【关键词】 ,pH指示剂
0引言
目前国内外尚未出台检测自动生化分析仪精密度的标准方法，研究报道也甚少. 对硝基酚（pNitrophenol ，PNP）是一种酸碱指示剂，无色至淡黄色结晶，易溶于水，其在水溶液中的颜色随pH改变而改变，颜色由无色变为黄色. 我们根据其显色特性，用PNP水溶液做自动生化分析仪340 nm波长精密度检测试剂，定期客观地反映仪器比色系统和加样系统的工作状态. 效果较好报告如下.
1材料和方法
材料
自动生化分析仪（HITACHI, 7170，日本），紫外可见光分光光度计（UV2100，岛津），PNP AR, 上海化学试剂中心化工厂生产；pH ，去离子水为杭州天创纯水机生产. PNP工作溶液：称取 mg PNP，置500 mL的容量瓶中，去离子水溶解并加水至刻度.
方法
PNP溶液的吸收光谱扫描：按PNP溶液与去离子水以300 mL/2700 mL比例混合均匀，将混合液置于光径1 cm的石英比色杯中进行690 nm至190 nm的吸收光谱扫描，寻找PNP溶液最大吸收波长部位.
HITACHI, 7170自动生化分析仪精密度检测程序的建立，用终点法，主波长为340 nm，副波长为450 nm；反应方向为正；样品为去离子水10 mL，试剂I为去离子水300 mL，试剂II为
mmol/L PNP工作液25 mL；测定第1点为4，第2点为34.
试剂空白测定法为将上述精密度测定参数中，试剂II换成去离子水即可，一般情况下4~8 wk测定1次. 每日早晨取10支干净试管，加入去离子水进行批内精密度检测，测定单位为PNP的吸光度A值，根据A值的x±s，按下列公式计算变异系数（CV）：CV=标准差〖〗均值×100%仪器精密度评价以批内CV值<%为性能合格，可以进行常规工作；日间精密度是计算连续10个以上工作日的CV值，主要用来反映PNP试剂的稳定性. 观察8℃冷藏状态下PNP溶液在固定双波长测定下的吸光度变化情况.
2结果
酸性环境下PNP溶液吸收光谱扫描情况在进行PNP溶液自690 nm向190 nm扫描时，在690~480 nm间为一直线，在470 nm（）后开始出现光吸收，吸收峰缓缓升起，在405 nm 处为，到370 nm 处为，然后向上快速升起，到340 nm 处为，至320 nm 处达高峰为，持续到310 nm后成对称降低，至260 nm最低为，以后以缓升状延续至245 nm与杂峰融合，PNP溶液吸收光谱在酸性环境下，其最大吸收波长位于295~340 nm. 340 nm属于紫外光区，在生化分析仪上这一波长通常用来测定以还原性辅酶I（NADH）和辅酶II（NADPH）的增加或减少为指标的临床化学项目.
自动生化分析仪精密度检测曲线按上述参数测定曲线呈典型的终点比色法的反应模式， mmol/L的PNP溶液在比色杯的反应液中被稀释了倍，此时精密度或重复性的检测完全可以反映340~450 nm波长下的仪器检测性能.
值检测1 d CV为%，连续记录30个工作日批内CV均未超过%，平均CV为%；10 d以上的日间CV为%.
试剂II存置Hitachi 7170自动生化分析仪的试剂仓内，储存温度为8℃ PNP溶液在固定双波长测定下的吸光度变化情况，连续15个工作日的PNP溶液日平均吸光度的变化情况以及稳定性完全能满足仪器精密度检测的要求.
3讨论
目前临床化学诊断中应用PNP及其衍生物合成的人工合成底物有几十种. 如：对硝基酚麦芽糖庚苷（PNPG7）作为α淀粉酶底物用于测定α淀粉酶活性［1］，也可以测定氯离子浓度；2氯4硝基酚麦芽三糖苷（CNPG3）用来测定α淀粉酶活性［2］，Kayamori等［3］又用其测定血清钙离子水平，张孝山等［4］研究用其法测定血清氯离子浓度. Hagishita等［5］应用人工合成底物磷脂酰PNP测定磷脂酶D活性等. 综上所述我们采用PNP的理论基础是成立的. 在PNP的应用报道中，尚未见有应用其在340 nm紫外波长下检测吸光度的报道. 临床化学检测的主要项目天门冬氨酸氨基转移酶（AST）使用NADH做指示剂，测定主波长为340 nm，因此选择检测自动分析仪精密度的工作波长也应为340 nm, 而且试剂价格低廉、呈色稳定、方法简便，能够很好地满足仪器340 nm精密度监测，建议推广使用.
【参考文献】
［1］ McCleary BV, McNally M, Monaghan D, et al. Measurement of alphaamylase activity in white wheat flour, milled malt, and microbial enzyme preparations, using the Ceralpha assay: Collaborative study［J］. AOAC Int, 2002; 85(5):1096-1102.
［2］张孝山, 帅真, 李明润,等. CNPG3作为α淀粉酶底物的实验研究［J］. 天津医科大学学报, 2002; 8(1): 26-29.
［3］Kayamori Y, Katayama Y. Enzymatic method for assaying calcium in serum and urine with porcine pancreatic αAmylase［J］. Clin Chem, 1994;40(5): 781-784.
［4］张孝山,何庆,帅真,等. 卤族元素等对酶法测定血清氯化物的干扰实验［J］. 天津医科大学学报, 2002;8(4):431-434.
［5］Hagishita T, Nishikawa M, Hatanaka T. A spectrophotometric assay for the transphos phatidylation activity of phospholipase D enzyme［J］. Anal Biochem, 1999; 276(2):161-165.
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