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前表面荧光法在牛奶美拉德反应检测中的
应用#
杨晓倩，刘小鸣，周鹏**
基金项目：国家自然科学基金（30901128）
作者简介：杨晓倩（1987-），女，硕士在读，主要研究方向：食品结构与物性
通信联系人：刘小鸣（1975-），女，副教授，主要研究方向：食品生物技术
（江苏无锡江南大学食品科学与技术国家重点实验室） 5
摘要：在热处理中，牛奶中的乳蛋白容易与乳糖发生美拉德反应，使牛奶的色泽、风味、营
养等发生变化。与传统化学检测法相比，前表面荧光法具有快速灵敏、前处理简便等优点。
为了评估前表面荧光法在检测牛奶美拉德反应程度上的准确性和适用性， 本文对比了不同
热处理下牛奶的美拉德反应的荧光图谱和美拉德产物的含量，分析了指标间的相关性。并以10
前表面荧光法和羟甲基糠醛含量建立模型对商业乳品进行预测，结果良好，为荧光检测的工
业应用提供理论依据。结果显示，前表面荧光法可应用于牛奶前中期美拉德产物的无损检测。
关键词：前表面荧光；美拉德反应；化学计量学；牛奶
中图分类号：请查阅《中国图书馆分类法》
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Application of front-face fluorescence spectroscopy for
determination of Maillard reaction in milk
YANG Xiaoqian
1
, LIU Xiaoming
2
, ZHOU Peng
3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu,
214122,China; 20
2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu;
3. State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi)
Abstract: Milk proteins are liable to react with lactose during thermal processing, causing changes
in color, flavor and nutritional function. In order to understand the accuracy and applicability of
front-face fluorescence spectroscopy, the extents of Maillard reaction of the milk samples with 25
various degrees of heat treatments were measured by three Maillard reaction tests and front-face
fluorescence spectroscopy (FFFS) respectively. A strong correlation was found between FFFS,
furosine and hydroxymethylfurfural. Moreover, a good prediction of hydroxymethylfurfural
concentration was got in commercial milk samples using this model. This work indicated that
FFFS has the reliability and sensitivity to monitor and control the thermal processing of milk. 30
Key words: front-face fluorescence spectroscopy; Maillard reaction; chemometrics; milk
0 引言
热处理是液态乳制品常用的加工步骤，不仅可以延长货架期，还可以减少食源性微生物
污染的可能。虽然高强度的热处理可以保证乳制品的安全，但过度的热处理会对产品的品质35
带来负作用。液态牛奶中含有丰富的乳蛋白，易与乳糖发生美拉德反应，在高温下尤其剧烈。
美拉德反应一方面会导致牛奶的色泽、风味变差，同时还会损失营养物质，增加有害物质。
常见的牛奶中美拉德反应程度的检测方法包括采用 HPLC 法测定美拉德反应早期产物
糠氨酸（Furosine）[1,2,3]，HPLC 或比色法测定中期产物羟甲基糠醛（HMF）[4]以及末期色素
类产物浓度[5,6]和邻苯二甲醛法（OPA 法）测定游离赖氨酸的含量[7,8]等。但这些方法存在前40
处理麻烦耗时和易受干扰等缺点。荧光是一种快速灵敏前处理少的光谱技术，近年来人们尝
试将其用来评价热处理对乳制品的影响方面，如直角荧光法检测牛奶在 下可溶性部分
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的色氨酸和美拉德高级产物的荧光信号[9]。近年来出现的前表面荧光技术可进一步简化前处
理，，在乳制品检测方面的研究包括预测乳品中糠氨酸和乳果糖含量[10]，评价前表面荧光
在 UHT 乳检测中的准确性[11],区别液态乳产地[12]等，这些都为荧光快速检测和评价乳制品的45
品质提供了理论基础。本试验采用不同热处理程度的牛奶，在美拉德反应前中后期中各选一
个代表产物（糠氨酸，羟甲基糠醛，色素类），分别与前表面荧光进行相关性分析，来评价
前表面荧光的准确性和适用性。
1 材料与方法
材料与仪器 50
巴氏杀菌全脂乳 光明乳业有限公司；商业巴氏奶、UHT 奶 无锡各大超市；甲醇、无
水乙醇 色谱纯；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、草酸、三氟乙酸、氢氧化钠、盐酸 化学纯；
µm×25mm 微孔滤膜 上海兴亚净化材料厂；羟甲基糠醛（5-（Hydroxymethyl）furfural）
标准品 Sigma-Aldrich 公司；糠氨酸（Furosine dihydrochloride）标准品 NeoMPS 公司；碱
性蛋白酶 诺维信公司。 55
F-7000 荧光光谱仪 日本日立公司；HWS26 型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；SPE
12 孔真空固相萃取装置 EASTAK 公司；UV-1200 分光光度计 MAPADA 公司；冷冻干燥机
（Stoppering Tray Dryer） LABCONCO 公司；C18 固相萃取柱（BOND ELUT LRC-C18）
VARIAN 公司。
实验方法 60
不同程度美拉德牛奶模型体系的制备
将牛奶按每管 15mL 加入耐热试管中，加密封盖，放入水浴锅（或油浴锅），水（油）
没过试管液面。加热的时间和温度见表 1。
表 1 模型体系加热时间和温度
Table 1 Treatment time and temperature of model system 65
温度 时间 (h)
编号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
75℃（水浴） 0 1 2 3 5 8 12 18 24
90℃（水浴） 0 1 2 3 5 7 10 13 16
105℃（油浴） 0 1 4 7 10
糠氨酸的测定
取 2mL 样品（蛋白含量约为 60mg）至安瓿管，加入 6mL 盐酸混匀，加入 4
滴正辛醇消泡，真空泵抽真空 5min 后用酒精喷灯融管密封。110℃下消化 23h 后，将水解液
转移至 10mL 容量瓶，定容，过滤。取滤液过 µm 膜，向 C18 柱中加入 1mL 滤液，之前
用 10mL 甲醇、10mL 去离子水分别润洗，抽干。用 3mL 3mol/L 盐酸洗脱，洗脱液全部收70
集，避光保存。之后用 Agilent 1100 高效液相色谱仪进行分析。采用 Ultimate AQ C18 柱
（250mm××5µm）[13]，进样量为 5µL，流速为 30℃。洗脱液
采用乙腈/水/三氟乙酸（5:95:），洗脱模式为等度洗脱。10min 之后换为乙腈/水/三氟乙
酸（60:40:）冲洗柱子。检测器采用二极管阵列，检测波长为 280nm。糠氨酸出峰时间在
左右。色谱图用软件 ChemStation 积分得到峰面积。由糠氨酸的标准曲线（R2=）75
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计算样品含量。每个样品做两次平行。
羟甲基糠醛的测定
取 5mL 样品，加入 草酸 ，充分混匀。90℃水浴 60min 后，用冰水浴冷
却至 4℃，加入 80%三氯乙酸，充分混匀，静置。离心 4000r/min、30min。取 4mL
上清液至 10mL离心管，加入 硫代巴比妥酸 1mL，充分混匀。之后 40℃水浴 30min，80
冷却至常温。以去离子水为空白，443nm 下检测吸光度[14]。由 HMF 的标准曲线（R2=）
计算样品含量。每个样品做两次平行。
美拉德反应程度的测定
采用酶解比色法来测定美拉德反应程度。吸光度越高，美拉德反应的最终阶段生成的色
素类物质越多，即美拉德反应越剧烈。取 10mL 样品，冷冻干燥后成干粉状。加入 10mL
的磷酸缓冲溶液(10mmol/L)，室温下磁力搅拌至溶解，转速为 400r/min。加入 15µL 碱性蛋
白酶，55℃恒温水浴振荡 15min，加入 2mL 80%三氯乙酸以沉淀蛋白和终止酶解反应。静置，
过滤，以缓冲液为空白，420nm 下测定吸光值[15]。每个样品做两次平行。
前表面荧光检测
取 5mL 样品加入石英比色皿（10mm×18mm×45mm），放置于固体样品支架中。测定90
美拉德反应程度，激发波长设定为 360nm，发射波长为 400-600nm[12]。测定色氨酸荧光强度，
激发波长设定为 280nm，发射波长为 310-400nm[12]。扫描速率均为 12000nm/min，激发波长
和发射波长的狭缝宽度均为 5nm。光谱图由软件 FL Solutions 导出。
2 结果与讨论
化学检测法结果 95
糠氨酸、羟甲基糠醛含量和颜色的变化如图 1 所示。糠氨酸是美拉德反应初期的标志性
产物，随着温度和时间增长，含量逐渐增多，在 105℃后期样品中，出现了下降，可能是糠
氨酸转化成了更高级的美拉德反应产物。羟甲基糠醛是中期标志性产物，其含量明显低于糠
氨酸，在美拉德前期的增长速率缓于糠氨酸，而后期的增长率快于糠氨酸。酶解比色法所测
得吸光度表征美拉德反应后期色素类物质，吸光度值与色素类含量呈正相关。在反应前期几100
乎没有变化，中后期呈现线性的增长趋势。
图 1 体系在 75、90、105 ℃下加热时的糠氨酸(A)、羟甲基糠醛(B)含量和酶解比色法吸光值(C)
The concentration of furosine(A), HMF(B) and absorbance of final Maillard reaction products(C) of 75、90、
105 ℃ samples 105
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荧光信号的变化
牛奶美拉德反应荧光图谱如图 2 所示。随着温度和时间的增长，样品中的美拉德反应程
度越来越高。将荧光图谱标准化后，在发射波长 400-600nm 的扫描过程中，样品会出现两
个峰，分别在 430nm 和 520nm 处。430nm 处对应是美拉德反应中所产生的荧光物质的荧光
信号，在 0min 的样品中，此处几乎没有荧光信号，随着反应进行，美拉德产物增多，信号110
逐渐增强。随着反应剧烈程度的增加，在 90℃和 105℃的后期，有荧光信号减弱并伴随最大
发射波长红移的现象。520nm 处对应是牛奶中核黄素的荧光信号[16]，表征牛奶中维生素 B2
的含量。显示在三个温度下，核黄素在初始时在 525nm 处有比较明显的峰，但后期随着美
拉德荧光信号的增强，峰型已不明显，但信号强度没有大的变化。这个现象符合核黄素具有
较好耐热性。牛奶色氨酸荧光图谱（未图示）中荧光信号峰出现在 340nm 左右。在 75℃下115
加热到 8h 才有比较明显的荧光信号下降，而在 90℃下加热到 2h 荧光信号就开始明显下降，
105℃下 之后色氨酸的荧光信号只有初始的一半了。色氨酸的荧光信号表征乳蛋白受热
后的变性程度。因为乳蛋白是由约 20%乳清蛋白和 80%的酪蛋白所组成，乳清蛋白的变性
温度为 70℃左右（beta-lactoglobulin >70℃, alpha-lactalbumin 为 65-70℃）[17]，酪蛋白变性温
度在 75℃以上[17]，所以在 75℃下大部分的酪蛋白还能够保持活性。 120
图 2 体系在 75、90、105 ℃下加热时的美拉德反应荧光谱图
Fluorescence spectra of Maillard reaction products in 75、90、105 ℃ samples
将三个温度样品的荧光谱图用 Unscrambler 软件进行 Normalize 处理之后做 PCA 分析，
其 Score 图很相似，以 90 ℃为例，如图 3（左）所示。通过 Loading 图（右）判定不同温度125
组中 PC1 所代表均为美拉德反应（430nm），且能解释 99%以上的样品差别。在 PC1 上消
极端代表美拉德程度低的样品，积极端代表美拉德程度越高的样品。PC1 上，75℃样品荧光
信号逐渐增加，而 90℃和 105℃的样品中，后期出现了信号的减弱，这可能是在剧烈的加热
条件下，美拉德反应初期或中期产物转化成了更高级而没有荧光信号的物质。而 PC2 经过
分析是未知的荧光信号（约在 460-470nm），在 90℃和 105℃的样品中能解释 1%的差别信130
息，虽然很微弱，但是说明在实验中剧烈的热处理条件下，荧光信号在此区间的物质会发生
变化。同时能发现，三个温度组的样品在 PC2 上都经历了从积极端向消极端再回到积极端
的过程。推测是多种荧光物质的生成增长转化的叠加作用。
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图 3 90 ℃加热组的 PCA 分析 Score 图(A)和 Loading 图(B) 135
Principal component analysis similarity map (A) and factor loading (B) of Maillard reaction products of milk
samples heated under 90℃
相关性分析
将样品的荧光谱图和化学测定的数据导入 Unscrambler 软件，进行 PLS 分析，讨论糠氨
酸、羟甲基糠醛、酶解吸光度值与荧光谱图的相关性。将由荧光图谱所得到的真实值和预测140
值导入 SPSS 软件，进行配对样本 T 检验。置信区间设定为 95%，其结果如表 2 所示。表明
三组数据的 Sig.值（即 P 值）均远大于 ，说明两样本间无明显差异，并且三组数据的均
值差值和标准误都较小，也说明预测值和真实值间的相关性较好。
表 2 测量值和预测值的配对样本 T 检验
Table 2 Paired samples test of measured value and predicted value 145
配对样本
配对差值
t df Sig.(2-tailed)
均值差值 标准差 标准误
Furosine-PC1 89
HMF-PC2 89
比色法-PC2 89
此外，分别分析三个温度组的真实值和预测值之间的线性关系，可以得到好的线性关系
（R2>）。将所有样品共同分析，仍具有较好的相关性（R2>），说明具有较好的预测
能力。其与美拉德反应前期产物 furosine 含量的对应性优于与中期后期产物的对应性，且和
低浓度的中后期产物的对应性优于高浓度，在低浓度时呈现线性对应，在高浓度时对应性变
差。因此在建立模型时，由软件自动除去离群点，furosine 模型中去除 75 ℃24h、90℃ 16h、150
105℃-10h 加热点，HMF 模型去除 75 ℃18-24h、90℃ 7-16h、105℃4h-10h 加热点，色素
类吸光度模型去除 75 ℃12-24h、90℃ 4-16h、105℃10h 加热点，均为各温度加热后期的实
验点。图 4 为除去离群点后的相关性，排除差异较大的样品点使得模型更加可靠，同时也说
明前表面荧光法对于检测前中期的美拉德反应程度具有更高的适用性。在实际工业生产中，
经过热处理的液态乳制品都是处于前中期的美拉德反应阶段，因此此法有较好的对应性和适155
用性。
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图 4 样品荧光图谱和糠氨酸(A)，羟甲基糠醛(B)和色素类(C)含量的相关性分析
Predicted and observed furosine (A), HMF (B) concentration and absorbance (C) of milk samples that heated
under different temperature. 160
商业奶验证实验
用 Unscrambler 软件所建立的前表面荧光法和 HMF 含量的模型来预测商业乳品中 HMF
含量，同真实值对比，探究此模型的商业应用性。此模型的 RMSEP 值为 ，相关系
数为 。说明这个模型是具有较好的预测能力的。因此将其应用于国内 6 个品牌 30 种商
业奶（巴氏奶，UHT 奶等）检测，利用此模型进行预测，其 HMF 含量的预测值、偏差值和165
真实值如表 3 所示。
表 3 商业奶 HMF 含量的预测值与真实值(μg/mL)
Table 3 The predicted and measured HMF concentration of commercial milk samples (μg/mL)
样品编号 真实值 预测值 偏差值 样品编号 真实值 预测值 偏差值
1 16
2 17
3 18
4 19
5 20
6 21
7 22
8 23
9 24
10 25
11 26
12 27
13 28
14 29
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真实值在预测值±偏差值范围内认为预测有效。由表可知，除了 9 号样品有些许预测偏
差之外，其余样品都可以利用荧光结果较好的预测其 HMF 的含量。因此可以初步证实前表170
面荧光法在商业乳品的检测中是有较好的适用性和可靠性的。进一步说明前表面荧光法在牛
奶美拉德反应检测中是种无需前处理，省时，准确性好的无损检测方法。
3 结论
本实验中，不同美拉德程度的牛奶分别用化学法和前表面荧光法进行检测，用以评估前
表面荧光法在检测液态乳体系中美拉德程度的准确性。实验证实了前表面荧光法与前中期的175
美拉德程度有较好的对应性，且应用于预测商业乳品 HMF 含量有较好的初步结果。因此此
法具有应用于在工业乳制品检测的理论基础。同时此法相对其他化学方法具有无损无前处
理、省时、灵敏度高等优点，是一种能推广应用的检测手段。
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