植物组织培养技术
二 环境条件
• 在植物组织培养中温度、光照、湿度等
各种环境条件，培养基组成、pH值、渗
透压等各种化学环境条件都会影响组织
培养育苗的生长和发育。
温度(temperature)
• 因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最
适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是
在23～27℃之间进行，一般采用25± 2℃。低于15℃℃时培养，植
物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。但是，不
同植物培养的适温不同，百合的最适温度是20℃、月季足25-27℃、
番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影
响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃
为最好，在120℃以下，33℃以上形成率皆最低。
• 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃以下再生
的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2—
5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用
35℃处理草莓的茎尖分生组织3—5d，可得到无病毒苗。
光照(light)
• 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、
以及光照时间方面
• 1．光照强度(light intensity)
• 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的
研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。
一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼
苗容易徒长。
• 2．光质(light wave)
• 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显
的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但
在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15d
后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下
幼苗纤细。
• 3．光周期(light period)
• 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的
周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的
器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有
时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。
如红花、乌饭树的愈伤组织。
湿度 (humidity)
• 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受
培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。
在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利
于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接
影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受
阻，也会导致植物生长发育受影响。
• 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%—
80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿
度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改
变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，
易引起棉塞长霉，造成污染。
渗透压(penetrating pressure)
• 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化
合物，因此，而影响到渗透压的变化。
通常1—2个大气压对植物生长有促进作
用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍
作用，而5—6个大气压植物生长就会完
全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。
pH值 (pH value)
• 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表2
—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆要求，这
基本能适应大多植物培养的需要。
• pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以
硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高
一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养基全变硬；
低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低
pH值(约—个pH值)因此在配制时常提高pH值0．
2—0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和0．
IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单位，
lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要充分
搅拌均匀。
种类 最适pH值 种类 最适pH值
杜鹃 月季
越桔 胡萝卜、石刁柏
蚕豆 桃
番茄
不同植物的最适pH值
氧气(oxygen)
• 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封
闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜
的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶
口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引
起污染。固体培养基可加进活性炭来增
加通气度，以利于发根。培养室要经常
换气，改善室内的通气状况。液体振荡
培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，
同时要考虑容器的类型、培养基等
第二节 培养基的制备
• 一、母液(stock solution)的配制和保存
• 在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便
起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液
的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快
速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-
100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机
物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+
• 和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定
要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。
药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要
准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般
配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、
氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱
内低温保存，用时再按比例稀释。
母液的配制方法：
• 单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的
母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。
• 混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称
量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混
合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该
母液a ml.
• 生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。2，4—D可用O．
1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入温水定容。生长素常配
成1mg／ml的溶液贮于冰箱中备用。
• 细胞分裂素类一般先用少量1N盐配溶解后，再加入温水冷
却后定容，
• 铁盐配法（MS为例）：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入
2粒苛性钠，溶解后加入 EDTA-Na2，加热使其全部溶
解，然后边搅拌边慢慢加入 直至全部溶
解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。
第三节 培养基的选择
• 在建立一个新的实验体系时，为了能研
制出一种适合的培养基，最好先由一种
已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基
或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，
对这种培养基做了某些定性和定量的小
变动之后，即有可能得到一种能满足实
验需要的新培养基，选择最佳培养基。
常用试验方法主要有单因子试验、多因
子试验及广谱实验等。
一、单因子试验
• 在单因子试验中．由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，
所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响
的程度。例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动
NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验
就是单因子试验。
• 生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学
试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随
试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。试验中要求对
照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须
在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以
保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致
导致的。
• 试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。
随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4—10瓶，每瓶至少3
块培养物或3丛小幼苗。
2种激素5种浓度的实验组合
6-BA
mg/L） 0 5 10
NAA 0 1 2 3 4 5
(mg/L) 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15
5 16 17 18 19 20
10 21 22 23 24 25
对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全
试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的
每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6—BA的最佳浓度
组合，每个因子各设5个浓度水平(0，，，5，10mg／L)，这两种因子各种浓
度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见表3—3。
二、多因子试验
• 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的
精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试
验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表
时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试
验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多
因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素
所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试
验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍
的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几
种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。
三、逐步添加和逐步排除的试验
方法
• 在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得
可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营
养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以
逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成
功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有
影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使
培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求
最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的
简单方法。
四、广谱实验法
• 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无
机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、
细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高
(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了
一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一
个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐，
低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有
机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，
再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养
基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂
素对不同植物的活性有所不同。
第四章 操作技术
第一节 灭菌和接种
• 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚
有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气
中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是
有菌的。依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净
台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未
处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，
如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容
器无论洗得多干净等等都是有菌的。
• 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其
他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看不见。无处不
在，无时不有，无孔不人。在自然条件下忍耐力强，
生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大
量滋生。
• 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经
其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法
必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内部、健康的动、
植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌
剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球
表面无菌世界要比有菌世界小得多。
• 菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切
微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关
的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，
使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉
菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和
物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间
(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和
手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，
就叫做无菌操作。
常用的灭菌方法
• 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的
两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、
湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外
线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量
无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升
汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏
儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精
化学药品处理。这些方法和药剂要根据
工作中的不同材料不同目的适当选用。
湿热灭菌（培养基）
• 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原
理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力
不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随
之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在
此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热
的芽孢。
• 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌
才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的
都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。
常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．
05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归
零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达
到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa，20min。
• 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，
可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，
既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能
随意延长时间。
• 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干
后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。
• 高压灭菌前后的培养基，其pH值下降单位。高压后培养基
pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高
pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高
或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大
于2个pH值单位。环境pH值的变化大于单位就有可能产生明显
的生理影响。
• 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基
的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0
．43倍。
• 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗
糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于，其水解量更多，培养
基中添加%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性
炭，蔗糖水解率可达5%。
防止高压灭菌培养基变化的方法：
• (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时
采取有效措施。
• (2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌
握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替
IAA，控制活性炭的用量(在%以下)注意pH值对高压灭菌
下培养基中成分的影响等。
• (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将
磷、钙和铁放在最后加入。
• (4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压
灭菌后的pH值常由升高至。而96h后又回降至左
右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）
• 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀
等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒
精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使
用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，
放入95%的酒精，以便插入工具。
干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）
• 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来杀死微
生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性
大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续
90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工
具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎
可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温
度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，
以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分
冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干
热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
过滤灭菌（不耐热的物质 ）
• 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸
和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处
理，通常采用过滤灭菌方法。
• 防细菌滤膜的网孔的直径为μm以下，当溶
液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因
大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体
量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注
射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射
器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，
推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压
出的溶液就是无菌溶液。
紫外线和熏蒸灭菌（空间）
• (1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用
辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染
色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最
强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，
而且要求距照射物以不超过为宜。
• (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，
以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密
即可。
• 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广
口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰
醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或
降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，
温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能
发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是
浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
喷雾灭菌（物体表面）
• 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，
可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的
来苏儿溶液以及%—1%的新洁尔灭
也可以。
植物材料表面用消毒剂灭菌
• 从外界或室内选取的植物材料，都不同
程度地带有各种微生物。这些污染源一
旦带人培养基，便会造成培养基污染。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌
处理，再经无菌操作手续接到培养基上，
这一过程叫做接种。
• 第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，
如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为
宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程
度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染
严重时特别有用。
• 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去
轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接
触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
• 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好
消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒
精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒
精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特
殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠
芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。
处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况
选取1—2种使用见表。
灭菌剂
使用浓
度(%)
持续时
间
（min）
去除的
难易
效果
次氯酸
钙
9~10 5~30 易 很好
次氯酸
钠
2 5~30 易 很好
氯化汞 ~1 5~8 较难 最好
抗菌素 4~50mg
/L
30~60 中 较好
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
• 上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次
氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；
升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧
来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可；
由于用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌
水涮洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。
• 灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人
消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分
接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1—2min，开始把消毒液
倾人一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，
轻搅涮洗。灭菌时间是从倒人消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录
时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料，宁可多
用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
• 在灭菌溶液中加吐温—80或Tnton X效果较好，这些表面活性剂主要作用
是使药剂更易于展布，更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加人后对
材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液
的%，即在100ml加入15滴。
• 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，
涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
二、无菌操作
• 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引
起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌
和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间
消毒。接种室内保持定期用1%—3%的高锰酸
钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了
使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期
间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中
灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进
行：
• (1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭
菌；
• (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外
灯；
• (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖
鞋等；
• (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后
擦拭工作台面；
• (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过
火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
• (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和
咳嗽等；
• (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。
• 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
三、接种
• (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，
再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸
上。
• (2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的
切割。如叶片切成见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖
要剥成只含l—2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器
械，防止交叉污染。
• (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体
操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精
灯火焰，并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞
盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹
取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在
培养基上，以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖
端向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，通过统计
认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培
养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃，接完种后，将管口在火焰上再
灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。
第二节 培养和驯化
• 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)
里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或
进一步分化成再生植株的过程。
1．培养方法
• (1)固体培养法
即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现
在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养
分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象
发生。
• (2)液体培养法
即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。
由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或
振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇
床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r／min
，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保
证氧气的供给。
2．培养步骤
• (1)初代培养
初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。
即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代
培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中
含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代
培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚
状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向
可分为：
1)顶芽和腋芽的发育
• 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生
长，从而形成 一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可
以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽——苗增殖的培养，并且
迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得
到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也
可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。
这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是
最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。
• 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的
茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。
• 茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽
的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分
生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。
• 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁
时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会
生出不定芽，形成芽丛。
2)不定芽的发育
• 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成
愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官
原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同
)。多数情况下它先形成芽，后形成根。
• 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器
官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管
培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植
物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许
多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。在许多常规方法
中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽
而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏
器官能强烈地发生不定芽，用臼合鳞片的切块就可大量形成不定
鳞茎。
• 在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得
到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。
3)体细胞胚状体的发生与发育
• 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它
也通过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发
育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发
生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可
从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮
培养的细胞中产生，也可从外植体表面已分化
的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。
(2)继代培养
• 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不
多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。
• 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相
当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是
按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株
苗。
• 继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离
原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种
方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS0基本培养基；分离芽
丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较
小，可先切成芽丛小块，放人MS0培养基中，待到稍大时，再分离开来
继续培养。
• 增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同．由于培养物在
接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞
争，所以能够按几何级数增殖；；
• 在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不
停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入
生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料
的分流，生产出成品。
培养过程中常出现的问题及解决
方法
初代培养外植体的褐变
• 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，
有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出
现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而
使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，
会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到
培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响
所接种外植体的培养。
褐变的主要原因
• ①植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于
多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种
后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。
因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。
• ②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度
也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，
而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此
褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明
显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。
• ③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增
加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧
化酶的活性，从而使褐变现象加深。
• ④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均
可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程
度。
减轻褐变现象发生的方法
• ①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺
盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
• ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、
适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
• ③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血
酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多
外植体的褐变现象。另外，使用%%的活性炭对
防止褐变也有较为明显的效果。
• ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，
再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，
褐变现象便会得到控制或大为减轻。
继代培养时材料的玻璃化
• 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往
往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长
缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。
• 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同
的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素
水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落
酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。
• 呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，
细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于
培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：
• ①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；
• ②减少培养基中含氮化合物的用量；
• ③增加光照；
• ④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显
的作用；
• ⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；
• ⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
3．生根培养
• 当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物
分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转
到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发
黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛
弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个
过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根
培养可采用1／2或者1/4MS培养基，全部去掉
细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA
等)。
诱导生根方法：
• ①将新梢基部浸入50或100×10-6I IBA溶液中处理4—8h；②在含有
生长素的培养基中培养4-6d；③直接移入含有生长素的生根培养
基中。上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根
的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其
原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于
幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。
• 另外也可采用下列方法就可生根：①延长在增殖培养基中的培
养时间；②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将
增殖与生根合并为一步)；③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，
此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插
穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的
作物。
• 另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，
使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。
• 从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可
以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体途径发育的苗数
特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植
物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
• 试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将苗移植到试管外的
环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的
适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。实践证明植
物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌
类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。
春季低温时苗床可加设电热线，使墓质温度略高于气温2～
3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且还有利于提
前成活。
• 移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，
并可适应强度较高的漫射光，(约4000h左右)，以维持光合
作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平
衡的矛盾更尖锐。
二、试管苗移栽驯化
• 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环
节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移
栽，应选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，
才能确保整个组织培养工作的顺利完成。
• 试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温
度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生
理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很
大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、
增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从
而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适
合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成
功。
• 从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通
常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片
上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大
小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适
合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外
环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。
因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态
特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理另
外，对栽培驯化基质要进行灭菌，因为试管苗
在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵
御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质
中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，
以进行灭菌处理。 ，通常采取的措施有：对外
界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气
体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。
移栽用基质
• 适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌
处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为
了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，
一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1:1:。也可用砂子：草炭
土或腐殖土为1:1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少3h烘烤来消灭
其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满
意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。
• (1)河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗
粒直径为1—2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为—。
河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种
试管苗。
• (2)草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，
其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽
种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。
• (3)腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是
人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压
实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下
使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，
它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。
移栽前的练苗
• 移栽前可将培养物不开口移到自然光照
下锻炼2—3d，让试管苗接受强光的照射，
使其长得壮实起来，然后再开口练苗1—
2d，经受较低湿度的处理，以适应将来
自然湿度的条件。
移栽和幼苗的管理
• 从试管中取出发根的小苗，用自来水洗
掉根部粘着的培养基，要全部除去，以
防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，
应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗
的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗
插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后
把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。
栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环
境中。保证空气湿度达90%以上。
• (1)保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5-7d内，应给予较高的空
气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，
让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵
的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，
以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有
水珠出现。当5—7d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减
少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。
约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促
进小苗长得粗壮。
• (2)防止菌类滋生。由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后
难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。
所以应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度
的杀菌剂以便有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800—
1000倍，喷药宜7—l0d一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，
根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入%的尿素，
或用1／2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。
• (3)一定的温、光条件。试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，
适宜的生根温度是18—200C，冬春季地温较低时，可用电热线来
加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使
水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。
• 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳
网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有
了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进
光合产物的积累，增强抗性，促其成活。
• (4)保持基质适当的通气性。要选择适当的颗粒状基质，保证良好
的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，
以利根系呼吸。
• 综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介
质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽
的。
愈伤组织（callus）的形成和形
态发生
• 植物的脱分化形式有两种，器官发生型
和胚胎发生型，在有些情况下，再分化
可以直接发生于脱分化的细胞中，无须
经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，
再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。
一． 愈伤组织形成的条件
• 虽然如全能性所言，发育和分化过程并不导致细胞全能性的丧失，
但是，在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织
中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，
恰如其分地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施展
其全能性的外部条件。然而，这些细胞若是一旦脱离了母体植株，
摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在不定期下
的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变
为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续
的有丝分裂，形成愈伤组织（离体隔离）。
• 大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和
花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当
条件下，都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关
键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种
类和浓度最为重要。当然，外植体的类型和外植物体原来在植株
上所处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织诱导的影响也
不能忽视。
二．愈伤组织形成的过程
• 外植体中已分化的活细胞，在外源激素
的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，
这一过程被大致划分为三个时期（诱导
期、分裂期和形成期）。
• 诱导期：细胞分裂的准备期
• 诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接种的外
植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止
状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特
征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等
（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，
细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细
胞核体积明显增大。
• 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状
况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几
天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎
经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以
上。
• 分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期
• 分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过
程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，
使细胞脱分化。分裂期主要表现如下：
• 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加
10倍。
• 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞
数目的增加快的缘故。
• 3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特
性。
• 4．细胞的核和核仁增大到最大。
5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。
6. 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和
核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。
• 总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：
细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的
结构，维持其不分化的状态。
• 形成期：从愈伤组织到器官发生
• 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构
的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对
稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周
分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状
或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。
分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步
分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平
周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、
纤维细胞等，但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基
本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不
同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。
愈伤组织的继代培养
• 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组
织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，
由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物
的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个
过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织
无限期地保持在不分的增殖状态。然而，如果
让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，
它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。
三 愈伤组织的生长
• 一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与
琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。它
是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。
• 愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，有的很坚实，且这两
类愈伤组织可互相转变。其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚
实的愈伤组织变为松脆。反之，减低或除去生长物质，则松脆的愈伤
组织可以转变为坚实。松脆愈伤组织都有大量的分生组织上中心，进
行活跃的细胞分裂，为大而未分化的细胞所分开；而不脆的确良愈伤
组织很少分化，大都是高度液泡化的细胞。脆的愈伤组织是进行悬浮
培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少数
几个细胞组成的小细胞团。在培养中细胞产生迅速增殖，而坚实的愈
伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而往往不能形成良好的悬
浮系统。
• 愈伤组织的质地不同是由其内部结构上的差异所引起的。坚实致密的
愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织；松脆愈伤
组织内有大量的细胞间隙，细胞排列毫无次序。
• 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿
色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。
• 外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有
很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类
的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩
组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。
• 一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，
因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不
同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，
即不同的再分化能力。
• 以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格
的意义，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出
现在同一块组织上。另外，有一些研究者曾反复指出
的，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈
伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都
必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚
性细胞而形成体细胞胚。
四 愈伤组织的形态发生方式
• 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形
态建成，可再产生完整的植株。
• 形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分
化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体
的过程。
• 在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方
式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构
组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分
化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官
发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发
生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状
体，进而使它发育成苗或完整植株。
• 在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，
有下面两种方式：
• 1．不定芽方式（unfixed bud） 指细胞或愈伤组织培养
物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养
中常见的器官发生方式。愈伤组织的器官发生顺序有四
种情况：（1）愈伤组织公有根或芽器官的分别形成，即
无根的芽或无芽的根；（2）先形成芽，再在芽伸长后，
在其茎的基部长出极而形成小植株，多数植物属这种情
况；（3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植
株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；
（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然
后两者结合起来形成一株小植株。
• 2．胚状体方式（somatic embryo） 指由培养细胞诱导分
化出的胚胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整
植株。（以后章节中介绍）
五．愈伤组织形态发生的调控
• 来源于不同植物或同一种植物不同部们的愈伤组织，在颜
色、结构和生长习性上都可能存在差异，其遗传生理功能
也可能或是具有胚性，或是不具胚性，在不同的实验中由
于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但
优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个。
• 1． 高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到
再生植物。
• 2． 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，
并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。
• 3． 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规
模的愈伤组织无性系。
• 4． 经过长期继代保存而不丧失胚性，有便有可能对它们
进行各种遗传操作。
• 细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外植体本身、培养基
和培养环境等三大类因素的调控。
（一）材料本身
• 1．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决
定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟
草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾
谷类、豆类、棉花等就比较困难。
• 2．器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组织所形
成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不
大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的
花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗
分化频率也比其他器官为高。
• 3．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组
织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下
而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，
愈入上部，苗的分化频率越高，苗分化频率越低。因
此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行
分化培养，可大大提高苗的分化频率。
• （二）培养基
• 培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一
定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特
别是生长素和细胞分裂素的配比。
• 1．生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和
根形成的重要条件之一，生长素对芽的抑制作用可为
细胞分裂素所克服。细胞分裂素/生长素比例高时有利
于芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样
通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组
织的器官分化。
• 但是，要注意的是不同的生长素和细胞分裂素，对生
根和长芽的效果是不同的。如NAA对生根的作用比
IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的根
比较健壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-
D往往对生根不利，特别是在较高浓度下。Kt和BA能
广泛地诱导芽的形成，但BA比Kt的效力大。玉米素的
作用范围较窄，但对某些植物有特效。因此，往往多
数植物采用BA 和Kt来诱导芽的形成。
• 2．无机营养元素 在植物组织培养中和整体植物一样，细胞的
生长也要求满足植物生长的必要元素，若完全投入或过多或不
足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响不如激素的影响明
显。但是各种类型的植物，器官所需要的每种元素的量，特别
是大量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，
所以常用1/2MS或White。如有些植物要求的氮，以硝酸态形
式供应为佳；而有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。
• 当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如
下：
• 氮——某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色
素苷的颜色；不能形成导管。
• 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退；
• 硫——非常明显地褪绿。
• 铁——细胞分裂停止。
• 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。
• 锰或钼——影响细胞伸长。
• 3．有机成分 在培养基中加了糖各类B族
维生素、肌醇和甘氯酸等，可以满足愈
伤组织的生长和分化的要求。各中氯基
酸和嘌 呤、嘧啶类物质，可以促进器官
分化。其中酪氨酸可明显增加烟草组织
培养的器官形成。酰胺类往往有促进器
官形成的作用。水解酪蛋白中含有多种
氨基酸，在进行器官分化培养时，加入
一定量是有益的。
• 4． 物理性质 培养基的物理性质（固体或液
体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响。
在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培
养基的形式，才能顺利地分化出苗。其方法是：
第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体培养基
上进行培养；第二阶段细胞和胚状体的增殖，
需在液体培养基中完成；第三阶段由胚状体发
育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培养
基上进行培养。
• 培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状体的形
成都有十分明显的影响，在花药培养中受到普
遍的重视。如油菜花药培养宜先在高糖（9-
10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状
体的形成。
• （三）培养环境条件
• 1． 光周期的影响 光周期的需要与否，应根据植物种
类培养目的来决定。
• 在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周
期性光照、散射性光照，上述两种做法诱导率差异不
大。另一些植物差异较大，如石刁柏全暗诱导愈伤组
织，要比周期性光照下好得多。大豆愈伤组织诱导采
用散射性光照比较好；光照对地钱干重的增加明显地
优于黑暗培养。
• 器官发生阶段，一般给予周期性光照比较好。光周期
长短因植物种类而异。多数植物8-10小时黑暗为宜。
如茄子、苹果等。也有例外，有些植物如石刁柏需要
16小时光照，12小时黑暗。
• 温度 在组织培养中，一般都采用22-25℃的恒温
条件下进行外植体的培养。对一般植物来讲，都
可较好地形成芽和根。但是很多资料表明 ，温
度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。如对
喜温性植物如茄科、葫芦科、兰科、禾本科等的
培养温度一般可控制在26-28℃比较适宜。而对
于冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等植物
则培养温度可控制在25℃以下较为适宜。
培养周期中的昼夜温差，至今，多数植物离体
培养，均采用恒温培养。而国内有关小麦、水稻
花药培养温度试验的报道认为：在诱导花形成愈
伤组织时，昼夜恒温较好，而在器官分化时，昼
夜具有一定温差比较好，分化出的小植株比较健
壮。菊芋试验也有类似的报道。
器官发生与体细胞胚胎发生
• 一．器官发生
• （一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条
件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的
过程。
• （二）发生方式：有两种发生方式
• （1）直接发生：（具有初生分生能力的）外
植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、
原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
• （2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）
经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
（二）胚状体方式(somatic embryo) 指由培养细胞诱导
分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完
整植株。
• 由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶
段：
• 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而
形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。
• 2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形
成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下
胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细
胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚
期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。
我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程
而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
• 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不
定芽均有光滑、圆形突起的形状。
