平衡柱床。测
试装柱的效果，可以选用低分子量、无保留的样品（如：
丙酮、维生素 B12或氯化钠）（进样量：~1%柱体
积）。如图 13 所示，确定柱子的塔板数及不对称性因
子。按上述填装步骤装填的层析柱，在线性流速为
50~250cm/hr（取决于填料粒径大小）时，最小的柱
塔板数如表 7 所示、不对称性因子必须在 ~ 之
间。
表 7. TOYOPEARL填料装填柱最小塔板数（丙酮样品）
柱内 S级 F级 M级 C级 模式
(cm) (p/米) (p/米) (p/米) (p/米)
5000 3500 - 3000
5000 3300 - -
5000 2500 - -
21 4000 2200 - 1500
31 - 2000 - 1200
SEC
40 - 1800 - 1000
6000 - 4000 2000
6000 - 4000 -
6000 - 4000 -
21 4000 - 2600 2000
31 - - 2000 1000
IEC
40 - - 1500 750
6000 - 4000 2000
6000 - 4000 -
6000 - 4000 -
21 4000 - 2600 2000
31 - - 2000 1000
HIC
40 - - 1500 750
- - 4000
- - 4000
- - 4000
21 - - 2600
31 - - 2000
AFC
40 - - 1500
如果所计算出的柱塔板数及不对称性因子与期望值有较大偏离
时，请按照前文中介绍的操作步骤重新进行柱子的装填。
如果层析柱直径>40cm时，最小塔板数将成比例降低。
-6-
图 13. 柱塔板数及不对称性因子的计算
对于 TSK-GEL 5PW树脂填料：粒径为 20μm、30μm
的散装 TSK-GEL 5PW 填料与 TOYOPEARL 有类似
的化学性质。同时，TSK-GEL 5PW 填料具有与
TOYOPEARL 650相似的孔径大小（1000埃）。然而，
由于 TSK-GEL 5PW树脂填料的交联度更高，这使得
TSK-GEL 5PW填料与 TOYOPEARL填料相比，可在
更高压力下使用。事实上，从表 8中的数据可以看出，
当使用动态轴向压缩柱（DAC）、并在等于或大于 3bar
的压力下进行 TSK-GEL 5PW填料的装填时，可以填
装得更好，并且柱效更高。实际操作中，TSK-GEL 5PW
填料一般在 3~10bar的压力下使用，但如果硬件条件
允许可保证操作安全的话，TSK-GEL 5PW 填料甚至
可以在 15~20bar的压力条件下使用。
表 8. TSK-GEL 5PW填料装填柱最小塔板数（丙酮样品）
柱内径 20μm级 30μm级模式 装填法 装填缓
冲液 (cm) (p/米) (p/米)
传统法 水 1500 -
传统法 水 1500 -
传统法 水 - 1200
传统法 水 21 - 1000
IEC
DAC* 高盐** 20-30 10000 7000
传统法 水 1500 -
传统法 水 1500 -
传统法 水 - 1200
传统法 水 21 - 1000
HIC
DAC* 高盐** 20-30 10000 7000
*DAC=Dynamic Axial Compression at applied piston
pressure≥3bar. 动态轴向压缩柱、柱塞压力≥3bar
**高盐：≥ NaCl
柱效评价中常见问题及原因请参见表 9。
表 9. 装柱的常见问题及原因
As< As>
装柱过度 装柱时柱床未被压实、压紧
装柱压力过高 柱头或柱底的筛板发生阻塞
柱床坍塌 柱头处有空隙
层析柱死体积内有空气
进样技术不高
理论塔板高度过高 理论塔板高度过低
进样或检测器距离层析柱过远 样品与填料上所键合的官能
进样量过大 团或胶体间发生作用而被保
柱子没有被有效地装填 留
二、层析柱的操作
1. 柱层析
a. 分子尺寸排阻层析（SEC）
使用合适的、5~10倍柱体积的缓冲溶液进行柱床的充
分平衡（参照表 1）。使用 TOYOPEARL HW 填料装
填柱时，一般是在等浓度、中等离子强度的盐溶液条
件下进行操作的。进样量一般为 1~3%的柱床体积。
如果样品的保留时间短于或长于预期值，则有必要进
行流动相的调整。（参照表 10）
表 10. 实际操作中的可能现象及原因/解决方法
现象 原因/解决方法
样品部分或全部从柱中排出，确定样品
的分子量，如有必要的话需要更换更高
排阻界限的填料。
保留时间<预期值
阴离子分子样品会因为与胶体发生分
子排斥作用而被排出柱子，可考虑增加
流动相的离子强度。
阳离子分子样品会因离子吸引而被吸
附，可考虑增加流动相的离子强度。
保留时间>预期值
疏水性分子样品会因为与胶体间发生
疏水相互作用而被吸附，可考虑减少流
动相的离子强度或在流动相中添加少
量（10~20%）的有机溶剂（如：甲醇、
乙醇或乙腈）。
-7-
b. 离子交换层析（IEC）
使用适当的、5~10倍柱体积的缓冲液进行柱子的平衡
（参照表 11）。洗脱时，通过增强盐的浓度或改变洗
脱液的 pH值来实现。
表 11. 常见缓冲液及其缓冲范围
树脂类型 缓冲液 缓冲范围
醋酸
柠檬酸
MES
磷酸
阳离子交换体
HEPES
L-组氨酸
咪唑
三乙醇胺
Tris-Cl
阴离子交换体
二乙醇胺
如果目标蛋白在柱中无吸附，可以用酸或碱溶液活化
离子交换树脂。如果活化后还不能吸附目标蛋白，可
以改变平衡缓冲液的 pH 值以增强蛋白与离子交换体
之间的电荷作用，或者降低缓冲液中盐的浓度。
c. 疏水反应层析（HIC）
使用适当的、含高浓度（一般来说：1M~3M）中性盐
溶液的缓冲液平衡层析柱（参照表 12）。高离子强度
的缓冲液可以增强蛋白与树脂填料间的疏水相互作
用，有利于目标蛋白的吸附。在进样前，可使用最初
的流动相过一次层析柱，并起到平衡的作用。
表 12. 疏水反应层析中常用中性盐
盐（按强度递减序排列） 评述
柠檬酸钠盐 会导致很强的紫外吸收，易于滋生
微生物
硫酸铵 pH 值高于 8 时不稳定，低紫外吸
收，抗微生物生长，HIC中最常用
盐
硫酸钠 溶解度低（25℃：）
氯化钠 便宜，卤盐会腐蚀不锈钢
氯化钾 卤盐会腐蚀不锈钢
通过降低流动相中盐的浓度可以将被吸附的蛋白洗脱
下来。疏水作用弱的蛋白会较疏水作用强的蛋白先被
洗脱下来，即使在高盐浓度下也可实现这一点。如果
目标蛋白无法通过降低盐浓度实现洗脱，可以在洗脱
液中加入小比例的有机溶剂或非离子性表面活性剂，
也可以改变洗脱液的 pH值或者降低洗脱温度。如何选
择有机溶剂、表面活性剂或离液剂，请参照表 13。
表 13. 疏水反应层析中使用的流动相添加剂
有机添加剂 表面活性剂 离液剂
乙醇 Triton X-100 盐酸胍
甲醇 辛基葡萄糖苷 氯化四乙胺
异丙醇 Tween 20 尿素
正丁醇 SDS 硫氰酸钾
乙腈 CHAPS
乙二醇 Emulgen 911
CTAB
Lubrol PX
如果样品不稳定，首先应考虑增加柱平衡时间，可使
用初始洗脱液、额外增加 3~10 倍柱体积的柱平衡操
作。如果目标蛋白未被柱吸附，可考虑提高初始洗脱
液的盐浓度，或者调节缓冲液的 pH值以接近蛋白的等
电点。
d. 亲和层析（AFC）
TOYOPEARL亲和层析树脂均为特殊的配体填料（如：
螯合、红或蓝密胆碱等），树脂表面经过化学处理可以
吸附特定的配体。
客户还可以与 TOSOH 公司联系，定制所需要的、吸
附特定样品的亲和层析树脂填料。
平衡
对于 AF Red、AF Blue-HC及螯合型亲和树脂填料，
应使用合适的、3~5 倍柱体积的初始缓冲液进行柱子
的平衡（如：磷酸盐、含少量或不含盐的 Tris溶液）。
对于染色型亲和树脂填料，由于其在储存过程中会释
放少量的键合染料，因此使用前必须进行染色型亲和
层析柱的清洗。对于一根新装填的柱子，可使用 1M
的氯化钠或氯化钾溶液进行清洗；对于一根已使用过
的柱子，可使用 2M的氯化钾或 4M的尿素进行清洗。
平衡一个已使用过的或新装填的染色型亲和层析柱，
可使用合适的初始缓冲液（如：20mM、的磷酸
盐）来完成。
进样和洗脱
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进样后，首先用 3~5倍柱体积的初始缓冲液冲洗层析
柱，以去除未发生吸附的不纯物质/杂质；然后进行目
标样品的洗脱。通常，亲和层析的洗脱方式有两种：
非特异性洗脱和特异性洗脱。
非特异性洗脱一般是指通过提高洗脱液的盐浓度，将
蛋白洗脱下来。使用 2M的氯化钠或 3M的氯化钾，可
以将绝大多数蛋白洗脱下来。未能被洗脱下来的蛋白
可以选用下列推荐的洗脱液：
对于特异性洗脱，是指酶可以被包含其培养基或辅酶
的溶液洗脱下来。培养基或辅酶的浓度低于 10mM，
就足以进行洗脱操作。
2. 填料的清洗
TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW树脂填料可以在层析
柱内或卸柱后完成清洗。清洗方法和持续时间取决于
污染的程度。一般来讲，清洗时至少需要使用 3 倍柱
体积的清洗溶液。
分子尺寸排阻层析（SEC）树脂填料
大多数情况下，可以使用蒸馏水清洗填料，以除去吸
附蛋白。对于一些结合得比较紧密的污染物质，可使
用下列方法进行填料的清洗。
离子键合型污染物
对于键合力适中的物质，~1M的盐水溶液就可以用
于清洗填料了。对于键合很强的物质，使用 ~
的氢氧化钠或 ~的盐酸或硫酸溶液比较合适。
无论如何，一定不要使用硝酸溶液清洗 TOYOPEARL
树脂填料！硝酸会和 TOYOPEARL填料发生强烈的化
学反应！
由于有时候酸会引起蛋白的聚集现象，因此首先应考
虑使用碱溶液进行蛋白的去除。
疏水性键合污染物
使用 10~20%的醇（如：乙醇、甲醇或异丙醇）可去
除疏水性吸附物。一些溶剂，如乙腈和丙酮也可以使
用。但需要牢记的是，有机溶剂有时候会引起蛋白聚
集现象的发生。
在使用完任何酸、碱或有机溶剂清洗后，务必用蒸馏
水做最后的清洗。
离子交换层析（IEC）树脂填料
对于中等的污染，使用 ~1M 的氯化钠进行清洗，
然后用初始缓冲液进行平衡。
对于严重的污染，可使用 ~的氢氧化钠清洗，
然后用 ~的氯化钠清洗，最后用初始缓冲液进
行平衡。
对于 DEAE 型和 QAE 型树脂填料来讲，极度污染情
况下，可使用 ~的氢氧化钠、蒸馏水、~
的盐酸、~的氯化钠依次进行冲洗，最后用初
始缓冲液进行平衡。
最后的冲洗可选用高浓度盐溶液，以保证填料上正确
的对抗离子的存在。
疏水反应层析（HIC）树脂填料
大多数情况下，可以使用蒸馏水清洗填料，以除去柱
中残留的蛋白。对于一些结合得比较紧密的污染物质，
可使用下列方法进行填料的清洗。
离子键合型污染物
对于键合力适中的物质，~1M的盐水溶液就可以用
于清洗填料了。对于键合很强的物质，使用 ~
的氢氧化钠或合适的酸（如：盐酸或硫酸溶液）可进
行清洗。无论如何，一定不要使用硝酸溶液清洗
TOYOPEARL及 TSK-GEL 5PW树脂填料！硝酸会和
TOYOPEARL及TSK-GEL 5PW填料发生强烈的化学
反应！
由于有时候酸会引起蛋白的聚集现象，因此首先应考
虑使用碱溶液进行蛋白的去除。
疏水性键合污染物
使用 10~20%的醇（如：乙醇、甲醇或异丙醇）可去
除疏水性吸附物。一些溶剂，如乙腈和丙酮也可以使
用。但需要牢记的是，有机溶剂有时候会引起蛋白聚
集现象的发生。另外，非离子性表面活性剂也可以用
于清洗操作。
在使用完任何酸、碱或有机溶剂清洗后，务必用蒸馏
水做最后的清洗。
亲和层析（AFC）树脂填料
高浓度的中性盐、离液剂或表面活性剂（参照表 12、
选择 1：2M的 KCl 或 3M的 NaCl
选择 2：1%Triton X-100/1M NaSCN/75%乙二醇/4M尿素
或
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13）可用作初步的清洗。然后用 2倍柱体积、的
氢氧化钠可将柱中残留的蛋白洗掉，最后用蒸馏水进
行清洗。注意：对于 AF-Heparin型亲和填料来讲，只
有在重度污染情况下才可使用氢氧化钠溶液进行清
洗。
3. 填料的保存
分子尺寸排阻层析（SEC）/离子交换层析（IEC）/疏
水反应层析（HIC）树脂填料
装填好的柱子或已使用过的散装填料应保存在含有抑
菌剂（如：20%的乙醇）的蒸馏水溶液中，并最好在
4~25℃下储存。
亲和层析（AFC）树脂填料
装填好的柱子或已使用过的散装填料应保存在含有抑
菌剂（如：20%的乙醇）的 1M、中性氯化钠或氯化钾
溶液中，并最好在 4~10℃下储存。
对于 AF Formyl-650M 填料来讲，装填好的柱子或已
使用过的散装填料应保存在含有 1%Gluteraldehyde
的 1M、中性氯化钠或氯化钾溶液中，并最好在 4~10℃
下储存。
请注意染色型亲和层析树脂填料会在储存过程中释放
少量的染料，因此每次使用前务必进行填料的清洗以
除去释放出来的染料。
4. 灭菌/热原的去除/防腐剂的清除/柱筛板
a. 灭菌
TOYOPEARL和TSK-GEL 5PW树脂填料，可在高压、
121℃下灭菌 20分钟，而不必担心影响填料的性能。
另外，装填好的柱子可暴露在 200ppm 的次氯酸钠溶
液中长达 12小时，而不必担心影响填料的性能。
b. 热原的去除
TOYOPEARL 和 TSK-GEL 5PW 树脂填料，可在
pH2~12的范围内使用。然而，短时间（<12小时）暴
露在更高 pH 值溶液中（如： NaOH）以去除热
原物质也是可以接受的。使用 的 NaOH 处理 4
个小时，然后再用 3 倍柱体积的缓冲液平衡，可以将
典型的内毒素水平降低 4个数量级。
c. 防腐剂的清除
TOYOPEARL和 TSK-GEL 5PW树脂填料，在运输过
程中使用了 20%的乙醇（部分亲和填料除外）。在对填
料进行预处理时，便可降低乙醇的浓度。
d. 柱筛板
与压力相关联的问题，往往都是由于柱筛板发生阻塞
现象而引起的。取下柱筛板，按照层析柱制造商所提
供的方法进行筛板的彻底清洗（可参照 TOSOH 公司
所提供的其他资料）。如果问题仍然存在，可考虑更换
柱筛板。
我们推荐您使用网状筛板，以取代多孔的特氟纶、聚
乙烯或不锈钢筛板。
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