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叶绿体提取方法与其脱除二氧化硫的活性#
黄国平1，王向丽2，温其标2*
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20070561076）
作者简介：黄国平（1967－），男，副教授，主要研究方向：食品化学
（1. 广东食品药品职业学院食品科学系，广州 510520；
2. 华南理工大学轻工与食品学院，广州 510520）
摘要：为了研究从菠菜中提取叶绿体的效率，采用了两步差速离心法进行提取，对叶绿体的
萃取条件进行了优化，并考察了不同提取方法对叶绿体的溶解性、稳定性和脱除亚硫酸盐的
活性的影响。实验结果表明，新型菠菜洗净嫩化后加入 2倍重量的蒸馏水匀浆过滤，在 200
×g低速离心 10min后，再 10000×g高速离心处理 20min，经冷冻干燥后得到样品，具有
较好的溶解性、稳定性和脱除二氧化硫的效果，得率可达 %。
关键词： 食品化学；叶绿体; 提取; 二氧化硫；脱除
中图分类号：TS
Extraction method of chloroplast and it’s catalytic function
of removing sulfur dioxide
Huang Guoping1, Wang Xiangli2, Wen Qibiao2
(1. Department of food science, Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520;
2. College of Light and Food Indrstry, South China Univesity of Technology, Guangzhou 510520)
Abstract: Extracting chloroplast from spinach in this study with two-step centrifugation method was
studied, and applied to remove sulfite from sodium bisulfate. Experimental results indicate that when
ejuvenated fresh spinach is homogenated with twice the weight of water, and centifugated at 200×g
and 10000×g respectively, and than lyophilizated, the yield of cholorplast will reach %, and the
chloroplast has better quality in solubilty, stablity and activity of removing sulfite than contrast.
Key words: food cheminstry; chloroplast; extraction; sulfite; removal
0 引言
植物细胞内的亚硫酸盐氧化酶(PSO)大多存在于叶绿体中，而蔬菜叶中叶绿体含量较其
他植物高。由于叶绿体颗粒比较大，分离和制备时一般采用差速离心技术[1]。
不同植物的叶绿体对 SO2的敏感程度不同，目前菠菜叶绿体的研究报道较多[2-4]，而目
前对用用不同方法提取叶绿体纯度、催化氧化 SO2的活性及保存稳定性情况的研究较少。因
此，本文拟利用叶绿体含量高而又廉价易得的新鲜菠菜作为材料；比较采用不同提取方法提
取得叶绿体的理化性质，并对所提取叶绿体催化氧化 SO2的活性及其活性稳定性进行比较。
以求以简单工艺最大限度地提取能高效催化氧化 SO2的叶绿体提取物，并最终确定相应的提
取方法。
1 材料与方法
主要材料与试剂
新鲜菠菜，购于广州五山菜市场；亚硫酸氢钠、抗坏血酸、EDTA、磷酸氢二纳、磷酸
二氢钠、柠檬酸、氯化钠、三(羟甲基)氨基甲烷、浓盐酸、牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、蔗
糖、盐酸副玫瑰苯胺、铵基苯磺酸铵、甲醛、高氯汞钠、重铬酸钾（化学试剂均为分析纯）。
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以上试剂中牛血清白蛋白及 β-巯基乙醇及盐酸副玫瑰苯胺为进口分析纯试剂，其他化学试
剂和溶剂均为国产分析纯。
主要仪器与设备
TU-190 型 紫外-可见分光光度计：北京普析；CS150GXL 型高速冷冻离心机：日本日
立；ALPHA1-4 型真空冷冻干燥机：CHRiST；pHS-3C 型精密酸度计：上海雷磁仪器厂；SS
280-A 型榨汁机：佛山市顺德区容桂家成电器厂；SHZ-ⅢD 型循环水真空泵：上海亚荣生化
仪器厂；电子分析天平：日本岛津；光学显微镜等。
实验方法
叶绿体的提取方法
叶绿体的提取分离方法主要有差速离心和梯度密度离心两种，本实验主要采用差速离
心方法，参考了相关的叶绿体提取方案[5-9]，安排了五种不同的萃取剂，如表 1 表所示：
表 1 叶绿体萃取方法
Table 1 Extraction Motheds of Chloroplast
萃取方法 萃取剂组成
A 蒸馏水
B %NaCl、 抗坏血酸钠溶液，
C STN 提取液()：400 mmol/ L 蔗糖, 50 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L NaCl
D 缓冲液 A(pH )：50 mMTris、25 mM EDTA、 M NaCl、 M 抗坏血酸；缓冲液 B( pH
)：50 mM Tris、25 mM EDTA、1. 25 M NaCl、10 mM 巯基乙醇、％BSA
E NaCl，
提取的工艺路线为：
原料预处理（清洗、4℃黑处理 12-24h）→加萃取剂（液料比 1：2）→匀浆→过滤→
离心（200×g，10min）→高速离心（10,000×g，20 min）→冷冻干燥→样品
叶绿体提取率测定
1）提取得率的计算
100% ×菠菜叶片质量（干重）
质量冷冻干燥后暗绿色粉末）＝叶绿体提取率（
2）悬浮液中叶绿体的浓度的测定方法
试验中用分光光度-丙酮法对叶绿素浓度进行测定，叶绿体浓度可以用叶绿素浓度（CT）
表示。测定方法[10]：取 50μl 叶绿体悬浮液溶于 25mL 刻度试管中，加入 18mL 85% 的丙酮
溶液和 蒸馏水，在 652nm 波长下测定吸光度，并按 Arnon 公式计算叶绿素含量,如
下：
652ODCT =
CT － 叶绿体浓度(mg• mL-1) （注：结果乘以稀释倍数）
OD652 － 652nm 波长下测定的光密度值（吸光值）
－ 叶绿素 a 和叶绿素 b 在 652nm 处的等吸光系数
提取叶绿体的物理性质检测
1）冻干叶绿体的溶解性
取 不同提取方法制取并冷冻干燥后收集的叶绿体分别溶于 10mL 蒸馏水；
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mol/L NaCl 溶液；及 pH 分别为 和 ， mol/L 的磷酸缓冲液，振摇均匀后放置 24
小时，观察其溶解性。
2）叶绿体的紫外可见光谱学性质
将制备好的叶绿体稀释为浓度约为 1mg/mL 的溶液。用紫外可见分光光度计在
190nm-800nm 范围内进行扫描。
3）叶绿体镜检观察
取一滴提取过程中收集的叶绿体悬液滴于载片上，加盖片在普通光镜油镜下（放大倍数
1000 倍）下观察叶绿体的完整性和纯净度，并拍照。
提取的叶绿体脱除 SO2 活性测定
取各方法提取的已知浓度的叶绿体悬浮液于 为 的磷酸缓冲液中， 反
应液组, 对照组成分见表 2。其中 SO2使用液由 NaHSO3配制并测定其中 SO2的实际含量。
反应在室温（25℃）下，振荡进行, 200w 日光灯模拟阳光，反应进行到 15min, 30min, 60min,
90min 后吸取反应液过滤，测定 SO2含量。
表 2 叶绿体催化去除 SO2活性试验安排表
Table 2 Experimental arrangement for testing of removal rate of SO2 by Chloroplast
磷酸缓冲液(mL） SO2使用液（mL） 叶绿体悬浮液（mL）
1 反应组 49 50 1
2 对照组 1 49 50 蒸馏水 1
3 对照组 2 0 50 蒸馏水 50
4 空白 49 0 蒸馏水 51
叶绿体催化去除 SO2的活性大小以其催化去除 SO2的速率表示，SO2去除速率的计算公
式如下：
tVC
nSOSO
T ∗∗
∗∆=∆ 22
△SO2- 叶绿体催化去除 SO2速率(mg/(mg·叶绿体·min)）
V －反应用叶绿体悬浮液体积(mL)； t －测定用时间(min)；
n －叶绿体的稀释倍数； CT－ 叶绿体浓度(mg/mL)。
叶绿体催化去除 SO2活性稳定性研究
测定在 4℃冰箱贮藏 1 个月，2 个月，3 个月后叶绿体催化去除 SO2活性的稳定性：以
叶绿体催化去除 SO2保存率表示。叶绿体催化去除 SO2活性保存率计算公式如下，选速率测
定反应时间为 30min。
%100
20
2 ×∆
∆=
SO
SOS nn
Sn - 叶绿体储存 n 个月以后催化去除 SO2活性的保存率 （%）
△SO2n － 叶绿体储存 n 个月以后催化去除 SO2的速率
△SO20 － 新制取的叶绿体催化去除 SO2的速率
2 结果与讨论
不同方法提取叶绿体的提取率比较
500g 预处理的新鲜菠菜叶，经不同提取方法分离提取后制得的冻干的叶绿体粉末重量
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及相应提取率（菠菜叶测得水份含量为 %），见下表 3。
表 3 不同方法提取的叶绿体产率
Table. 3 Extraction efficiency of chloroplasts
提取方法 叶绿体得量(g) 产率(%)
A
B
C
D
E
由表 3 可知，方法 C 产率最高为 %；其次为 A、E 方法；B、D 方法的产率最低且
远小于其他法。在提取过程中发现，在 2 倍体积蒸馏水条件下匀浆得到的菠菜汁液的 pH 为
，则可推测 B、D 法提取率过低的原因可能在于这两种方法提取液的 pH 值过小而至，
在提取过程中也发现这两种方法的匀浆均不彻底，叶片很难磨碎，叶绿体较难分离出来，这
个结论与此部分结论可由下一步镜检进一步证明。
提取叶绿体的物理性质比较
叶绿体的溶解分散性
五种叶绿体的冻干样品与溶解性如图 1 所示，从结果可知，叶绿体 C 冻干样品的溶解
性相对较好。
冻干样品 A 冻干样品 B 冻干样品 C 冻干样品 D
冻干样品 E
溶解性 A 溶解性 B 溶解性 C 溶解性 D 溶解性 E
图 1 冷冻干燥样品及溶解分散性（在 pH 为 的缓冲溶液中的溶解情况）
Fig. 1 Result of lyophilization of extracted chloroplasts and their solubility
不同方法提取的叶绿体的紫外可见扫描图谱
五种叶绿体溶解后，在 190nm-800nm 范围内紫外可见光光谱扫描图谱如下图 2 所示。
由结果可知，萃取剂 D 能够较好的保护叶绿体不被破坏，且提取叶绿体的纯度较高。
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200 300 400 500 600 700 800
吸
光
度
值
(A
bs
)
波长 (nm)
叶绿体A
叶绿体B
叶绿体C
叶绿体D
叶绿体E
图 2 不同方法提取叶绿体的紫外可见光谱扫描图
Visible light and UV wavelength scan of the different chloroplast extracts
叶绿体完整性的观察
在普通光学显微镜下观察到很多完整的叶绿体，呈绿色橄榄形、近圆形，大小在 2-7um
左右。在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒，观察图如下，显微镜照
片如图 3 所示（放大倍数为 1000）。从图 3 结果中可以看出，叶绿体 D 能够较好维持叶绿
体的完整性，并具有较高的纯度；叶绿体 B 次之；叶绿体 C、E 和 A 被破坏程度较高。图 3
显微镜检结果与图 2 紫外可见光光谱扫描分析结果基本吻合。
叶绿体Ａ 叶绿体Ｂ
叶绿体 C 叶绿体 D
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叶绿体 E
图 3 叶绿体的显微镜照片（放大倍数 1000 倍）
Microphotograph of chloroplasts (×1000)
不同萃取剂提取的叶绿体对催化去除 SO2活性的影响
五种萃取剂得到的叶绿体催化去除 SO2活性随时间变化见图 4，由图可知叶绿体 A 催化
速度在前 30min 里最大，而后迅速减小，叶绿体 B 和 C 都经历了一个催化活性先增大再减
小的过程，叶绿体 D 初始催化活性仅次于 C，此后迅速减小。叶绿体 A 催化速度在 30min
后减小较快的可能原因在于：一、此时溶液中亚硫酸盐浓度较少；二、叶绿体催化剂活性在
强光下活性被破坏。此外综合以上的分析，虽然叶绿体 B、D 完整性最好，但 B、D 催化去
除 SO2的速度低于其他样品，由此可推测叶绿体应用于 SO2的去处效果与叶绿体的完整性并
无太大关系，这在一定程度上支持了 SO 催化去除 SO2 的假说[11-13]。叶绿体的破坏更易于
PSO 与 SO2的接触从而加速了 SO2的氧化去除。
图 5 为叶绿体 A、C（浓度分别为 mg/mL， mg/mL）对 SO2催化去除情况
与缓冲液中 SO2的去除情况，以及 NaHSO3中 SO2自然氧化的对比。从对照组 2 的曲线我们
可以看到，SO2 的自然氧化速度是很慢的；而叶绿体 A 在反应 30min 后其所含的 SO2 已很
少，这点在一定程度上证实了以上对叶绿体 A 在 30min 以后催化脱去 SO2速率快速降低原
因的推测。
15min 30min 60min 90min
0
20
40
60
80
100
SO
2氧
化
速
度
[m
g/
(m
g叶
绿
体
. m
in
]
时间(min)
A法提取样
B法提取样
C法提取样
D法提取样
E法提取样
图 4 不同叶绿体催化去除 SO2效率
Fig. 9 Catalytic removal efficiency of SO2 by different chloroplats
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叶绿体催化去除 SO2活性稳定性规律研究
各种方法提取的叶绿体在其提取液中悬浮并于 4℃保藏，稳定性试验结果见下图 6。 由
结果可知，各种法方提取的叶绿体在 1 个月内对 SO2的催化去除都有很好的稳定性，但随时
间的增加，叶绿体 D 催化去除 SO2 的活性降低较快；其次为 A；而其他几种法方叶绿体催
化活性很稳定，尤其是 C 方法提取的叶绿体， 活性在三个月时间内基本没有变化。因此，
C 方法提起去的叶绿体活性相对最稳定；其次为 B、E；A 方法；D 方法活性下降最快。
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
10
20
30
40
50
60
有
效
SO
2
浓
度
(p
pm
)
反应时间(min)
叶绿体A
叶绿体C
缓冲液对照
自然对照
1 2 3
0
20
40
60
80
100
催
化
SO
2活
性
保
存
率
(%
)
时间 （月）
叶绿体A
叶绿体B
叶绿体C
叶绿体D
叶绿体E
图 5 叶绿体处理及其与对照的比较 图 6 不同方法提取叶绿体贮藏稳定性
Fig. 5 Comparison between controls and chloroplasts treated samples Storage stability of chloroplasts
3 结论
通过本实验采用不同萃取方法提取的叶绿体功能性质的比较，结果总结如下：
（1）不同方法提取叶绿体的产率不同，C 方法提取率最高，其次为 A、E，最后为 B、
D。各方法经冷冻干燥的样品溶解性不好，考虑其在试验中的适用性，在提取过程中叶绿应
在高速离心后制备成高浓度叶绿体悬浮液保存备用。
（2）紫外可见扫描和显微镜检的结果表明，各方法提取的叶绿体的纯度和完整性不同，
其中 D 方法提取叶绿体完整性和纯度最高，方法 B 次之；方法 C、E 和方法 A 提取方法叶
绿体被破坏程度较高，提取液成分复杂，其中 A 方法提取叶绿体的完整性最差。
（3）叶绿体 A、E 催化去除 SO2 的速度总体较快，B、D 次之，C 催化去除二氧化硫
的速度最慢。提取的叶绿体催化脱除 SO2的效果与叶绿体完整性无必然联系。
（4）各种方法提取的叶绿体在 4℃冷藏条件下，短时间内对 SO2 的催化去除都有很好
的稳定性。其中 C 方法提起去的叶绿体活性相对最稳定，其活性在三个月时间内基本没有
变化；其次为 B、E、A 方法；D 方法活性下降最快。
综上所述，考虑产率、脱除 SO2的效率，得出本实验的最佳提取工艺条件为：新型菠菜
洗净嫩化后加入 2 倍重量的蒸馏水匀浆过滤，200×g 低速离心 10min，再 10000×g 高速离
心 20min，经冷冻干燥后得到较好样品。
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