（生物科技行业）详情见
此表湖南师范大学生物学
实验中心
10542_3_g_1
目录
1．湖南师范大学生命科学学院本科学生 2002年以来发表论文和获奖情况
2．湖南师范大学生命科学学院本科学生研究创新性实验优秀论文（报告）选编
1．湖南师范大学生命科学学院本科学生 2002年以来发表论文和获奖情况
（1）．发表的论文
作者姓名,专业年级,论文（作品）名称,刊名称和发表年份，卷（期）
杨筱慧,2000级生物科学,湖南西部丘陵山区洪水成因的调查分析,湖南教育学院学报
2002，20（5）
何志恒,1999级生物科学,睡眠研究的科学前沿,生命科学研究 2002，（21）
罗小琳,2000级生物科学,心脏原基的起源和发育,生命科学研究 2002，（21）
鲍峰,2000级生物科学,心脏壁肌的发育,生命科学研究 2002，（21）
颜峰,2000级生物技术,时序调控小分子 RNA的研究进展,生命科学研究 2002，（21）
吴红霞,2000级生物科学,脊椎动物心脏形态发育的转录调控,生命科学研究 2002，（21）
孙亚兰,2000级生物科学,miRNA—一类新的调控微小 RNA,生命科学研究 2002，（21）
李莉,1999级生物科学,羰基毒化与阿尔茨海默病的相关性,《老年痴呆发病机理与药物研
究》盛树力主编.科学技术文献出版社出版 2003
秦旺华,1999级生物科学,中西医结合研究血瘀证本质的现状及进展,现代中西医结合杂志
2004,13(20)
向丹,1998级生物科学,冬眠乌龟体液与组织中可溶性蛋白质的 SDS电泳及荧光分析,中国科
学学报 2004,1(11)
秦旺华,1999级生物科学,
Biochenicalrelevancebetweenoxidative/carbonyIstreesandelevatedviscosityoferythr
ocytesuspensions,CLINICALHEMORHEOLOGYANDMICROCIRCULATION2004,（2）
秦旺华,1999级生物科学,血瘀证本质与血液流变学和羰基应激的相关性,中华中西医杂志
2004,5(21)
陈雄,1999级生物科学,西方长寿与衰老研究史精要,生命科学研究 2004,8(4)
李小聪、易斌,1999级生物技术,
ThepreparationandCatalyticallyactivecharacterizationofpapainimmobilizedonmagnet
icCompositemicrospheres,ENZYMEandMICROBIALTECHNOLOGY2004,35:15-21
邬勇,2000级生物技术,维生素 D受体雌激素受体-a基因多态性与骨质疏松的研究进展,中
华老年医学杂志 2005,24(6)
李莉,1999级生物科学,
Substantialreactionbetweenhistamineandmalondialdehyde:AnewobservationofCarbonyl
stress,Neuro-endocrinologyletters2005,26(6)
王鑫慧,2000级生物技术,冬眠状态乌龟尿液的生物学特性及生化分析,湖南师范大学自然科
学学报 2005,3
李莉,1999级生物科学,老年痴呆的发病机理与羰基应激,中华现代医学与临床 2005,（7）
向丹,1998级生物科学,从细胞复制衰老看动物整体衰老,中国科学学报 2005,2(2)
秦旺华,1999级生物科学,细胞内蛋白质水解阻抑与脂褐素形成和衰老的相关性,中国老年学
杂志社 2005,25(2)
陈威华、邓梅春、黎冠、康园,2000级生物科学,虎纹蜘蛛毒素—I对大鼠急性内脏疼痛的
抑制性效应 w-芋螺毒素的比较研究（英文稿）,中国生物化学与分子生物学报 2005，21
（1）
陈威华、邓梅春、黎冠、康园,2000级生物科学,一种新型 N-型电压敏感性钙通道拮抗剂虎
纹蜘蛛毒素-I对大鼠内脏痛模型镇痛作用的研究,第一军医大学学报 2005，25（1）
杨娜、周杰、邬勇,2000级生物技术,Nomajoreffectoftheinsulin-
likegrowthfactorIgeneonbonemineraldensityinpremenopausalChinesewomen,BONE2005,3
6:694-699
佘巧玲,2002级生物科学,高中生物探究式实验教学设计研究及案例分析,生命科学研究
2006,10（3）：149-153
刘连,2002级生物基地,人类高度进化保守基因 hnulp1中转录抑制区段的定位,生命科学研
究 2006,10（3）：194-199
刘连,2002级生物基地,hnulpI,abasichelix-loop-
helixproteinwithanoveltranscriptionalrepressivedomain,inhibitstranscriptionalac
tivityofserumresponsefactor,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications2006,3
43:973-981
戴悦,2006级生物科学,人类心脏特异表达基因 pygo1的克隆与功能研究,湖南师范大学自
然科学学报 2008（已接收）
（2）获奖情况
姓名,专业年级,获奖项目,获奖等级,获奖年份
刘欣文,2001级生物科学,校“未来教育家奖”竞赛,三等奖,2003
陈琳,2000级生物科学,校“未来教育家奖”竞赛,三等奖,2003
付国花,2001级生物科学,校“未来教育家奖”竞赛,三等奖,2003
潘艺,2000级生物科学,“英特尔杯”全国信息化教学设计大奖赛,创意二等奖,2004
李东勇,2000级生物科学,“英特尔杯”全国信息化教学设计大奖赛,创意二等奖,2004
童英,2000级生物科学,“英特尔杯”全国信息化教学设计大奖赛,优秀奖,2004
莫敏俐,2004级生物基地,校“艾滋病科普知识竞赛”,一等奖,2004
宫钰,2004级生物基地,校“艾滋病科普知识竞赛”,二等奖,2004
朱文敏,2004级生物基地,校“艾滋病科普知识竞赛”,三等奖,2004
刘连,2002级生物基地,校“未来教育家奖”竞赛,优秀奖,2004
谢冰花,2002级生物科学,校“未来教育家奖”竞赛,优秀奖,2004
彭月玲,2003级生物基地,校第四届多媒体课件制作大赛,三等奖,2005
孙丽娜,2003级生物基地,校“未来教育家奖”竞赛,优秀奖,2005
郭曼,2004级生物基地,校首届“心理健康教育知识竞赛”,三等奖,2005
熊振宇,2004级生物科学,校“我的职业生涯规划”方案设计竞赛,一等奖,2005
郭曼,2004级生物科学,校“我的职业生涯规划”方案设计竞赛,优秀奖,2005
唐薇,2004级生物基地,校“我的职业生涯规划”方案设计竞赛,优秀奖,2005
王玉刚,2004级生物基地,湖南省第七届“挑战杯”动感地带大学生课外学术科技作品竞赛,
特等奖,2006
于峰,2004级生物基地,湖南省第七届“挑战杯”动感地带大学生课外学术科技作品竞赛,二
等奖,2006
莫敏俐,2004级生物基地,校“未来教育家奖”竞赛,优秀奖,2006
李昀,2004级生物技术,湖南师范大学实验技能竞赛,一等奖,2006
夏浪,2005级生物科学,,一等奖,
吴莎莎,2005级生物技术,,一等奖,
陈丹,2004级生物技术,,一等奖,
朱玉梅,2003级基地班,,二等奖,
周洁,2004级生物科学,,二等奖,
吴渊,2005级生物技术,,二等奖,
何海钢,2004级生物科学,,二等奖,
龚琳,2004级生物科学,,二等奖,
张阳,2004级生物科学,,二等奖,
刘凯,2005级基地班,,二等奖,
陈倩,2004级生物科学,,二等奖,
黄琼,2004级生物技术,,二等奖,
姜含芳,2005级基地班,,二等奖,
唐贵华,2003级生物科学,,二等奖,
覃梅芳,2004级生物科学,,三等奖,
莫敏俐,2004级基地班,,三等奖,
廖小兵,2004级生物技术,,三等奖,
刘宇,2004级生物科学,,三等奖,
陈显胜,2005级生物科学,,三等奖,
钟欢,2003级生物科学,,三等奖,
杨清,2004级生物科学,,三等奖,
刘女英,2004级生物技术,,三等奖,
罗贵朋,2005级生物科学,,三等奖,
伍平,2005级生物科学,,三等奖,
刘坤,2005级生物科学,,三等奖,
周丽娅,2003级基地班,,三等奖,
黄静,2004级生物科学,,三等奖,
马仲辉,2004级生物科学,,三等奖,
易小慧,2005级生物科学,,三等奖,
梁小平,2005级生物科学,,三等奖,
蒋东征,2005级生物科学,,三等奖,
唐贝妮,2005级生物科学,,三等奖,
王玉刚,2004级基地班,第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛,三等奖,2007
刘华友,2004级生物科学,国家奖学金,,2007
欧阳书珍,2005级生物科学,国家奖学金,,2007
黄静,2004级生物科学,校教育实习优秀教案,,2007
王星,2004级生物科学,校教育实习优秀教案,,2007
刘华友,2004级生物科学,校教育实习优秀教案,,2007
王星,2004级生物科学,校教育实习优秀调查报告,三等奖,2007
邓亚飞,2004级生物科学,校教育实习优秀多媒体课件,一等奖,2007
常彬,2004级生物科学,校教育实习优秀多媒体课件,二等奖,2007
唐盈盈,2004级生物科学,校教育实习优秀多媒体课件,三等奖,2007
刘女英,2004级生物技术,湖南省优秀毕业生,,2008
刘标,2004级生物科学,湖南省优秀毕业生,,2008
莫敏俐,2004级基地班,湖南省优秀毕业生,,2008
陈超龙,2004级基地班,湖南省优秀毕业生,,2008
19人,2004级,校级优秀毕业生,,2008
王驰,2005级基地班,防近视笔,国家实用新型专利,2008
集体,2005级基地班,湖南省普通高等学校先进班集体,,2008
莫敏俐,2005级基地班,湖南省普通高等学校三好学生,,2008
2．湖南师范大学生命科学学院本科学生研究创新性实验优秀论文（报告）选编
副溶血弧菌中一具 Mg2+转运功能的 MgtE基因的分子克隆与
功能鉴定
学院：湖南师范大学生命科学学院
学生姓名：于峰学号：N41030204专业：生物技术班级 2003-2
学生姓名：姚力群学号：N41030206专业：生物技术班级 2003-2
学生姓名：李晴波学号：N41030136专业：生物技术班级 2003-1
指导老师：李东屏副教授
摘要：MgtE基因家族是最初在细菌中发现的一类具有 Mg2+转运能力的基因家族。基因组数
据库搜索显示副溶血弧菌（VibrioparahaaemolyticusRIMD2210633，VP）中存在一 MgtE基
因家族成员。我们克隆了该基因并将之命名为 VP-MgtE。并利用沙门氏杆菌突变株 MM281作
为宿主菌进行了功能互补实验。此外,该基因的表达也提高了该菌株对铝毒害的抗性。同时
我们运用定点突变的方法研究了 VP-MgtE中的保守氨基酸残基对其功能的影响。
关键词:VP-MgtE;Mg2+转运体;副溶血弧菌;定点突变；铝毒害
MolecularCloningandCharacterizationoftheVP-
MgtE,aPutativeMg2+TransporterfromVibrioparahaaemolyti
cus
YuFengLiqunYaoQingboLi
（CollegeofLifeScience,HunanNormalUniversity,Changsha410081,Hunan,China）
Abstract:MgtEgenefamily,whichwasfirstfoundinbacteria,hastheabilitytotakeupMg2+.G
enomicsequencedataindicatedthepresenceofMgtEhomologinthegram-
-
-
MgtEcouldfunctionallycomplementedasalmonellamutantMM281whichlacksinMg2+uptakecap
-
directedmutagenesisbyoverlapextensionbyPCRwasusedtostudytherolesofthekeyaminoac
idresiduesoftheprotein.
Keyword:VP-MgtE,MagnesiumTransporter,Vibrioparahaaemolyticus,Site-
directedmutagenesis,Aluminumiontoxicity
1.引言
Mg2+是生活细胞中含量最丰富的二价金属离子,其在一系列酶促反应中作为辅因子起作
用。缺失足够的 Mg2+,核糖体亚单位将会分离,同时细胞膜也会变成松弛渗漏的状态。离子
状态的镁调节许多重要的酶促代谢,还可通过特定的金属结合位点在膜蛋白通道中起作用
[1]。
Mg2+具有独特的化学特性,Mg2+具有最大的水合半径,最小的离子半径和最高的电荷密
度。其水合半径是其离子半径的 400倍。而同为丰富金属离子的 Ca2+和 Na+的相应半径比却
只有 25倍,K+的相应半径比最小,仅 4倍。
由于细胞膜给离子的进出细胞形成了一道屏障。故离子进出细胞必须通过膜上特定的
转运蛋白来实现。一般认为转运蛋白可分为离子通道和载体蛋白两大类。载体蛋白转运底
物时是与其它物质偶联进行的，具有和酶一样的底物饱和性，编码载体蛋白的基因的表达
也常常受到外界底物浓度的影响，一般是在低底物浓度时，其基因的表达水平会提高。
由于 Mg2+独特的几何特性和化学特性,有人猜测其转运系统也具独特性，细菌中的研究
支持该假说[2]。目前,整个生物界中已发现有五大 Mg2+转运家族:CorA家族,Mg2+/H+交换体,
离子通道,P型磷酸酶和 MgtE基因家族[3]。主要的 Mg2+转运家族是细菌中的 CorA家族,蛋白
拓扑分析显示其具有独特结构：N端有一个大的，酸性的周质区，C端有 2个疏水的跨膜
区，有很强的螺旋性。CorA序列上存在保守基序 GMN，是其转运 Mg2+所必需的，若 GMN基
序中有一个氨基酸突变，其转运能力就会丧失[14]。最近,Li等人利用功能克隆策略在拟南
芥中发现了一与 CorA基因结构类似的基因家族[4]。表明 CorA基因广泛分布于自然界
中。ALR1和 ALR2是在酵母中发现的一类 CorA基因，在酵母中过量表达 ALR蛋白可提高其
对铝毒害的抗性[15]。
MgtA/B是 中发现的另外两个具 Mg2+转运能力的基因，两个都是大的复
合跨膜蛋白，属于 P型磷酸酶家族。它们的表达受到低浓度 Mg2+的诱导[5]。
MgtE基因家族首先在 BacillusfirmusOF4中被 Ronald等人在寻找新的 CorA基因时发
现。目前一般认为其具有五个跨膜区。其跨膜区的分布和 CorA具相似性，都主要分布于 C
端，其 N端位于胞质区。MgtE和 CorA两基因家族在转运离子的类别上也具有部分相似
性。MgtE的突变株和 CorA一样可增强对 Co2+的抗性。MgtE可功能互补缺失
CorA,MgtA,MgtBMg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株 MM281[5],使其可在低浓度 Mg2+浓度
(<10mM)下生长。同时 MgtE也具有 Co2+,Cd2+,Mn2+等二价金属离子的转运能力。多序列比对
表明其第二和第五个跨膜区较保守[6,7]。基因组序列搜索显示 MgtE家族在古细菌，原核生
物和真核生物中都有分布，但其分布的广泛性不如 CorA家族。目前对 MgtE基因家族转运
Mg2+的分子机制还了解甚少。为了更进一步了解 MgtE基因家族转运 Mg2+的分子机制，我们
从副溶血弧菌中克隆了一 MgtE基因,将之称为 VP-MgtE，并对其进行了功能鉴定和定点突变
等实验。
2.材料和方法
2．1.菌株的生长条件
E．coliDH5α在 37℃，LB培养基中生长,必要时添加相应抗生素。副溶血弧菌于
37℃LB 中培养。需要高浓度 Mg2+才可以生长,它被用于功能互补实验,
于 37℃，Mg2+(以 MgSO4的形式添加)终浓度为 100mM,氯霉素浓度为 34μg/ml 的 LB或 N-
minimal培养基中生长。
2．2.载体，酶类及各种试剂盒
pMD18-T载体和实验中用到的所有酶类均购自大连宝生物工程有限公司。质粒纯化及胶
回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司。pTrc-99A由本室保存。
2．-MgtE基因的克隆及载体构建
VP基因组 DNA按照 RobertKFlamn[8]的方法提取。根据 VP-MgtE基因序列用
设计一对引物,并添加酶切位点 SacⅠ和 KpnⅠ。正向引物为
(TATGAGCTCGAACGAATGGCAG(SacⅠ)反向引物为(ATAGGTACCACTGGCTTAGATCAGC（KpnⅠ）)。
用高保真酶 PyrobestDNApolymerase进行 PCR扩增。回收目的片段,连接到 pMD18-T载体上,
再用 SacⅠ和 KpnⅠ酶切,定向克隆至表达载体 pTrc99A,并酶切鉴定阳性克隆。
2．4.生物信息学分析的主要软件及数据库
基因序列数据由 NCBI中获得。跨膜区分析软件为 TMHMM,多序列比对软件为 ClustalW,
常规的核酸蛋白分析软件利用 DNAMAN进行。
2．的功能互补和铝离子毒害实验
将 pTrc99A-VP-MgtE质粒电击转化进入 MM281。鉴定阳性克隆，分别挑取 MM281-VP-
MgtE,MM281-pTrc,MM281单菌落在试管中过夜培养。然后再按 50:1(50mLLB:1mL菌液)的比
例接种于含有相应抗生素的锥形瓶中扩大培养。同时测 OD600值。当 OD600达到 ～之
间时,加入 1mM/L的 IPTG进行诱导,当 OD600到达 时取出,取菌液 100μl 加入 900μl 水
中。分别稀释成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。取稀释的菌液 2μl点样于不同
Mg2+浓度的互补平板上,Al3+（以 AlCl3的形式添加）毒害中点样于 pH5,Mg2+浓度为 100mM的
LB固体培养基上。37℃倒置培养两天后观察菌落生长情况并拍照。
2．6.液体生长曲线
挑取 MM281，MM281-pTrc，MM281-VP-pTrc的单菌落在含相应抗生素的 LB中摇菌,当
OD600=～时,1200rpm离心收集细胞,用去离子水清洗两遍,以除去残留的 Mg2+,然后用
去离子悬浮。准备 7种不同浓度(0,50µM,100µM,500µM,1mM,5mM,10mM)和相应抗生素的 N-
minimal培养基,将上述准备好的培养物（起始 OD600=～）加入 N-minimal培养
基中。37℃摇菌,每两小时测 OD600一次并记录数据。共测 24h。
2．7.离子敏感性实验
按功能互补实验过程一样准备好菌液，然后点至不同浓度的金属离子板上。37℃倒置
培养 2d后观察其生长情况并拍照。
.定点突变
定点突变的方法按照分子克隆上介绍的重叠延伸诱变的方法分别设计两对引物。从野生型
VP-MgtE-pTrc99A中用高保真酶 PyrobestDNApolymerase进行三次 PCR。再 SacⅠ，KpnⅠ双
酶切，定向构建至 pTrc-99A上产生特异位点的突变。突变引物设计见表 1。再按照 的
方法进行功能互补实验。
表 1突变氨基酸，引物及克隆位点和侧翼引物:
PrimerA,5’-AGGAAACAGACCATGGAATTCGAG-3’;
primerB,5’-CAGACCGCTTCTGCGTTCTGATTT-3’.
名字突变碱基突变氨基酸突变正向引物突变反向引物侧翼引物克隆位点
（位置）
Vp-J1953AlatoGly5’AAATGGCGGGAATT5’AAGACCGCAATTCCA/BSacI,KpnI
（320）GCGGTCT3’CGCCATT3’
Vp-J2992GlytoAla5’CATCCATGGGTGCT5’GTTACCTGCAACAGA/BSacI,KpnI
（331）GTTGCAGGTAA-3’CACCCATGGA3’
Vp-J31265ApstoAla5’AGATGAATATCGCT5’CAGCAAGGGCAGGA/BSacI,KpnI
（422）CCTGCCCTTG-3’AGCGATATTCA3’
Vp-J41267ProtoAla5’AGATGAATATCGAT5’CAGCAAGGGCAGCA/BSacI,KpnI
（423）GCTGCCCTTG3’ATCGATATTCA3’
Vp-J551307AsptoAla5’TGTGATTGGCTCGT5’AGGAAAACAGACGA/BSacI,KpnI
（436）CTGTTTTCCT3’AGCCAATCACA3’
Vp-J61316GlytoAla5’GACTGTCACTGCTG5’GACAAGCCAATCACA/BSaI,KpnI
（439）TGATTGGCTT3’AGCAGTGACA3’
Vp-J71319LeutoSer5’TGTGATTGCCTTGT5’AGGAAAACAGACAAAA/BSacI,KpnI
（440）CTGTTTTCCT3’GGCAATCACA3’
3．结果与讨论
3．-MgtE与 MgtE基因家族其它成员相比显示部分序列相似性
VP-MgtE的编码一个含 451个氨基酸的蛋白质。跨膜分析显示其具有五个跨膜区。其与
BacillusfirmusOF4和 Providenciastuartii中的 MgtE序列分别具有 %,%的相
似性。多序列比对表明它们在第二和第五个跨膜区具有较高的相似性。结果见图 1。
图 1VP-MgtE和 MgtE家族其它成员运用 ClustalW的比对结果。红色方框表示突变后对其功能影响很大者，
蓝色表示对其功能影响较少者，绿色表示无影响。图中标出的五个跨膜区（TM1-TM5）为根据 VP-MgtE的蛋
白拓扑结构预测所得到。比对中其它基因 GenBank登陆号分别为 ：
U18744;:U23806;Human;NM_173854.
3．-MgtE可功能互补 MM281的生长
MM281是一类丧失了 CorA,MgtA,MgtBMg2+转运系统的沙门氏杆菌突变株。它只能在高浓
度 Mg2+(>100mM)下达到最佳生长速度。结合功能互补的方法，它可作为一个研究 Mg2+转运的
很好的系统。表达了 VP-MgtE的 MM281重组菌株可在低浓度 Mg2+情况下生长,甚至在不加
Mg2+的 LB培养基上生长。而其阴性对照 MM281,pTrc99A-MM281则只能在大于 10mM的 N-
minimal培养基上生长。（见图 2）。结果可以说明 VP-MgtE的表达互补了 MM281在 Mg2+转运
上的功能缺失，使之重新具有了 Mg2+转运能力。从而使其可在含低浓度（<10mM）Mg2+的培
养基中生长。生长曲线结果也再次证明了目的基因的转运能力。由图 3(A)和图 3(B)可知,
表达了目的基因的 MM281转化子可在 100µM的 N-minimal培养基中生长。而阴性对照只能
在 10mM的培养基中生长。
图 2MM281。MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在添加了不同 Mg2+浓度的 N-minimal互补平板上的生长结果.
3．-MgtE的表达改变了 MM281的离子敏感性
已有研究显示,当细菌中积累一定量的重金属离子(如 Co2+,Cd2+,Mn2+,Zn2+)时，就会对
细菌本身产生毒害作用并使之死亡。由图 4可知,表达了 VP-MgtE基因的转化子增加了对
Ni2+，Co2+,Mn2+,Cu2+的敏感性,当 Ni2+，Co2+,Mn2+,Cu2+离子浓度达到 500µM,500µM,500µM,1mM
时,表达了目的基因的菌株就会死亡，我们可以认为 VP-MgtE有
Co2+,Cd2+,Mn2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+,Cu2+离子的转运能力。我们也做了 Ca2+的实验,但没有发现差
别。
图 3-AMM281,MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在 10mMMg2+的 N-minimal培养基中的生长结果。实验结果为三次
不同时间下结果的平均值。MM281（实心圆），pTrc（空心圆），VP-MgtE（实心三角）
图 3-BMM281,MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在 100µMMg2+。的 N-minimal培养基中的生长结果。实验结果为 3
次不同时间下结果的平均值。MM281（实心圆），pTrc（空心圆），VP-MgtE（实心三角）
-MgtE的表达提高了 MM281对铝毒害的抗性。
研究表明当 pH<6时铝离子就可从结合态释放出来产生毒害作用[16]。我们在 pH=5时研究了
VP-MgtE的铝抗性，我们发现 VP-MgtE的表达可提高 MM281对铝毒害的抗性。结果见图 5。
同时，为了证实确实是 Al3+而不是 Cl-在起毒害作用，我们也做了 KCl的实验,与对照相
比，我们没有发现区别（数据未列出）。
图 4MM281,MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在含有不同金属离子浓度的 N-minimal固体培养基上的生长结果。
3．5．定点突变改变了 VP-MgtE的 Mg2+转运能力。
我们运用定点突变的方法对 VP-MgtE蛋白中的 7个氨基酸进行了突变，由图 6可以发现，
VP-J1，VP-J2，VP-J5，VP-J6的突变使目的蛋白的 Mg2+转运能力有很大的降底，VP-J4的
转运能力和目的蛋白相比，有轻微的降底，VP-J3，VP-J7出乎我们意外，在 10µM情况下和
目的蛋白相比这两个突变株的转运能力竟然提高了。这些突变都集中在第 2和第 5跨膜
区。在这两个跨膜区的每个突变对其转运能力都有影响，这也说明了这两个跨膜区在 Mg2+
装运中的重要性。
3．6.讨论:
副溶血弧菌是于 1950年在日本的一次爆发性食物中毒中分离发现的。该菌存在于近海
的海水，海底沉积物和鱼类，贝壳等海产品中间。是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见
的一种病原菌。我们从副溶血弧菌中克隆了一具 Mg2+转运能力的 MgtE基因家族成员：VP-
MgtE。并对其进行了功能的初步研究。
图 5MM281,MM281-pTrc,MM281-VP-MgtE在含不同铝离子浓度的 LB平板上的互补结果。LB固体培养基
pH=5,Mg2+离子浓度为 100mM。
序列分析显示 VP-MgtE的蛋白序列与目前已知的 MgtE家族成员显示了部分相似性，多
序列比对表明，它们在第 2和第 5个跨膜区和其它成员有较高的相似性。在一些特定的保
守基序中 MgtE家族成员具有完全的相似性，如第 5个跨膜区的 DP基序。最近，
AngelaGoytain等人从人类中克隆了一 Mg2+转运基因：SLC41A1，它具有 10个预测的跨膜
区，该基因的表达可受 Mg2+浓度的影响，在低浓度 Mg2+下表达会上升[9]。序列分析表明它
有两个大的跨膜片段和细菌中的 MgtE家族的第 2和第 5跨膜序列具有较高的相似性，在第
5个跨膜区保守性最高，我们运用定点突变的方法研究了这些保守区域，结果和我们预测中
一样，当我们把这两个跨膜区中的一些保守氨基酸突变以后，它的镁离子转运能力和野生
型相比有明显下降，甚至是完全丧失。同时我们还从不同的菌种克隆了 3个 MgtE家族成员
并进行了功能鉴定(结果未列出)，它们在这些保守的基序中也是完全一致的，所以我们推
测这些保守的氨基酸是 MgtE家族发挥 Mg2+转运功能所必需的。
图 6定点突变结果。图中 WT表示未进行突变的 VP-MgtE，其他标示代表的突变位点见表 1。
数据库搜索显示在古细菌（如 UnculturedMethanogenicarchaeonRC-1）和真核生物
（如锥虫，鸡，人）中都有发现，我们推测 MgtE和 CorA家族一样也是一个广泛存在的基
因家族，我们在植物和真菌中没有发现该基因家族成员，但我们不能说它在这些生物中就
不存在，可能只是因为 MgtE家族序列相互间相似性较低在数据库的搜索中才比较难于发
现。SLC41A1在其它二价离子的转运上和细菌中的 MgtE有所不同，甚至 MgtE各个成员间转
运其它二价离子也是有差别的，我们认为这些基因在转运底物上的多样性主要是由这些基
因在其它部位序列的多样性造成的。
最近，Mao等发现拟南芥中的 ATMGT7转运 Mg2+是受到 pH值的影响的[10]，我们也进行
了类似的实验，实验结果表明 VP-MgtE转运 Mg2+不受 pH值的影响。同时我们在实验中还发
现 VP-MgtE在高浓度的 Mg2+下的生长反而不如在低浓度的情况下生长的快（数据未列出），
因此我们猜测 VP-MgtE可能为一类高亲和性,转运镁离子的载体蛋白，为了确定其与何种离
子偶联进行 Mg2+的转运，我们进行了钠和氯离子做为偶联剂的实验，但与对照相比我们没
有发现区别。我们也运用半定量 PCR的方法研究了该基因在低 Mg2+浓度的情况下该基因的
表达变化，我们发现该基因的表达不受 Mg2+浓度的影响（结果未列出）。
同时，SusanaMerino等人发现，Aeromonashydrophila菌株中 MgtE基因的突变可影响
其游动能力和生物膜的形成[11]。我们在前面已经提到，Mg2+对细胞膜的维持和稳定具有很
大的作用，所以可以认为，正是 MgtE的缺失而影响了其细胞内 Mg2+的积累从而最终影响了
其细胞膜的结构。这给 MgtE基因家族的 Mg2+转运能力提供了新的证据。
土壤酸化是影响全球农业收成的一个重大因素。其中土壤酸化最重要的一个方面就是
铝毒害的产生，因为铝是地表含量最丰富的元素，在 pH>6的情况下，铝主要是以各种结合
态的形式存在，不产生毒害作用，但一旦 pH<6铝就以离子的形式释放出来，对农作物和其
他各种生物产生毒害作用[16]，目前对生物特别是植物抵抗铝毒害的分子机制还知之甚少，
我们的研究为更好的理解生物抗铝毒害的分子机制提供了新的证据。Li等人通过同位素示
踪实验发现 Al3+可以抑制 CorA家族基因 ATMGT1的 Mg2+转运[4]，这说明这可能就是 Al3+产生
毒害作用的一个靶标。正是 Al3+抑制了生物对 Mg2+离子的吸收，从而影响了生物的正常生理
活动而产生了毒害作用。人们也早就观察到在铝毒害存在的情况下，植物有缺镁的生理现
象[16]。这也从一个方面证实了铝毒害产生的分子机制。
总之，我们从副溶血弧菌中克隆了一 Mg2+转运基因并对其进行了功能的初步研究。进
一步的研究可集中于 VP-MgtE转运 Mg2+的直接证据，如原子吸收分光光度实验，同位素示
踪实验。及其转运 Mg2+是否是离子偶联的，又与何种离子偶联。从而为更好地理解 MgtE家
族转运 Mg2+的分子机制提供新的信息。
参考文献（References）：
[1]Smith,RL.,andMaguire,:Unusualtransporters
,217–226.
[2]Gibson,.,Bagga,andMaguire,
um:TheinfluenceofnewmutationconferringCo2+resistanceontheCorAMg2+transporte
:2753–2762.
[3]:263-267.
[4]LiL,AnaFT,RevelSM,RichardCG,
,13:2761–2775.
[5]:ProkaryoticP-
typeATPasesthatmediateMg2+:319–328.
[6]SmithRL,ThompsonLJ,,aputative
:1233-1238.
[7]TownsendDE,EsenwineAJ,GeorgeJ3rd,BrossD,MaguireME,
gtEMg2+transporterfromProvidenciastuartiiandthedistributionofmgtEingram-
:5350-5354.
[8]FlammRK,HinrichsDJ,
:157-61.
[9]AngelaGoytain,,aMg2+tra
nsporterwithsimilaritytoprokaryoticMgtEMg2+.
21,337-342
[10],anarabidopsisgeneencodingalow-
affinitymagnesiumgtransportorandanalternativesplicingvariant(待发表)
[11]SusanaM,RosalinaG,+Transportproteinisinvolvedinaer
(2):189-195.
[12]MakinoK,OshimaK,:a
(9359):743-749
[13]:alaboratorymanual,
ingharborlaboratorypress,coldspringharbor,.
[14]MaryAnnSzegedy,+transporproteinofSalmonellat
:319-328
[15]
:1727-1732
[16]:
1101-1109
水稻胚乳中 wee1基因表达模式的研究
湖南师范大学生命科学学院
学生姓名：毛凯壮 N42030236专业：生物科学班级：2003级 2班
唐贵华 N42030119专业：生物科学班级：2003级 1班
指导教师：姜孝成教授
实验主要设备和材料：实验主要设备和材料：实验主要设备和材料：
PCR仪、高速冷冻离心机、紫外检测仪、凝胶成像分析系统、超低温冰箱；
日本晴（粳稻）不同发育时期的胚乳（1—15d）
实验目的：实验目的：实验目的：
拟初步研究水稻胚乳中 wee1基因表达的模式，了解 wee1在水稻胚乳发育
不同时期表达量的差异及作用。
实验原理：实验原理：实验原理：
胚乳是水稻种子的主要成分，其发育的正常与否直接关系到水稻的产量。
水稻等禾谷类作物在胚乳发育早期的细胞周期存在核内复制现象，Wee1基因表
达对核内复制有调节作用从而影响胚乳的发育及其大小。
实验过程：实验过程：实验过程：
提取水稻不同发育时期胚乳的总RNA，通过两步法RT-PCR检测并确定wee1表
达的时期及在不同时期的表达量的差异。
1、RNA提取
分别提取日本晴不同发育时期胚乳的总RNA
药品配制及器皿处理
所使用到的金属和玻璃器皿经蒸馏水和超纯水洗净后用锡箔纸包装，180℃
烘烤 12h。塑料制品则用新配制的 %DEPC于 37℃浸泡 12h，并且高压灭菌
30min。
抽提缓冲液（为防止 RNA酶降解，用 %DEPC处理过的超纯水配制后高压
灭菌 30min）：200mMTris-HCl()，100mMLiCl,50mMEDTA,%SDS，
2%PVP(Sigma分装,PVP40)；2%BSA(Sigma分装)；10mMDTT(Sigma)(PVP，BSA和
DTT先分别配成母液，μm 过滤除菌，在使用前加入)。
蛋白酶 K（Merk,Germany）。
饱和酚配制的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。
氯仿/异戊醇（24:1）。
2MLiCl：DEPC处理，高压灭菌 30min。
8MLiCl：DEPC处理，高压灭菌 30min。
3M乙酸钠，：DEPC处理，高压灭菌 30min。
70%乙醇：用 %DEPC处理过的双蒸水配制。
100%乙醇。
操作过程
（1）将适量体积的抽提缓冲液移至 100ml离心管中，预热至 56℃，在使用之前
加入 PVP、BSA及 DTT至终体积 20ml，充分混匀。研钵和研杵用液氮预冷。
（2）从-80℃冰箱中取出 胚乳放入预冷的研钵中，加入液氮后，将胚乳充
分研磨成粉末，倒入上述预热的抽提缓冲液中，颠倒离心管使之充分混匀。
（3）待离心管冷却至室温，加入 200μl 蛋白酶 K（20mg/ml），37℃水浴
10min。
（4）加入 12ml预热的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），用力摇动数分钟后，置于
56℃水浴 20min，期间剧烈摇动 3-4次。
（5）4℃下 12000g离心 15min。
（6）将上清转移至一新的 100ml离心管中，离心 8min。
（7）将上清液迅速转移至一新的 100ml离心管中，加入 20ml氯仿/异戊醇
（24:1）。
（8）将混合物在冰上旋摇 5min混匀。4℃下 12000g离心 15min。
（9）用等体积的氯仿/异戊醇（24:1）将上清夜抽提两次。
（10）将上清液转移至一新的 100ml离心管中，加入 1/3体积 8MLiCl，使 LiCl
终浓度为 2M，盖紧管口，倒置几次，使之充分混匀，4℃静置过夜。使之沉淀。
（11）4℃下 12000g离心 15min，得到 RNA沉淀。
（12）小心将上层液体倒去，用 25ml预冷的 LiCl(2M)清洗沉淀。4℃下 12000g
离心 10min。
（13）小心倒去 LiCl洗液，避免动及沉淀。
（14）用 900μl 经 DEPC处理的超纯水溶解沉淀，并转移至 3支 离心管
中。
（15）加入 1/10体积 3M乙酸钠（）和 倍体积预冷的无水乙醇。-
20℃静置过夜或者-80℃静置 30min。
（16）4℃下 12000g离心 15min，得到 RNA沉淀，倒去乙醇，残留的乙醇用真空
泵吸出；然后用 1ml预冷的 70%乙醇清洗沉淀，12000g离心 5min回收沉淀，真
空泵吸出残留的乙醇。
（17）用等体积 DEPC处理过的超纯水重新溶解 RNA沉淀。灭菌超纯水稀释 5μl
充分溶解的 RNA溶液至 500μl，在 260nm下测定 OD值；另取 5l在 %的变性
琼脂糖凝胶上作电泳分析（图 1）；其余的分装后置于-80℃保存待用。
图 1日本晴发育 12d胚乳总 RNA电泳图
2、逆转录及 PCR检测
逆转录
,药品,浓度,体积,时间及温度
第一步,oligodT,25μM,1μl,将药品混合后65℃温育5min
,dNTP,10mM,1μl,
,RNA,2-5μg/ml,2μl,
,DEPCH2O,-,10μl,
第二步,迅速将装有以上混合药品的PCR管放入冰上静置1min，然后瞬时离心混匀。
第三步,10×first-strandbuffer,-,2μl,迅速将此3种药品加入PCR管中，然后37℃温育
2min
,DTT,,2μl,
,RNAsin,,1μl,
第四步,MMLVReverseTranscriptase,10μ/μl,1μl,37℃温育50min
第五步,70℃处理15min
第六步,-20℃保存
检测
根据在NCBI上查找到的粳稻日本晴wee1基因及水稻中actin基因mRNA序列设计特异性引
物如下：
wee1基因正向：5’CCTCAGCCAGAATTTCTTC3’
反向：3’GACAACTACCACTACCGTA5’
actin基因正向：5’TGTGGACGATGCCTGGAC3’
反向：3’CATTCCAGTGCGGGTCGT5’
使用以上特异性引物，以逆转录产物为模板分别对各个时期进行 PCR检测，PCR程序
为：PCR反应混合物 94℃变性 4min，42个循环的 94℃1min，52℃30s，68℃30s，
68℃1min，然后 68℃再延伸 4min。下为日本晴发育 12d胚乳逆转录后 PCR检测结果图：
图 2wee1基因和 actin基因片段逆转录 PCR产物的凝胶电泳分析
wee1扩增片段测序结果：ACATCACGCCAGATGCGCCGCAGCTCGGGAGCGGCTTCGACGCCAATAAGGAG
AATATCCCTTGCCCCAATTCTCCAGAGAAATCAGTCTGTAGGAGCAAGAGATACAAGAGAGATTGTTCCCCCAAAGGCC
TTGGCTCCAATGACATTTTTGATAGCCAGTGGATTGCTCCAGTTCAGTTTGAAGGTCTAGATGATTCAGAGGAGGAACA
GCTGAAGGAATCTAGTTCGCACAAGAGAGGTAGTTATGTCTCCCAATCGGCAGTGGCTCTTCGCTGCCGGGTGATGCCT
CCACCATGCATCAGGAATCCATACCTCAATACAGATCATCAAATAGATGATAATGTTTTTGGTGGGAGACAATGCAAAT
CATCAGGGTTTTCTCCTTCTGTTGATGGTGATGGCATAA
结果与分析：
分别提取从第 4d到第 15d的水稻胚乳总 RNA并用特异性引物进行检测，在这些时期我
们均检测到了 wee1基因的表达，通过选择 4、6、8、10、13、15d的胚乳总 RNA做半定量 P
CR分析，可以初步看出 wee1基因的表达在第 4天最多，之后开始逐渐下降，趋势如图 3：
也就是说水稻胚乳的细胞在发育到第四天后开始大规模进入核内复制阶段，在这个阶段细
胞只进行 DNA复制而不进行有丝分裂，结果使细胞内 DNA含量成倍增长，从细胞形态角度
观察，可看到细胞在这个阶段开始明显增大，积累更多的营养物质。因而我们说 wee1的表
达对粮食作物的产量提高具有很大的影响，LARKINS等研究玉米中 wee1基因的表达结果显
示，玉米中的 zmwee1基因在第 9天开始表达，在第 17天停止表达，并在第 15天达到最高
表达量。这表明不同的植物中 wee1基因表达存在差异，而且这种差异很有可能决定了种子
的体积。
图 3不同发育时期胚乳中 wee1基因表达的半定量 PCR检测分析
三种免疫纳米磁性珠检测病原菌的对比研究三种免疫纳米磁性珠检测病原菌的对比研究三种免疫纳米磁性珠检测病原菌的对比研究
学院：生命科学学院
姓名：张娟学号：N43030117专业：生物基地班级：03级基地班
李惠学号：N42030124专业：生物基地班级：03级基地班
指导教师：邓乐教授
摘要：本研究成功地合成了三种磁性载体即氨基、醛基、环氧 IDA-Cu磁性载体，并通
过各自的功能基团，将人 IgG固定于载体表面，制得三种免疫磁性载体。将其用于致病菌
金黄色葡萄球菌（）和 G群链球菌(GroupGStreptococcus)的检测，能够达到方便
而快速地识别和分离这两种病原菌的目的。三种载体检测性能的对比研究表明：醛基磁性
载体的捕获和分离效果最佳，且用乙醛—右旋糖苷包被醛基免疫磁性载体可以消除交叉反
应。此研究还表明：将不同的生物功能基团连接到合成的磁性颗粒上，赋予其生物大分子
的识别特性和磁性颗粒的磁性。所构建这种的体系可以用来快速地检测和分离靶标物质，
广泛地用于生物化学分析。
关键词：磁性颗粒，人 IgG的固定，检测，病原菌
Astudytodetectpathogenswiththreeimmuno-magneticbeads
Abstract:WesuccessfullysynthesizedthreedifferentkindsofMBwiththefunctionalgroup
sofaminogroups,aldehydegroupsandepoxy-IDA-
Cugroups,
tionalgroups，
:Thebesteff
,aldehyde-
dextrancanbeselectedtocoataldehydeIMBtoavoidthenone-
,itcouldbeinferredthatbyconnectingdifferentbi
o-functionalmoleculestotheMB,wecanenduethecompoundsbothabilitiesofbio-
functionalmoleculesandMB,
hisestablishedsystemcouldbewidelyusedinbio-
analyticalchemistrytodetectthetargetsandseparatethetargetsinonesteprapidly.
Keywords:magneticbead,HunanIgGimmobilization,detection,pathogen
微生物检测技术就是从样品中分离和鉴定目的微生物。通常我们使用选择性培养基来
获得单个的纯化的微生物。如果对于受到损伤的和热应激的微生物还需经过增菌培养，增
菌过程包括前增菌、选择性增菌和后增菌。因此，实际上检测时间主要是等待增菌的时
间，这样就远远不能适应快速检测的需要。为了缩短检测的时间，有些学者就考虑用一种
非增菌的方法来替代常规选择性增菌步骤[1]。这里将介绍一种利用磁性分离技术直接从样
品中检测、分离微生物的方法。
磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体,利用结合于磁性微粒表面的蛋白
质所提供的特异的亲和特性,在加磁场的定向控制下,通过亲和吸附、清洗、解吸操作,可以
一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子,具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及
高敏感性等众多优点[2]。
磁性微粒(Magnetbead，MB)结构通常由具磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分
组成。由于磁核对外磁场的响应,MB可在磁场中定向移动。利用这一性质可以对MB进行定位,
或将MB从周围介质(多为液体)中迅速分离出来;亦可变换移动磁场,借MB对研究对象施力。
高分子外壳的表面多样性决定了MB可与各种生物活性物质(如抗体、抗原、受体、酶、核酸
等)偶联,这些生物活性物质被固定于MB上后则可在反应介质中进一步识别相应的抗原或抗
体、配体、底物、核酸,从而达到分离或检测目的。通常将用于免疫磁性分离的、表面包被
有各种抗体(或抗原)的MB称为免疫磁性珠(Immuno-magneticbeads,IMB)[3]。在本实验室，
我们成功地合成了三种免疫磁性珠，用于检测和分离金黄色葡萄球菌
（）和G群链球菌（GroupGStreptococcus）。
金黄色葡萄球菌（）和G群链球菌（GroupGStreptococcus）是
医源性感染及群发性感染的病原菌[4][5]。金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)是致病性金黄色葡萄
球菌细胞表面一种特有的蛋白质,它具有与人IgG的Fc片段特异性结合的能力,每个SPA分子
可以同时结合2个人IgG分子[6],因此,可用来建立一种致病性金黄色葡萄球菌快速分离检验
的体系。相似地，G群链球菌（GroupGStreptococcus）的细胞壁上存在一种G蛋白，这种G
蛋白能够与人IgG的四个区域结合，也能够与鼠的单克隆IgG结合[7]。与金黄色葡萄球菌的A
蛋白相比[6]，它有着与IgG结合的更广阔的区域[7]，且有着更高的亲和性[8]。
在本实验中，我们将人IgG结合到三种磁性颗粒上，做成免疫磁性颗粒，作为生物传感
器来检测和分离病原菌。对比实验表明，醛基磁性载体的捕获和分离效果最佳，且用右旋
糖苷—乙醛包被醛基免疫磁性载体可以消除交叉反应。
1材料与方法：
材料、试剂与仪器
菌种：G群链球菌(GroupGStreptococcus)，金黄色葡萄球菌
（）,大肠杆菌()从中南大学医学院微生物实验
室获得。
试剂：人IgG，牛血清清蛋白（BSA）购自TBDCompanyofBio；磁流体由本实验室合成
[9]；
右旋糖苷—乙醛由本实验室按报导的方法制备[10][11]；N-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅
(AEAPS)，溶葡萄球菌酶购自Sigma公司；DVB购自MERK；丙烯醛（Ac），苯乙烯(St),过氧化
苯甲酰（BPO）购于LtdCompanyofbiochemistry；其他化学试剂购于
。
仪器：LeicaDM6000型扫描电子显微镜(Wetzlar,Germany)，FTIR，NEXUS670型红外光
谱仪(上海分析仪器总厂)，5-2型恒温磁力搅拌器(江苏)。
细菌培养条件：
250mL的三角瓶分别装100mL培养基，接种适量金黄色葡萄球菌、G群链球菌、大肠杆菌
菌种，于摇床150rpm，37℃恒温培养。
.方法：方法：方法：
种载体的制备（每种载体表面的功能基团用红外光谱仪进行确认[18]）：
氨基载体制备
采用何晓晓等人[10]的方法，并加以改进。按照环己烷:TrionX-100:正己醇
=4∶∶1的比例配成混合液，超声波振荡均匀，形成浑浊乳状液,磁力搅拌下,加入一定
量的
再加入一定量的AEAPS，反应时间为20h，反应完毕后加入丙酮破乳分离颗粒，加入无水乙
醇洗涤颗粒，重复洗涤5次，烘箱干燥[13]。载体中游离氨基含量的测定采用电位滴定法。
醛基载体的制备
磁性颗粒(Fe3O4)与聚乙二醇混合，加ddH2O6mL，超声波振荡均匀。室温条件
下，将混合物转移到250mL的三角瓶，继续振荡。将115mL分散的培养基酒精/ddH2O(3:2，
v/v)添加到三角瓶中。然后，按次序添加8mL丙烯醛(Ac)，15mL苯乙烯(St)，，
过氧化苯甲酰(BPO)，反应30分钟.接着，升温到65℃，反应10小时，可获得淡褐色的液
体。将获得的磁性颗粒用
环氧IDA-Cu载体的制备
磁性琼脂微球的合成
磁性琼脂微球采用反相悬浮技术和包埋技术制备。磁性颗粒(Fe3O4)与6％的琼脂
溶液混合，转移到有机相中（50℃条件下，将1mLSpan-80加入到72mL甲苯和28mL氯仿的混
合物中制得）。此反应在室温下进行，且制得的微球再用乙醚洗3次。
IDA-Cu修饰微球
磁性琼脂微球用 epichorohydrin(环氧氯丙烷),IDA及过量 CuCl2依次进行修饰。4℃条
件下，将得到的环氧 IDA-Cu载体保存在 pH7，1M/L的 NaCl溶液中[17]。
人 IgG固定到三种载体
将 1mL10mg/mL的人 IgG加入到
育 。在磁场中，用含 ％牛血清清蛋白（BSA）,, PBS缓冲液洗三
次，再用相同的 PBS缓冲液，4℃条件下，进行重悬[16]。
乙醛—右旋糖苷包被醛基磁珠
10mL活化的醛基免疫磁珠重悬在 80mL的 ，100mM/L的磷酸缓冲液中，加入
乙醛—右旋糖苷,轻轻搅动，室温条件下，将此悬浮液培养 12小时。添加固态的硼氢化
钠，直到 pH10时，浓度为 10mg/mL。然后，适度地搅动，再持续原来的反应 2小时。接
着，用
用过量的蒸馏水洗涤以除去被磁性颗粒吸收的右旋糖苷。（三种磁性颗粒的图像见 Fig1）。
Fig1图为三种磁性颗粒的显微照片。均用 LeicaDM6000型扫描电子显微镜(Wetzlar,Germany)进行拍摄。
所有的磁性颗粒都是近似的球形体，醛基磁性颗粒的直径为 10~20μm(Fig1A)，环氧 IDA-Cu磁性颗粒的直
径为 5~15μm(Fig1B),而氨基磁性颗粒的直径为 15~30μm(Fig1C).
333 结果结果结果
不同的磁性颗粒装载人 IgG的能力
将不同量的人 IgG与
混合液分别加入到 2mL体积的不同磁性颗粒中，分别温育过夜。用 Bradford方法对人 IgG
的需要量进行测定[12-15]，没有结合上的 IgG用蒸馏水冲洗掉。FTIR结果显示：每种磁性颗
粒的表面后含有相应的功能基团。
功能基团决定每种磁性颗粒的装载 IgG的能力，它们的数量分别用电位滴定法进行测
定。醛基磁性颗粒有着最佳的装载性能，根据电位滴定的结果，它的装载性能是环氧 IDA-
Cu磁性颗粒的 3倍多。每种磁性颗粒每克能固定至少 30mg的人 IgG。但为了保证右旋糖苷
—乙醛的适度封闭及完好的固定效果，每克醛基磁性颗粒只加入了 10mg的人 IgG。（不同的
磁性颗粒装载人 IgG的能力见 Fig2）
Fig2不同的磁性颗粒装载人 IgG的能力。人 IgG的固定方法如上文所述，人 IgG的需要量用 Bradford方
法进行测定。（epoxy-IDA-Cumagneticbeads：环氧 IDA-Cu磁性颗粒；Aldehydemagneticbeads：醛基磁性
颗粒；Aminomagneticbeads：氨基磁性颗粒）
免疫磁性分离
捕获金黄色葡萄球菌（）和 G群链球菌(GroupGStreptococcus)
37℃，磷酸缓冲液中，用 1%牛血清清蛋白（BSA）100mM温育 1h，3种磁性颗粒
（10mg/mL）和三种免疫磁性颗粒（10mg/mL）各取 ，分别与 -6金黄色葡萄球
菌（）和 -6大肠杆菌（）的培养物混合，再于室温条件下，分别孵
育 10min，20min，1h，2h。接着，分别取混合物的悬浮液涂平板，37℃，孵育过夜后记录
菌落形成单位（CFU）。
表 1.不同的磁性颗粒对金黄色葡萄球菌（）的免疫磁性分离效果。
温育
时间,环氧 IDA-Cu磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,氨基磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,醛基磁
性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液
,
（CFU）,
(CFU),
（CFU）,）(CFU),
(CFU),
(CFU)
10min,108±,±,±,±,113±,±
30min,106±,±,±,±,±,94±
1h,±,94±,106±,±,±,95±
2h,±,±,±,±,±,±
表 2不同的免疫磁性颗粒对金黄色葡萄球菌（）的免疫磁性分离效果
温育
时间,环氧 IDA-Cu免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,氨基免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,
醛基免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液
,
(CFU),
(CFU),
(CFU),
(CFU),
(CFU),
(CFU)
10min,106±,±,±,±,±,±
30min,±,±,±,±,±,±
1h,±,±,±,±,±,0±
2h,±,±,±,±,121±,±
由于所有的磁性颗粒和免疫磁性颗粒在病源捕获实验之前都用 1%牛血清清蛋白（BSA）
进行了封闭，磁性颗粒不能从金黄色葡萄球菌（）与大肠杆菌（）的混合
物及 G群链球菌(GroupGStreptococcus)和大肠杆菌（）的混合物中捕获相应的金黄
色葡萄球菌（）和 G群链球菌(GroupGStreptococcus)，而所有的免疫磁性颗粒却
能从细菌混合物中有效地分离相应的病原菌。其中，醛基免疫磁性颗粒的捕获效果最佳。
这表明：通过氨基、醛基、环氧 IDA-Cu基团有效地固定到磁性颗粒上的人 IgG，能够有效
地识别和捕获位于捕获金黄色葡萄球菌（）和 G群链球菌(GroupGStreptococcus)
细胞壁上的蛋白 A和蛋白 G。
表 3.不同的磁性颗粒对 G群链球菌(GroupGStreptococcus)的免疫磁性分离效果。
温育
时间,环氧 IDA-Cu磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,氨基磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,醛基磁
性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液
,
(CFU),GGS
(CFU),
(CFU),GGS
(CFU),
(CFU),GGS
(CFU)
10min,±,±,±,±,±,96±
30min,±,98±,±,±,±,±
1h,116±,±,104±,±,±,±
2h,±,±,±,94±,121±,±
表 4.不同的免疫磁性颗粒对 G群链球菌(GroupGStreptococcus)的免疫磁性分离效果。
温育
时间,环氧 IDA-Cu免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,氨基免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液,
醛基免疫磁性颗粒温育细菌混合物后的悬浮液
,
(CFU),GGS
(CFU),
(CFU),GGS
(CFU),
(CFU),GGS
(CFU)
10min,±,±,±,±,±,37±
30min,±,±,±,0±,±,±
1h,116±,±,104±,±,±,0±
2h,±,0±,±,0±,121±,0±
免疫磁性捕获和接下来的免疫磁性分离过程，能够在一小时之内，经一步完成。与传
统的识别方法相比，这是十分快捷的。
4讨论：
我们将人 IgG固定于三种磁性载体即氨基、醛基、环氧 IDA-Cu磁性载体表面，成功地
制得三种免疫磁性载体，用于致病菌金黄色葡萄球菌（）和 G群链球菌
(GroupGStreptococcus)的快速检测与分离。其中，醛基免疫磁性载体的捕获和分离效果最
佳，且用乙醛—右旋糖苷进行包被可以消除交叉反应。据此，我们可以推想：将具有生物
大分子的识别特性的不同的生物功能基团连接到磁性颗粒上，可以构建不同的体系，用于
生物化学分析的快速检测和分离靶标物质。同时，将不同的生物功能基团连接到磁性载体
上，其检测和分离效果是不相同的。因此，在构建体系的过程中，选取合适的功能基团是
十分重要的。另外，包被剂的选择对其识别特异性有着很大的影响，也是值得重视的。
参考文献：
[1]文其乙，磁性分离技术及在微生物检测上的应用.肉品卫生.1998,5:30～32
[2]李贵平,张辉,汪勇先,磁性纳米微粒在磁性分离技术中的应用进展.放射免疫学杂志
2005,18(5):380～383
[3]李勇，何俊，张杰，磁性微球在生物医学领域中的应用进展.生物医学工程学杂志
2001,18(2):169～172
[4]Cohen-PoradosuR,JaffeJ,LaviD,Grisariu-GreenzaidS,Nir-
PazR,ValinskyL(2004)
10:1455-1460
[5]DiekemaDJ,PfallerMA,SchmitzFJ,SmayevskyJ,BellJ,JonesRN,BechMandtheSENTRYpart
icipantsgroup(2001)SurveyofinfectionsduetoStaphylococcusspecies:frequencyof
occurrenceandantimicrobialsusceptibilityofisolatescollectedintheUnitedState
s,Canada,LatinAmerica,Europe,andtheWesternPacificregionfortheSENTRYAntimicr
obialSurveillanceProgram,:114-132.
[6]LangoneJJ(1982)ProteinAofStaphylococcusaureusandrelatedimmunoglobulinrecepto
:157-252.
[7]BjorckL,andKronvallG(1984)Purificationandsomepropertiesofstreptococcalprotei
nG,:969-974.
[8]ArerstromB,BjorckL(1986)
(22):10240-10247
[9]LeiH,WangW,ChenLL,LiXC,YiB,andDengL(2004)Thepreparationandcatalyticallyactiv
crobialTechnol35:15-21.
[10]FuentesM,MaquieseJV,PesselaCCCB,AbianO,Fernández-
LafuenteR,GuisánJM.(2004)Designofanewcationicexchangersupportforreversiblei
:284–288.
[11]RobertoFL,ManuelFetal(2004)Useofdextransasspacerarmsfororientedcovalentimmo
WO02/072887.
[12]OkuboM,KondoY,TakahashiM(1993)Productionofsubmicron-
sizemonodispersepolymerparticleshavingaldehydegroupsbyseededaldolcondensati
:109-113
[13]ChengFL,DengLetal(2004)ImmobilizationandStabilizationofPapainonSiO2Particles
:287-290
[14]ChenLL,DengL,LiuLL,PengZH(2006)ImmunomagneticseparationandMS/SPRend-
detectioncombinedprocedureforrapiddetectionofStaphylococcusaureusandprotein
:
[15]HeXX,WangKM,TanWHetal(2002)Anovelgenecarrierbasedonamino-
:1365-1369
[16]JohneB,JarpJ,andHaaheimLR(1989)Staphylococcusaureusexopolysaccharideinvivod
7:1631–1635
[17]CHANGYang-chuang,CHENDong-
-
boundFe3O4magneticnanoparticlesforremovalofCu(II)
erfaceScience,2005,283:446～451
[18]王德平,娄敏毅,等.偶联剂修饰纳米磁性粒子红外光谱及相关分析.同济大学学报(自然
科学版),2005,33(2):202–204
四倍体鲫鲂四倍体鲫鲂四倍体鲫鲂 SoxSoxSox 基因基因基因 900bp900bp900bp 左右片段的克隆左右片段的克隆左右片段的克隆
湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院
学生姓名、学号、专业、班级：学生姓名、学号、专业、班级：学生姓名、学号、专业、班级：
谭嵘谭嵘谭嵘 N42030225N42030225N42030225 生物科学生物科学生物科学 222 班班班
鲍畅鲍畅鲍畅 N42030230N42030230N42030230 生物科学生物科学生物科学 222 班班班
何伟国何伟国何伟国 N42030203N42030203N42030203 生物科学生物科学生物科学 222 班班班
程良英程良英程良英 N42030213N42030213N42030213 生物科学生物科学生物科学 222 班班班
尹娟尹娟尹娟 N42030220N42030220N42030220 基地班基地班基地班
姚磊姚磊姚磊 N42030204N42030204N42030204 基地班基地班基地班
孟捷孟捷孟捷 N42030214N42030214N42030214 基地班基地班基地班
李伟发育生物学研究室硕士研究生李伟发育生物学研究室硕士研究生李伟发育生物学研究室硕士研究生
指导老师：指导老师：指导老师：刘少军教授刘少军教授刘少军教授
实验主要设备：实验主要设备：实验主要设备：
超速离心机、水浴锅、超速离心机、水浴锅、超速离心机、水浴锅、PCRPCRPCR 仪、琼脂糖凝胶电泳仪、仪、琼脂糖凝胶电泳仪、仪、琼脂糖凝胶电泳仪、UVUVUV 扫描仪、恒温水浴箱、超净扫描仪、恒温水浴箱、超净扫描仪、恒温水浴箱、超净
工作台、工作台、工作台、37℃37℃37℃培养箱、摇床等。培养箱、摇床等。培养箱、摇床等。
实验主要材料：实验主要材料：实验主要材料：
四倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、四倍体鲫鲂、UNIQ-10UNIQ-10UNIQ-10 柱式柱式柱式 DNADNADNA 抽提试剂盒、常用抽提试剂盒、常用抽提试剂盒、常用 PCRPCRPCR 试剂、试剂、试剂、UNIQ-10UNIQ-10UNIQ-10 柱式柱式柱式 DNADNADNA 回回回
收试剂盒、收试剂盒、收试剂盒、AmpAmpAmp 青霉素、青霉素、青霉素、LBLBLB 培养基、培养基、培养基、Pmd18Pmd18Pmd18－－－TvectorTvectorTvector、、、DH5αDH5αDH5α 感受态细胞、感受态细胞、感受态细胞、M13-20M13-20M13-20 和和和
Rv-pRv-pRv-p 载体引物。载体引物。载体引物。
实验目的：实验目的：实验目的：
111 运用运用运用 PCRPCRPCR 技术和基因克隆技术获得四倍体鲫鲂技术和基因克隆技术获得四倍体鲫鲂技术和基因克隆技术获得四倍体鲫鲂 SoxSoxSox 基因基因基因 900bp900bp900bp 左右片段的核苷酸序左右片段的核苷酸序左右片段的核苷酸序
列，并做进一步分析。列，并做进一步分析。列，并做进一步分析。
222 在具体的实验操作过程中，加强本科生与研究生之间的交流，为本科生深入学习在具体的实验操作过程中，加强本科生与研究生之间的交流，为本科生深入学习在具体的实验操作过程中，加强本科生与研究生之间的交流，为本科生深入学习
分子生物学技术提供更广阔的平台。分子生物学技术提供更广阔的平台。分子生物学技术提供更广阔的平台。
实验原理：实验原理：实验原理：
SoxSoxSox（（（Sry-boxSry-boxSry-box）基因家族是一类以）基因家族是一类以）基因家族是一类以 SRYSRYSRY 基因为代表的、一个控制发育的基因家族，基因为代表的、一个控制发育的基因家族，基因为代表的、一个控制发育的基因家族，
这个基因家族成员的主要特征是具有一个这个基因家族成员的主要特征是具有一个这个基因家族成员的主要特征是具有一个 HMG(highmobilitygroup)HMG(highmobilitygroup)HMG(highmobilitygroup)保守盒保守盒保守盒,,,其编码的蛋其编码的蛋其编码的蛋
白质可以和白质可以和白质可以和 DNADNADNA 序列特异性结合序列特异性结合序列特异性结合,,,是一类重要的转录调控因子，对性别分化和组织器官是一类重要的转录调控因子，对性别分化和组织器官是一类重要的转录调控因子，对性别分化和组织器官
形成起着重要作用。用特异于形成起着重要作用。用特异于形成起着重要作用。用特异于 HMGHMGHMG 保守区的简并引物扩增四倍体鲫鲂保守区的简并引物扩增四倍体鲫鲂保守区的简并引物扩增四倍体鲫鲂 DNADNADNA 中的中的中的 SoxSoxSox 基基基
因，回收目的片段，将其连接到克隆载体上，进行测序，而获得目的片段的核苷酸序因，回收目的片段，将其连接到克隆载体上，进行测序，而获得目的片段的核苷酸序因，回收目的片段，将其连接到克隆载体上，进行测序，而获得目的片段的核苷酸序
列。列。列。
实验过程：实验过程：实验过程：
111 抽取四倍体鲫鲂血样，使用抽取四倍体鲫鲂血样，使用抽取四倍体鲫鲂血样，使用 UNIQ-10UNIQ-10UNIQ-10 柱式柱式柱式 DNADNADNA 抽提试剂盒提取核抽提试剂盒提取核抽提试剂盒提取核 DNADNADNA 并检测浓并检测浓并检测浓
度。度。度。
222 使用使用使用 SoxSoxSox 简并引物，通过简并引物，通过简并引物，通过 PCRPCRPCR 技术扩增四倍体鲫鲂核技术扩增四倍体鲫鲂核技术扩增四倍体鲫鲂核 DNADNADNA 的的的 SoxSoxSox 基因片段。扩增反应基因片段。扩增反应基因片段。扩增反应
采用采用采用 20μL20μL20μL 体系，其中模板基因组体系，其中模板基因组体系，其中模板基因组 DNA80ngDNA80ngDNA80ng，，，dNTP200μmol/LdNTP200μmol/LdNTP200μmol/L，两个引物各，两个引物各，两个引物各
μmol/μmol/μmol/L，，，TaqDNATaqDNATaqDNA 聚合酶聚合酶聚合酶 ，反应在，反应在，反应在 TechgenePCRTechgenePCRTechgenePCR 热循环仪上进行。反应程序为热循环仪上进行。反应程序为热循环仪上进行。反应程序为
94℃94℃94℃预变性预变性预变性 5min5min5min；；；94℃94℃94℃变性变性变性 30s30s30s，，，50℃50℃50℃退火退火退火 45s45s45s，，，72℃72℃72℃延伸延伸延伸 1min20s1min20s1min20s，共，共，共 353535 个循环；个循环；个循环；
72℃72℃72℃终延伸终延伸终延伸 10min10min10min；；；4℃4℃4℃保存。最后将保存。最后将保存。最后将 PCRPCRPCR 产物在产物在产物在 %%%的琼脂糖凝胶中电泳分离，得到的琼脂糖凝胶中电泳分离，得到的琼脂糖凝胶中电泳分离，得到
不同大小的不同大小的不同大小的 SoxSoxSox 基因条带。基因条带。基因条带。
333 使用使用使用 UNIQ-10UNIQ-10UNIQ-10 柱式胶回收试剂盒回收目的片段（柱式胶回收试剂盒回收目的片段（柱式胶回收试剂盒回收目的片段（900bp900bp900bp 左右）左右）左右）。。。
444 将将将 900bp900bp900bp 片段连接到片段连接到片段连接到 PMD18-TvectorPMD18-TvectorPMD18-Tvector 上。反应体系为：上。反应体系为：上。反应体系为：5μLLigationSolution5μLLigationSolution5μLLigationSolution；；；
3μL3μL3μL 目的片段；目的片段；目的片段；1μL1μL1μL 水；水；水；1μLPMD18-Tvector1μLPMD18-Tvector1μLPMD18-Tvector。用封口膜封紧，。用封口膜封紧，。用封口膜封紧，16℃16℃16℃水浴水浴水浴 8h8h8h 以上。以上。以上。
555 将连接好的质粒转化到将连接好的质粒转化到将连接好的质粒转化到 DH5αDH5αDH5α 大肠杆菌感受态细胞中。具体步骤为：大肠杆菌感受态细胞中。具体步骤为：大肠杆菌感受态细胞中。具体步骤为：
①①① 取装有取装有取装有 200μLDH5α200μLDH5α200μLDH5α 大肠杆菌感受态细胞的大肠杆菌感受态细胞的大肠杆菌感受态细胞的 EPEPEP 管置于冰上。管置于冰上。管置于冰上。
②②② 加入连接好的质粒加入连接好的质粒加入连接好的质粒 10μL10μL10μL，将，将，将 EPEPEP 管在冰上放置管在冰上放置管在冰上放置 252525～～～30min30min30min。。。
③③③ 然后在然后在然后在 42℃42℃42℃水浴水浴水浴 858585～～～90s90s90s 进行热激活。进行热激活。进行热激活。
④④④ 再放冰上再放冰上再放冰上 555 分钟后无菌条件下加入分钟后无菌条件下加入分钟后无菌条件下加入 800μLLB800μLLB800μLLB 液体培养基。液体培养基。液体培养基。
⑤⑤⑤ 放到摇床里放到摇床里放到摇床里 37℃37℃37℃培育培育培育 454545～～～60min60min60min。。。
⑥⑥⑥ 6000rpm6000rpm6000rpm 离心离心离心 111～～～2min2min2min，倒掉上清，留，倒掉上清，留，倒掉上清，留 200μL200μL200μL 左右轻轻吸打剩余溶液左右轻轻吸打剩余溶液左右轻轻吸打剩余溶液
使细胞悬浮。使细胞悬浮。使细胞悬浮。
⑦⑦⑦ 取出约取出约取出约 75μL75μL75μL 的菌液涂到加有的菌液涂到加有的菌液涂到加有 AMP30μLAMP30μLAMP30μL、、、IPTG20μLIPTG20μLIPTG20μL、、、X-gal50μLX-gal50μLX-gal50μL 的的的
LBLBLB 固体培养基平板上。固体培养基平板上。固体培养基平板上。
⑧⑧⑧ 平板在平板在平板在 37℃37℃37℃下正向放置下正向放置下正向放置 1h1h1h 以吸收足够的液体，然后倒置培养一个晚以吸收足够的液体，然后倒置培养一个晚以吸收足够的液体，然后倒置培养一个晚
上（上（上（121212～～～16h16h16h）））。。。
666 挑菌：挑菌：挑菌：AMPAMPAMP 培养基上长出了菌落，挑取几个较大的周围没有杂菌的白色单克隆菌培养基上长出了菌落，挑取几个较大的周围没有杂菌的白色单克隆菌培养基上长出了菌落，挑取几个较大的周围没有杂菌的白色单克隆菌
落，落，落，，分别放入装有，分别放入装有，分别放入装有 800μL800μL800μL 的的的 LBLBLB 液体培养基培养液的小试管中，每管中加入了液体培养基培养液的小试管中，每管中加入了液体培养基培养液的小试管中，每管中加入了 μμμL
的的的 AMPAMPAMP 溶液，将小管放到摇床上，溶液，将小管放到摇床上，溶液，将小管放到摇床上，37℃37℃37℃过夜培养（不少于过夜培养（不少于过夜培养（不少于 8h8h8h）））。。。
777 菌液菌液菌液 PCRPCRPCR：以菌液为模板，使用载体引物，进行：以菌液为模板，使用载体引物，进行：以菌液为模板，使用载体引物，进行 PCRPCRPCR 反应，若能得到目的片段反应，若能得到目的片段反应，若能得到目的片段
（（（900bp900bp900bp 左右）左右）左右），则证明目的片段成功连接到载体上。，则证明目的片段成功连接到载体上。，则证明目的片段成功连接到载体上。
888 将菌液一部分与将菌液一部分与将菌液一部分与 30%30%30%的甘油按的甘油按的甘油按 111：：：111 保种于保种于保种于———80℃80℃80℃：一部分拿去测序。：一部分拿去测序。：一部分拿去测序。
实验结果与分析：实验结果与分析：实验结果与分析：
图图图 111 图图图 222 图图图 333 图图图 444
注：图注：图注：图 1DNA1DNA1DNA 提取结果图提取结果图提取结果图 222 四倍体鲫鲂及其亲本团头鲂和红鲫的四倍体鲫鲂及其亲本团头鲂和红鲫的四倍体鲫鲂及其亲本团头鲂和红鲫的 SoxSoxSox 基因扩增条带基因扩增条带基因扩增条带
图图图 333 四倍体鲫鲂四条四倍体鲫鲂四条四倍体鲫鲂四条 SoxSoxSox 条带回收结果图条带回收结果图条带回收结果图 4900bp4900bp4900bp 条带的菌液条带的菌液条带的菌液 PCRPCRPCR 结果结果结果
测序结果：测序结果：测序结果：918bp918bp918bp
TGAAGCGACCCATGAACGCGTTTATGGTTTGGGCTCAAGCGGCGCGCAGGAAACTGGCGGACCAGTATCCACACCTTGAAGCGACCCATGAACGCGTTTATGGTTTGGGCTCAAGCGGCGCGCAGGAAACTGGCGGACCAGTATCCACACCTTGAAGCGACCCATGAACGCGTTTATGGTTTGGGCTCAAGCGGCGCGCAGGAAACTGGCGGACCAGTATCCACACCT
GCACAACGCCGAGCTCAGCAAGACCCTCGGCAAACTCTGGAGGTGCACAACGCCGAGCTCAGCAAGACCCTCGGCAAACTCTGGAGGTGCACAACGCCGAGCTCAGCAAGACCCTCGGCAAACTCTGGAGGTCAGAGCATTCATTGTTTATGAAGTGTAGGACACAGAGCATTCATTGTTTATGAAGTGTAGGACACAGAGCATTCATTGTTTATGAAGTGTAGGACA
ACTCCAGAAGCCGTAGCGACACTGATTCATTTAACTGCCCAGACAAACTCACTGTATTATTAATATTAAACTGCATACTCCAGAAGCCGTAGCGACACTGATTCATTTAACTGCCCAGACAAACTCACTGTATTATTAATATTAAACTGCATACTCCAGAAGCCGTAGCGACACTGATTCATTTAACTGCCCAGACAAACTCACTGTATTATTAATATTAAACTGCAT
TGTTTCATAGCATTATTATATAATGTCAGGCAATACTGATAAGCTGTTTGGGAAATAAAGGGTAAAACTATAGCTTTGTTTCATAGCATTATTATATAATGTCAGGCAATACTGATAAGCTGTTTGGGAAATAAAGGGTAAAACTATAGCTTTGTTTCATAGCATTATTATATAATGTCAGGCAATACTGATAAGCTGTTTGGGAAATAAAGGGTAAAACTATAGCTT
AGGCAAATGGTGAATTAACCCTTACTTCAGTGCAGAAAAAGTTGTGTAGTCACTAAAAACTTTGGTAACACTTTGGAGGCAAATGGTGAATTAACCCTTACTTCAGTGCAGAAAAAGTTGTGTAGTCACTAAAAACTTTGGTAACACTTTGGAGGCAAATGGTGAATTAACCCTTACTTCAGTGCAGAAAAAGTTGTGTAGTCACTAAAAACTTTGGTAACACTTTGG
AAAAGGGAACACTTACTCACTATTAACTATGACTTTTCCCTCTATAAATTCCTAATTTGCTGCTTATTAAAAGTTAAAAAGGGAACACTTACTCACTATTAACTATGACTTTTCCCTCTATAAATTCCTAATTTGCTGCTTATTAAAAGTTAAAAAGGGAACACTTACTCACTATTAACTATGACTTTTCCCTCTATAAATTCCTAATTTGCTGCTTATTAAAAGTTA
GTATGGTAGCTTTTAAGTTTAGGTATGAGGTAGGATTAGGGATGTAGAATAAGGTCATGTAAAATAAGACATTAATGTATGGTAGCTTTTAAGTTTAGGTATGAGGTAGGATTAGGGATGTAGAATAAGGTCATGTAAAATAAGACATTAATGTATGGTAGCTTTTAAGTTTAGGTATGAGGTAGGATTAGGGATGTAGAATAAGGTCATGTAAAATAAGACATTAAT
ATGTGCTTAATTACTACTAATAAATGGCTAATATTCTAGTAATATGCATGCTAATAAGAAACTAGTTAAGAGACCCATGTGCTTAATTACTACTAATAAATGGCTAATATTCTAGTAATATGCATGCTAATAAGAAACTAGTTAAGAGACCCATGTGCTTAATTACTACTAATAAATGGCTAATATTCTAGTAATATGCATGCTAATAAGAAACTAGTTAAGAGACCC
TAAAATAAAGTGTTACCCAAACTGTTAGTTTTAAGAAATTTAGTTAGATCTGGATTACGTTATTCTTTTTTTTCCTTAAAATAAAGTGTTACCCAAACTGTTAGTTTTAAGAAATTTAGTTAGATCTGGATTACGTTATTCTTTTTTTTCCTTAAAATAAAGTGTTACCCAAACTGTTAGTTTTAAGAAATTTAGTTAGATCTGGATTACGTTATTCTTTTTTTTCCT
GAATAATATTTTTTCTTAAGTGAACCCAAAAAGTAATCATAGTTGTTTCCAAGAACAATTTATACCTTTTTTGTAGGAATAATATTTTTTCTTAAGTGAACCCAAAAAGTAATCATAGTTGTTTCCAAGAACAATTTATACCTTTTTTGTAGGAATAATATTTTTTCTTAAGTGAACCCAAAAAGTAATCATAGTTGTTTCCAAGAACAATTTATACCTTTTTTGTAG
GTTTCTTTATTGTTAACTAAGGTAGATCTTAGTATTGATTATTTCTCATGTGCTTTTGTAGGTGTTTCTTTATTGTTAACTAAGGTAGATCTTAGTATTGATTATTTCTCATGTGCTTTTGTAGGTGTTTCTTTATTGTTAACTAAGGTAGATCTTAGTATTGATTATTTCTCATGTGCTTTTGTAGGTTACTGAATGAGGGTACTGAATGAGGGTACTGAATGAGGG
CGAGAAGCGTCCATTTGTGGAGGAGGCCGAGCGTCTGAGGGTCCAGCACAAGAAAGACCACCCCGACTACAAGTACCGAGAAGCGTCCATTTGTGGAGGAGGCCGAGCGTCTGAGGGTCCAGCACAAGAAAGACCACCCCGACTACAAGTACCGAGAAGCGTCCATTTGTGGAGGAGGCCGAGCGTCTGAGGGTCCAGCACAAGAAAGACCACCCCGACTACAAGTAC
CGACCTCGACCTCGACCT
分析：分析：分析：此此此SoxSoxSox基因片段长基因片段长基因片段长918bp918bp918bp，两端阴影标记的，两端阴影标记的，两端阴影标记的215bp215bp215bp为为为HMGHMGHMG区，中间的是一个内含子，区，中间的是一个内含子，区，中间的是一个内含子，
在在在GenebankGenebankGenebank库中搜索发现，此基因为库中搜索发现，此基因为库中搜索发现，此基因为Sox9Sox9Sox9的同源基因。的同源基因。的同源基因。Sox9Sox9Sox9基因是在基因是在基因是在SoxSoxSox基因家族中极基因家族中极基因家族中极
为重要的一个基因。它在人、鼠的睾丸中表达为重要的一个基因。它在人、鼠的睾丸中表达为重要的一个基因。它在人、鼠的睾丸中表达,,,还与人类许多疾病有关，还与人类许多疾病有关，还与人类许多疾病有关，Sox9Sox9Sox9基因突变基因突变基因突变
可引起可引起可引起CD(campomelicdysplasia)CD(campomelicdysplasia)CD(campomelicdysplasia)患者骨骼发育异常患者骨骼发育异常患者骨骼发育异常,,,同时伴有性反转。深入研究同时伴有性反转。深入研究同时伴有性反转。深入研究SOX9SOX9SOX9基基基
因对于揭示低等脊椎动物如鱼类、爬行类的性别决定机制具有重要的参考价值因对于揭示低等脊椎动物如鱼类、爬行类的性别决定机制具有重要的参考价值因对于揭示低等脊椎动物如鱼类、爬行类的性别决定机制具有重要的参考价值
一株降解烟碱细菌的分子鉴定一株降解烟碱细菌的分子鉴定一株降解烟碱细菌的分子鉴定
湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院湖南师范大学生命科学学院
学生姓名：学生姓名：学生姓名：孙丽娜孙丽娜孙丽娜学号：学号：学号：N42030148N42030148N42030148专业：专业：专业：生命科学技术培养基地生命科学技术培养基地生命科学技术培养基地班级班级班级：基地班：基地班：基地班
指导老师：指导老师：指导老师：莫湘涛莫湘涛莫湘涛
实验主要设备、材料：实验主要设备、材料：实验主要设备、材料：
设备、仪器：设备、仪器：设备、仪器：
高压蒸汽灭菌机，超净工作台，恒温培养箱，光学显微镜，摇床，冷冻离心高压蒸汽灭菌机，超净工作台，恒温培养箱，光学显微镜，摇床，冷冻离心高压蒸汽灭菌机，超净工作台，恒温培养箱，光学显微镜，摇床，冷冻离心
机，电烤炉，电子天平，水浴锅，电泳仪机，电烤炉，电子天平，水浴锅，电泳仪机，电烤炉，电子天平，水浴锅，电泳仪,,,紫外分光光度计，紫外分光光度计，紫外分光光度计，PCRPCRPCR仪仪仪,,,紫外呈紫外呈紫外呈
像仪像仪像仪,,,计算机，试管，三角烧瓶，培养皿，计算机，试管，三角烧瓶，培养皿，计算机，试管，三角烧瓶，培养皿，EPEPEP管，管，管，PCRPCRPCR管，微量移液枪，枪头管，微量移液枪，枪头管，微量移液枪，枪头
材料：材料：材料：
细菌：待鉴定菌：在烟草调制过程中的细菌：待鉴定菌：在烟草调制过程中的细菌：待鉴定菌：在烟草调制过程中的555555摄氏度时分离出一株细菌，我们予之摄氏度时分离出一株细菌，我们予之摄氏度时分离出一株细菌，我们予之
编号为编号为编号为B-55B-55B-55
感受态大肠杆菌感受态大肠杆菌感受态大肠杆菌
试剂：蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，试剂：蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，试剂：蛋白胨，牛肉膏，氯化钠，琼脂，10%NaOH10%NaOH10%NaOH，，，PBSPBSPBS缓冲液，无水乙醇，双缓冲液，无水乙醇，双缓冲液，无水乙醇，双
蒸水，超纯水，氨卞青霉素，普通蒸水，超纯水，氨卞青霉素，普通蒸水，超纯水，氨卞青霉素，普通TaqTaqTaq酶，高保真酶，琼脂糖，超纯水，酶，高保真酶，琼脂糖，超纯水，酶，高保真酶，琼脂糖，超纯水，
EBEBEB，，，MarkerMarkerMarker（（（2000bp2000bp2000bp、、、1000bp1000bp1000bp、、、750bp750bp750bp、、、500bp500bp500bp、、、250bp250bp250bp、、、100bp100bp100bp））），前沿指，前沿指，前沿指
示剂示剂示剂
试剂盒：试剂盒：试剂盒：DNADNADNA提取试剂盒（编号：提取试剂盒（编号：提取试剂盒（编号：BS423BS423BS423，购自上海生物工程有限公司），购自上海生物工程有限公司），购自上海生物工程有限公司），琼脂糖，琼脂糖，琼脂糖
凝胶凝胶凝胶DNADNADNA回收试剂盒（编号：回收试剂盒（编号：回收试剂盒（编号：DP209DP209DP209，购自天为时代生物有限公司），购自天为时代生物有限公司），购自天为时代生物有限公司），，，
DNADNADNA连接载体（编号：连接载体（编号：连接载体（编号：PMD18-TPMD18-TPMD18-T，购自宝生物工程有限公司），购自宝生物工程有限公司），购自宝生物工程有限公司）
实验目的：实验目的：实验目的：
众所周知，过量的烟碱能起大脑抑制和麻痹作用，如果能通过某种手段众所周知，过量的烟碱能起大脑抑制和麻痹作用，如果能通过某种手段众所周知，过量的烟碱能起大脑抑制和麻痹作用，如果能通过某种手段
使烟草中烟碱的含量下降的话，将会对人类的吸烟危害健康问题上取得突破进使烟草中烟碱的含量下降的话，将会对人类的吸烟危害健康问题上取得突破进使烟草中烟碱的含量下降的话，将会对人类的吸烟危害健康问题上取得突破进
展。而我们研究的这株细菌正是从烟草调制过程中分离的，也初步鉴定该菌具展。而我们研究的这株细菌正是从烟草调制过程中分离的，也初步鉴定该菌具展。而我们研究的这株细菌正是从烟草调制过程中分离的，也初步鉴定该菌具
有降烟碱作用。因此，对于此菌的鉴定极其具有实践意义。本实验正是运用现有降烟碱作用。因此，对于此菌的鉴定极其具有实践意义。本实验正是运用现有降烟碱作用。因此，对于此菌的鉴定极其具有实践意义。本实验正是运用现
代微生物鉴定技术，在分子水平上鉴定这株细菌。代微生物鉴定技术，在分子水平上鉴定这株细菌。代微生物鉴定技术，在分子水平上鉴定这株细菌。
实验原理：实验原理：实验原理：
传统方法是通过生理生化实验鉴定细菌，但随着分子生物学的深入发展传统方法是通过生理生化实验鉴定细菌，但随着分子生物学的深入发展传统方法是通过生理生化实验鉴定细菌，但随着分子生物学的深入发展,,,
人们已逐渐认识到仅依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定人们已逐渐认识到仅依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定人们已逐渐认识到仅依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定
存在一定的局限与不足存在一定的局限与不足存在一定的局限与不足,,,因其缺乏基因水平。本实验正是运用现代微生物鉴定因其缺乏基因水平。本实验正是运用现代微生物鉴定因其缺乏基因水平。本实验正是运用现代微生物鉴定
技术，测定该菌的技术，测定该菌的技术，测定该菌的16SrDNA16SrDNA16SrDNA序列序列序列,,,并根据并根据并根据16SrDNA16SrDNA16SrDNA构建了系统发育树，通过比对构建了系统发育树，通过比对构建了系统发育树，通过比对
待测菌与已知菌序列的同源性待测菌与已知菌序列的同源性待测菌与已知菌序列的同源性,,,从而从分子水平上进行鉴定。从而从分子水平上进行鉴定。从而从分子水平上进行鉴定。
16SrDNA16SrDNA16SrDNA是核糖体是核糖体是核糖体16S16S16S小亚基小亚基小亚基(16SrRNA)(16SrRNA)(16SrRNA)的基因的基因的基因,,,长度约为长度约为长度约为115kb,115kb,115kb,为细菌分类为细菌分类为细菌分类
学研究中最常用的学研究中最常用的学研究中最常用的“““分子钟分子钟分子钟”,”,”,其序列包含其序列包含其序列包含101010个可变区个可变区个可变区(variableregion)(variableregion)(variableregion)和与和与和与
之相间的之相间的之相间的111111个恒定区个恒定区个恒定区(constantregion),(constantregion),(constantregion),可变区因细菌而异可变区因细菌而异可变区因细菌而异,,,且变异程度与细菌且变异程度与细菌且变异程度与细菌
的系统发育密切相关，在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。的系统发育密切相关，在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。的系统发育密切相关，在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。
实验过程：实验过程：实验过程：
111、、、菌种的活化与扩大培养：从原菌保藏斜面上接菌于斜面培养基，培养菌种的活化与扩大培养：从原菌保藏斜面上接菌于斜面培养基，培养菌种的活化与扩大培养：从原菌保藏斜面上接菌于斜面培养基，培养242424
小时，划平板分离，挑单菌落于摇瓶，培养小时，划平板分离，挑单菌落于摇瓶，培养小时，划平板分离，挑单菌落于摇瓶，培养121212小时。小时。小时。
斜面培养基：即斜面培养基：即斜面培养基：即LBLBLB培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨101010克，牛肉膏克，牛肉膏克，牛肉膏555克，氯化钠克，氯化钠克，氯化钠101010克，琼克，琼克，琼
脂脂脂2%2%2%，用，用，用10%NaOH10%NaOH10%NaOH调调调PHPHPH值为值为值为~~~
平板培养基：配方与斜面培养基相同平板培养基：配方与斜面培养基相同平板培养基：配方与斜面培养基相同
摇瓶培养基：除了不加琼脂，配方与斜面培养基相同摇瓶培养基：除了不加琼脂，配方与斜面培养基相同摇瓶培养基：除了不加琼脂，配方与斜面培养基相同
222、细菌总、细菌总、细菌总DNADNADNA提取：用提取：用提取：用DNADNADNA提取试剂盒提取细菌总提取试剂盒提取细菌总提取试剂盒提取细菌总DNADNADNA，将总，将总，将总DNADNADNA进行琼脂糖进行琼脂糖进行琼脂糖
电泳检测。电泳检测。电泳检测。
333、、、PCRPCRPCR扩增扩增扩增16SrDNA16SrDNA16SrDNA：先用普通：先用普通：先用普通TaqTaqTaq酶进行酶进行酶进行PCRPCRPCR，如有条带，再用，如有条带，再用，如有条带，再用PfuPfuPfu高保真酶高保真酶高保真酶
进行进行进行PCRPCRPCR。。。
引物：引物：引物：Primer1Primer1Primer1（（（27f27f27f）））(5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)(5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
Primer2(1495r)(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)Primer2(1495r)(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)Primer2(1495r)(5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)
反应体系（反应体系（反应体系（50μL50μL50μL）：）：）：
普通普通普通TaqTaqTaq酶：酶：酶：10×PCRbuffer5μL10×PCRbuffer5μL10×PCRbuffer5μL
dNTP(dNTP(dNTP(浓度浓度浓度)4μ)4μ)4μL
引物引物引物111、、、222各各各μμμL
模板模板模板DNADNADNA（浓度（浓度（浓度μg/μμg/μμg/μL）））2μL2μL2μL
普通普通普通TaqTaqTaq酶酶酶2U2U2U
加超纯水至加超纯水至加超纯水至50μL50μL50μL
PfuPfuPfu高保真酶高保真酶高保真酶:10×PCRbuffer5μL:10×PCRbuffer5μL:10×PCRbuffer5μL
dNTP(dNTP(dNTP(浓度浓度浓度)4μ)4μ)4μL
引物引物引物111、、、222各各各μμμL
模板模板模板DNADNADNA（浓度（浓度（浓度μg/μμg/μμg/μL）））2μL2μL2μL
pfupfupfu高保真酶高保真酶高保真酶2U2U2U
加超纯水至加超纯水至加超纯水至505050ｕｕｕLLL
反应条件反应条件反应条件:94℃5min:94℃5min:94℃5min预变性预变性预变性
94℃30sec94℃30sec94℃30sec
54℃30sec54℃30sec54℃30sec
72℃45sec72℃45sec72℃45sec
303030个循环个循环个循环
72℃10min72℃10min72℃10min
444、、、PCRPCRPCR产物检测：琼脂糖电泳（产物检测：琼脂糖电泳（产物检测：琼脂糖电泳（%%%））），，，EBEBEB预先加入凝胶，紫外光下呈像，预先加入凝胶，紫外光下呈像，预先加入凝胶，紫外光下呈像，
GISGISGIS凝胶图象系统分析。凝胶图象系统分析。凝胶图象系统分析。
555、、、PCRPCRPCR产物连接载体：产物连接载体：产物连接载体：
加尾：加尾：加尾：PfuPfuPfu高保真酶高保真酶高保真酶PCRPCRPCR产物中加入产物中加入产物中加入μμμL普通普通普通TaqTaqTaq酶，酶，酶，72℃72℃72℃保温保温保温15min15min15min，将产，将产，将产
物进行琼脂糖电泳，用琼脂糖凝胶物进行琼脂糖电泳，用琼脂糖凝胶物进行琼脂糖电泳，用琼脂糖凝胶DNADNADNA回收试剂盒回收胶上的目的回收试剂盒回收胶上的目的回收试剂盒回收胶上的目的
DNADNADNA
连接：体系（连接：体系（连接：体系（10μL10μL10μL）））
载体缓冲液载体缓冲液载体缓冲液5μL5μL5μL
载体载体载体μμμL
μμμL
条件：条件：条件：16℃16℃16℃水浴箱中，水浴水浴箱中，水浴水浴箱中，水浴999至至至12h12h12h
转化：将连接到载体上的转化：将连接到载体上的转化：将连接到载体上的DNADNADNA转化到大肠杆菌中。转化到大肠杆菌中。转化到大肠杆菌中。
筛选：将转化产物接种在鉴别培养基平板上，培养筛选：将转化产物接种在鉴别培养基平板上，培养筛选：将转化产物接种在鉴别培养基平板上，培养141414至至至18h18h18h。。。
划线分离：挑鉴别培养基上生长的单菌落，在另一鉴别培养基平板上，使菌划线分离：挑鉴别培养基上生长的单菌落，在另一鉴别培养基平板上，使菌划线分离：挑鉴别培养基上生长的单菌落，在另一鉴别培养基平板上，使菌
量增多。量增多。量增多。
菌落菌落菌落PCRPCRPCR：挑目的菌落进行：挑目的菌落进行：挑目的菌落进行PCRPCRPCR反应。反应。反应。
检测：琼脂糖电泳检测目的检测：琼脂糖电泳检测目的检测：琼脂糖电泳检测目的DNADNADNA条带，如果有则证明连接转化成功。条带，如果有则证明连接转化成功。条带，如果有则证明连接转化成功。
666、序列测序：如果转化成功，挑目的菌落在、序列测序：如果转化成功，挑目的菌落在、序列测序：如果转化成功，挑目的菌落在LBLBLB培养基中培养培养基中培养培养基中培养8h8h8h，送到测序，送到测序，送到测序
公司进行测序。公司进行测序。公司进行测序。
实验结果及分析：实验结果及分析：实验结果及分析：
结果：结果：结果：
111、总、总、总DNADNADNA琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：
在在在%%%琼脂糖凝胶，电压琼脂糖凝胶，电压琼脂糖凝胶，电压110V110V110V，电泳，电泳，电泳2h2h2h，出现目的条带，出现目的条带，出现目的条带
123123123
111：：：MarkerMarkerMarker（时间太长，已跑出胶带）（时间太长，已跑出胶带）（时间太长，已跑出胶带）222、、、3:3:3:总总总DNADNADNA
222、普通、普通、普通TaqTaqTaq酶及酶及酶及PfuPfuPfu酶酶酶PCRPCRPCR产物琼脂糖凝胶电泳：产物琼脂糖凝胶电泳：产物琼脂糖凝胶电泳：
在在在%%%琼脂糖凝胶，电压琼脂糖凝胶，电压琼脂糖凝胶，电压90V90V90V，电泳，电泳，电泳1h1h1h，出现目的条带，已用，出现目的条带，已用，出现目的条带，已用GISGISGIS凝胶图象处凝胶图象处凝胶图象处
理系统分析理系统分析理系统分析
123123123
111：：：Marker2:Marker2:Marker2:普通普通普通TaqTaqTaq酶酶酶PCRPCRPCR产物产物产物3:Pfu3:Pfu3:Pfu酶酶酶PCRPCRPCR产物产物产物
333、样品回收凝胶电泳：、样品回收凝胶电泳：、样品回收凝胶电泳：
121212
111、、、222：：：PfuPfuPfu酶酶酶PCRPCRPCR产物产物产物
444、、、PCRPCRPCR产物加尾凝胶电泳产物加尾凝胶电泳产物加尾凝胶电泳
123123123
111：：：Marker2Marker2Marker2、、、3:PCR3:PCR3:PCR产物加尾产物加尾产物加尾
实验尚处于将实验尚处于将实验尚处于将PCRPCRPCR产物连接至载体阶段，所以最终结果未完待续。产物连接至载体阶段，所以最终结果未完待续。产物连接至载体阶段，所以最终结果未完待续。
分析：分析：分析：
普通普通普通TaqTaqTaq酶具有酶具有酶具有5’5’5’至至至3’3’3’端的聚合酶活性和端的聚合酶活性和端的聚合酶活性和5’5’5’至至至3’3’3’端的外切酶活性，端的外切酶活性，端的外切酶活性，
而而而PfuPfuPfu高保真酶不仅具有普通高保真酶不仅具有普通高保真酶不仅具有普通TaqTaqTaq酶的活性，另外还具有酶的活性，另外还具有酶的活性，另外还具有3’3’3’至至至5’5’5’端的外切酶端的外切酶端的外切酶
活性，因而相比之下，活性，因而相比之下，活性，因而相比之下，PfuPfuPfu高保真酶扩增出的序列准确性更高，对于通过比高保真酶扩增出的序列准确性更高，对于通过比高保真酶扩增出的序列准确性更高，对于通过比
对序列鉴定物种这种方法，显然更为精确。对序列鉴定物种这种方法，显然更为精确。对序列鉴定物种这种方法，显然更为精确。
曾经的实验已证明，曾经的实验已证明，曾经的实验已证明，PCRPCRPCR扩增出的扩增出的扩增出的16SrDNA16SrDNA16SrDNA可直接送去测序公司进行测可直接送去测序公司进行测可直接送去测序公司进行测
序。但因为在测序过程中，对前几个至十几个碱基测序的时候容易出错，所序。但因为在测序过程中，对前几个至十几个碱基测序的时候容易出错，所序。但因为在测序过程中，对前几个至十几个碱基测序的时候容易出错，所
以这种方法测得的结果并不准确。而我们采用的是将以这种方法测得的结果并不准确。而我们采用的是将以这种方法测得的结果并不准确。而我们采用的是将16SrDNA16SrDNA16SrDNA连接到一段连接到一段连接到一段
PolyTPolyTPolyT载体上，这样一来，准确性不高的测序在载体上，我们所需的序列的载体上，这样一来，准确性不高的测序在载体上，我们所需的序列的载体上，这样一来，准确性不高的测序在载体上，我们所需的序列的
测序将会更加准确。测序将会更加准确。测序将会更加准确。
传统的依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定并不十分传统的依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定并不十分传统的依靠形态、生理、生化等特征所进行的细菌学分类与鉴定并不十分
可靠，因为缺乏分子层面的数据作支持可靠，因为缺乏分子层面的数据作支持可靠，因为缺乏分子层面的数据作支持,,,因而现在一般采用比对因而现在一般采用比对因而现在一般采用比对16SrDNA16SrDNA16SrDNA序列序列序列
的方法进行鉴定，既精确又简便。的方法进行鉴定，既精确又简便。的方法进行鉴定，既精确又简便。
细胞的核糖体细胞的核糖体细胞的核糖体,,,是由核糖体是由核糖体是由核糖体RNA(rRNA)RNA(rRNA)RNA(rRNA)和蛋白质组成。生物体在漫长的进和蛋白质组成。生物体在漫长的进和蛋白质组成。生物体在漫长的进
化过程中化过程中化过程中,rRNA,rRNA,rRNA基因都保持着相对恒定的生物学功能基因都保持着相对恒定的生物学功能基因都保持着相对恒定的生物学功能,,,保守性极高保守性极高保守性极高,,,因此因此因此,,,从这从这从这
种排列顺序可以探测出其种系发生上的深远关系。种排列顺序可以探测出其种系发生上的深远关系。种排列顺序可以探测出其种系发生上的深远关系。
细菌的核糖体细菌的核糖体细菌的核糖体RNARNARNA包括包括包括333种类型种类型种类型:5SrRNA,16SrRNA:5SrRNA,16SrRNA:5SrRNA,16SrRNA和和和23SrRNA23SrRNA23SrRNA。其中。其中。其中5SrRNA5SrRNA5SrRNA
最容易分析最容易分析最容易分析,,,但由于其含有的核酸较少但由于其含有的核酸较少但由于其含有的核酸较少,,,没有足够的遗传信息用于研没有足够的遗传信息用于研没有足够的遗传信息用于研
究。究。究。23SrRNA23SrRNA23SrRNA所含有的核酸碱基数量几乎是所含有的核酸碱基数量几乎是所含有的核酸碱基数量几乎是16SrRNA16SrRNA16SrRNA的的的222倍倍倍,,,用于分析较困难。用于分析较困难。用于分析较困难。
由于由于由于16SrRNA16SrRNA16SrRNA的核酸数量适中的核酸数量适中的核酸数量适中,,,所以用于分类分析最理想。现在人们已经认同所以用于分类分析最理想。现在人们已经认同所以用于分类分析最理想。现在人们已经认同,,,
16SrRNA16SrRNA16SrRNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生关系基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生关系基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生关系,,,在细菌分类在细菌分类在细菌分类
学中可作为一个科学可靠的指标。学中可作为一个科学可靠的指标。学中可作为一个科学可靠的指标。
开放实验是学校教学改革的一项新的内容，旨在提高学生的科研能力。开放实验是学校教学改革的一项新的内容，旨在提高学生的科研能力。开放实验是学校教学改革的一项新的内容，旨在提高学生的科研能力。
我是利用这个暑假进行的该项实验，我的体会很深，通过不断实验，不我是利用这个暑假进行的该项实验，我的体会很深，通过不断实验，不我是利用这个暑假进行的该项实验，我的体会很深，通过不断实验，不
仅在动手操作上有了很大进步，而且更重要是科研思维，分析、解决问题的仅在动手操作上有了很大进步，而且更重要是科研思维，分析、解决问题的仅在动手操作上有了很大进步，而且更重要是科研思维，分析、解决问题的
能力得到了锻炼和提高。能力得到了锻炼和提高。能力得到了锻炼和提高。
虽然现在实验仍未完成，也许还会遇到很多困难，但是，我一定会努力虽然现在实验仍未完成，也许还会遇到很多困难，但是，我一定会努力虽然现在实验仍未完成，也许还会遇到很多困难，但是，我一定会努力
克服，完成实验。克服，完成实验。克服，完成实验。
本实验在莫湘涛老师的指导下进行，还受到郭向荣老师、孙运军老师、李本实验在莫湘涛老师的指导下进行，还受到郭向荣老师、孙运军老师、李本实验在莫湘涛老师的指导下进行，还受到郭向荣老师、孙运军老师、李
东屏老师、刘如石老师、付祖娇博士的帮助，真诚地感谢老师辛勤的劳动！东屏老师、刘如石老师、付祖娇博士的帮助，真诚地感谢老师辛勤的劳动！东屏老师、刘如石老师、付祖娇博士的帮助，真诚地感谢老师辛勤的劳动！
温敏核不育水稻黄化苗叶绿体超微结构观察温敏核不育水稻黄化苗叶绿体超微结构观察温敏核不育水稻黄化苗叶绿体超微结构观察
生命科学学院生命科学学院生命科学学院
学生姓名：学生姓名：学生姓名：俞进学号：俞进学号：俞进学号：N41030231N41030231N41030231 专业：生物技术专业：生物技术专业：生物技术
罗庆罗庆罗庆 N41030213N41030213N41030213 生物技术生物技术生物技术
全梅芳全梅芳全梅芳 N41030118N41030118N41030118 生物基地生物基地生物基地
龙波龙波龙波 N41030224N41030224N41030224 生物基地生物基地生物基地
指导教师：指导教师：指导教师：邱义兰博士邱义兰博士邱义兰博士
实验主要设备、材料：实验主要设备、材料：实验主要设备、材料：电子天平、摇床、透射电镜（型号：电子天平、摇床、透射电镜（型号：电子天平、摇床、透射电镜（型号：JEM1230JEM1230JEM1230）））、、、LeicaEmkmr2LeicaEmkmr2LeicaEmkmr2
制刀机、制刀机、制刀机、LeikaUltracutRLeikaUltracutRLeikaUltracutR 切片机等；实验材料为切片机等；实验材料为切片机等；实验材料为 810S(810S(810S(温敏核不育水稻温敏核不育水稻温敏核不育水稻)))
和标和标和标 8S(810S8S(810S8S(810S 自然突变的黄化苗自然突变的黄化苗自然突变的黄化苗)))的半展叶和全展叶的半展叶和全展叶的半展叶和全展叶
实验目的实验目的实验目的:::通过比较黄化突变体标通过比较黄化突变体标通过比较黄化突变体标 8S8S8S 与野生型材料与野生型材料与野生型材料 810S810S810S 不同发育时期叶片的叶绿体不同发育时期叶片的叶绿体不同发育时期叶片的叶绿体
的超微结构，从细胞水平上探讨叶片黄化的结构原因。的超微结构，从细胞水平上探讨叶片黄化的结构原因。的超微结构，从细胞水平上探讨叶片黄化的结构原因。
实验原理实验原理实验原理:::用电子束照射标本用电子束照射标本用电子束照射标本,,,通过电磁透镜收集穿透标本的电子通过电磁透镜收集穿透标本的电子通过电磁透镜收集穿透标本的电子,,,并放大成像并放大成像并放大成像,,,用以显用以显用以显
示物体内部超微结构的装置示物体内部超微结构的装置示物体内部超微结构的装置...
实验过程实验过程实验过程:::
111、前固定：分别取、前固定：分别取、前固定：分别取 810S810S810S 和标和标和标 8S8S8S 的半展叶和全展叶叶片中部，并切成约的半展叶和全展叶叶片中部，并切成约的半展叶和全展叶叶片中部，并切成约 1mm1mm1mm222 大小，大小，大小，
然后迅速放进前固定液（然后迅速放进前固定液（然后迅速放进前固定液（%%%戊二醛戊二醛戊二醛+++ 磷酸缓冲液）中，室温下固定磷酸缓冲液）中，室温下固定磷酸缓冲液）中，室温下固定
3h3h3h。。。
222、洗涤：将样品用、洗涤：将样品用、洗涤：将样品用 磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤 444 次次次,,,每次每次每次 20min20min20min。。。
333、后固定：将材料转入后固定液（、后固定：将材料转入后固定液（、后固定：将材料转入后固定液（1%1%1%锇酸锇酸锇酸+++ 磷酸缓冲液）中，磷酸缓冲液）中，磷酸缓冲液）中，4℃4℃4℃下固定下固定下固定 16h16h16h 左左左
右。右。右。
444、洗涤：将样品用、洗涤：将样品用、洗涤：将样品用 磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤磷酸缓冲液洗涤 444 次次次,,,每次每次每次 20min20min20min。。。
555、脱水：经、脱水：经、脱水：经 10%-100%10%-100%10%-100%丙酮逐级脱水。丙酮逐级脱水。丙酮逐级脱水。
666、渗透：转入、渗透：转入、渗透：转入 spurrspurrspurr 环氧树脂中渗透环氧树脂中渗透环氧树脂中渗透 2d2d2d，，，
777、包埋：将样品用包埋板包埋。、包埋：将样品用包埋板包埋。、包埋：将样品用包埋板包埋。
888、聚合：将包埋好的样品先在、聚合：将包埋好的样品先在、聚合：将包埋好的样品先在 50℃50℃50℃下聚合下聚合下聚合 12h12h12h，后在，后在，后在 65℃65℃65℃下聚合下聚合下聚合 24h24h24h。。。
999、切片：用、切片：用、切片：用 LeicaEmkmr2LeicaEmkmr2LeicaEmkmr2 制刀机制成的玻璃刀在制刀机制成的玻璃刀在制刀机制成的玻璃刀在 LeikaUltracutRLeikaUltracutRLeikaUltracutR 切片机上将样品切切片机上将样品切切片机上将样品切
成厚度约成厚度约成厚度约 60nm60nm60nm 的超薄切片，然后将超薄切片捞在覆有的超薄切片，然后将超薄切片捞在覆有的超薄切片，然后将超薄切片捞在覆有 FormvarFormvarFormvar 膜的铜网膜的铜网膜的铜网
上。上。上。
101010、染色：将超薄切片分别用、染色：将超薄切片分别用、染色：将超薄切片分别用 2%2%2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅饱合液进行双重染色。醋酸双氧铀和柠檬酸铅饱合液进行双重染色。醋酸双氧铀和柠檬酸铅饱合液进行双重染色。
111111、观察：然后在、观察：然后在、观察：然后在 JEM-1230JEM-1230JEM-1230 型透射电镜下观察、拍照。型透射电镜下观察、拍照。型透射电镜下观察、拍照。
实验结果及分析实验结果及分析实验结果及分析:::
111、、、标标标 8S8S8S 与与与 810S810S810S 自然状态下的外观自然状态下的外观自然状态下的外观
与野生型的光敏核不育水稻与野生型的光敏核不育水稻与野生型的光敏核不育水稻 810S810S810S 比较，黄化突变体标比较，黄化突变体标比较，黄化突变体标 8S8S8S 的叶色在植株整个发育的叶色在植株整个发育的叶色在植株整个发育
过程中表现为黄色（图过程中表现为黄色（图过程中表现为黄色（图 111））），不因温度和光照的改变而变化。，不因温度和光照的改变而变化。，不因温度和光照的改变而变化。
222、叶肉细胞的形态、叶肉细胞的形态、叶肉细胞的形态
水稻叶肉细胞呈多角形花环结构，细胞核位于中央，几个大的液泡占据细胞的大水稻叶肉细胞呈多角形花环结构，细胞核位于中央，几个大的液泡占据细胞的大水稻叶肉细胞呈多角形花环结构，细胞核位于中央，几个大的液泡占据细胞的大
部分体积，将细胞质挤到细胞的四周沿壁分布。叶绿体贴细胞壁分布，叶绿体中贮部分体积，将细胞质挤到细胞的四周沿壁分布。叶绿体贴细胞壁分布，叶绿体中贮部分体积，将细胞质挤到细胞的四周沿壁分布。叶绿体贴细胞壁分布，叶绿体中贮
存有一些白色的大的淀粉颗粒（图存有一些白色的大的淀粉颗粒（图存有一些白色的大的淀粉颗粒（图 222）））。。。
图 1：标 8S与 810S叶片颜色比较图 2：叶片叶肉细胞（N细胞核，Chl叶绿体）
333、半展叶片叶绿体超微结构的比较、半展叶片叶绿体超微结构的比较、半展叶片叶绿体超微结构的比较
比较标比较标比较标 8S8S8S 与与与 810S810S810S 半展叶片叶绿体超微结构，结果见于图半展叶片叶绿体超微结构，结果见于图半展叶片叶绿体超微结构，结果见于图 333、图、图、图 444。从图中可看。从图中可看。从图中可看
出，标出，标出，标 8S8S8S 与与与 810S810S810S 半展叶片叶绿体中均有淀粉粒，但两者的内膜系统的结构存在差半展叶片叶绿体中均有淀粉粒，但两者的内膜系统的结构存在差半展叶片叶绿体中均有淀粉粒，但两者的内膜系统的结构存在差
异，野生型异，野生型异，野生型 810S810S810S 叶绿体基粒数目多于黄化苗标叶绿体基粒数目多于黄化苗标叶绿体基粒数目多于黄化苗标 8S8S8S，且基粒的类囊体片层也丰富一，且基粒的类囊体片层也丰富一，且基粒的类囊体片层也丰富一
些。因此，在叶片细嫩时期，黄化苗标些。因此，在叶片细嫩时期，黄化苗标些。因此，在叶片细嫩时期，黄化苗标 8S8S8S 与野生型与野生型与野生型 810S810S810S 两者叶绿体结构尚未发育两者叶绿体结构尚未发育两者叶绿体结构尚未发育
完全，但均有进行光合作用并合成淀粉粒的能力，但前者进行光合作用的能力比后完全，但均有进行光合作用并合成淀粉粒的能力，但前者进行光合作用的能力比后完全，但均有进行光合作用并合成淀粉粒的能力，但前者进行光合作用的能力比后
者差。者差。者差。
444、全展叶片叶绿体超微结构的比较、全展叶片叶绿体超微结构的比较、全展叶片叶绿体超微结构的比较
比较标比较标比较标 8S8S8S 与与与 810S810S810S 全展叶叶片叶绿体超微结构，结果见于图全展叶叶片叶绿体超微结构，结果见于图全展叶叶片叶绿体超微结构，结果见于图 555 与图与图与图 666。从图中可看。从图中可看。从图中可看
出，标出，标出，标 8S8S8S 与与与 810S810S810S 的全展叶叶绿体中的类囊体膜均变得比半展叶时的丰富，且基质的全展叶叶绿体中的类囊体膜均变得比半展叶时的丰富，且基质的全展叶叶绿体中的类囊体膜均变得比半展叶时的丰富，且基质
中出现一些嗜锇颗粒。但两者的叶绿体结构的差异变得更明显，野生型中出现一些嗜锇颗粒。但两者的叶绿体结构的差异变得更明显，野生型中出现一些嗜锇颗粒。但两者的叶绿体结构的差异变得更明显，野生型 810S810S810S 的基粒的基粒的基粒
片层排列很规则，与叶绿体纵向平行排列。突变体黄化苗标片层排列很规则，与叶绿体纵向平行排列。突变体黄化苗标片层排列很规则，与叶绿体纵向平行排列。突变体黄化苗标 8S8S8S 的类囊体膜虽然可以的类囊体膜虽然可以的类囊体膜虽然可以
垛叠起来形成基粒，但不同基粒之间的类囊体膜的排列很紊乱。因此，到了功能叶垛叠起来形成基粒，但不同基粒之间的类囊体膜的排列很紊乱。因此，到了功能叶垛叠起来形成基粒，但不同基粒之间的类囊体膜的排列很紊乱。因此，到了功能叶
片时期，黄化苗标片时期，黄化苗标片时期，黄化苗标 8S8S8S 与野生型与野生型与野生型 810S810S810S 的叶绿体结构均已发育完全，但两者的差异变的叶绿体结构均已发育完全，但两者的差异变的叶绿体结构均已发育完全，但两者的差异变
得明显，从结构上看前者进行光合作用的能力比后者差。得明显，从结构上看前者进行光合作用的能力比后者差。得明显，从结构上看前者进行光合作用的能力比后者差。
剁辣椒中的菌种纯化与鉴定剁辣椒中的菌种纯化与鉴定剁辣椒中的菌种纯化与鉴定
生物科学专业生物科学专业生物科学专业 200320032003 级级级
林娟、万闰百、黄海龙、黄超洋、江炎亮、李洁林娟、万闰百、黄海龙、黄超洋、江炎亮、李洁林娟、万闰百、黄海龙、黄超洋、江炎亮、李洁
指导教师：指导教师：指导教师：谢伟岸谢伟岸谢伟岸
摘要：摘要：摘要：本文主要以剁辣椒为研究对象，从中分离出五种典型菌株，经过一本文主要以剁辣椒为研究对象，从中分离出五种典型菌株，经过一本文主要以剁辣椒为研究对象，从中分离出五种典型菌株，经过一
系列表型特征和生理生化特征（包括发酵试验、吲哚试验、明胶液化试验、硫系列表型特征和生理生化特征（包括发酵试验、吲哚试验、明胶液化试验、硫系列表型特征和生理生化特征（包括发酵试验、吲哚试验、明胶液化试验、硫
化氢试验、过氧化所试验）签定，确定五种菌分别为：芽孢乳杆菌、植物乳杆化氢试验、过氧化所试验）签定，确定五种菌分别为：芽孢乳杆菌、植物乳杆化氢试验、过氧化所试验）签定，确定五种菌分别为：芽孢乳杆菌、植物乳杆
菌、植物乳珠菌、短乳杆菌和明串珠菌。并初步研究了利用液体石蜡对其保藏菌、植物乳珠菌、短乳杆菌和明串珠菌。并初步研究了利用液体石蜡对其保藏菌、植物乳珠菌、短乳杆菌和明串珠菌。并初步研究了利用液体石蜡对其保藏
的方法。的方法。的方法。
关键词：关键词：关键词：剁辣椒；乳酸菌；纯化；鉴定；菌种保存剁辣椒；乳酸菌；纯化；鉴定；菌种保存剁辣椒；乳酸菌；纯化；鉴定；菌种保存
AbstractAbstractAbstract：：：
Inthispovper,,,
sulosoftheseriesamalysiswithapperentcharacteristicsandphysiologicalansulosoftheseriesamalysiswithapperentcharacteristicsandphysiologicalansulosoftheseriesamalysiswithapperentcharacteristicsandphysiologicalan
dbiochemicalcharacteristics(includingsugarfermentationtest,indoletest,gdbiochemicalcharacteristics(includingsugarfermentationtest,indoletest,gdbiochemicalcharacteristics(includingsugarfermentationtest,indoletest,g
elatinliquefactiontest,hydrogensulfiedtest,catalasetest)demonstratedtelatinliquefactiontest,hydrogensulfiedtest,catalasetest)demonstratedtelatinliquefactiontest,hydrogensulfiedtest,catalasetest)demonstratedt
hatthefivegenmswereseparratelysdporelactobacillus,Lactobaillisplantanhatthefivegenmswereseparratelysdporelactobacillus,Lactobaillisplantanhatthefivegenmswereseparratelysdporelactobacillus,Lactobaillisplantan
rum,lactococcus,,lactococcus,,lactococcus,
tion,theexperimentexploredprimanythepreservationmethodthatwtilizefhiltion,theexperimentexploredprimanythepreservationmethodthatwtilizefhiltion,theexperimentexploredprimanythepreservationmethodthatwtilizefhil
.
KeyWords:KeyWords:KeyWords:Choppedpepper;LacticAidBacteria;PurificationandidentificChoppedpepper;LacticAidBacteria;PurificationandidentificChoppedpepper;LacticAidBacteria;Purificationandidentific
ation;Culturecollectionation;Culturecollectionation;Culturecollection
111 绪论绪论绪论
蔬菜是人体所需维生素、矿物质的重要来源之一。剁辣椒腌制开始时，其蔬菜是人体所需维生素、矿物质的重要来源之一。剁辣椒腌制开始时，其蔬菜是人体所需维生素、矿物质的重要来源之一。剁辣椒腌制开始时，其
表面附着有大量的不同种类的微生物，在剁辣椒腌制过程中，附着于剁辣椒表表面附着有大量的不同种类的微生物，在剁辣椒腌制过程中，附着于剁辣椒表表面附着有大量的不同种类的微生物，在剁辣椒腌制过程中，附着于剁辣椒表
面的各种微生物都带入产品中，由此产生了发酵作用。微生物发酵过程使产品面的各种微生物都带入产品中，由此产生了发酵作用。微生物发酵过程使产品面的各种微生物都带入产品中，由此产生了发酵作用。微生物发酵过程使产品
产生各种风味和芳香成分。由此可见，微生物发酵在剁辣椒腌制过程中具有十产生各种风味和芳香成分。由此可见，微生物发酵在剁辣椒腌制过程中具有十产生各种风味和芳香成分。由此可见，微生物发酵在剁辣椒腌制过程中具有十
分重要作用。腌制过程中常出现的有利发酵主要有三种，起主导作用的是乳酸分重要作用。腌制过程中常出现的有利发酵主要有三种，起主导作用的是乳酸分重要作用。腌制过程中常出现的有利发酵主要有三种，起主导作用的是乳酸
发酵，酒精发酵次之，醋酸发酵最少。另外，还伴随一些有害发酵，如丁酸发发酵，酒精发酵次之，醋酸发酵最少。另外，还伴随一些有害发酵，如丁酸发发酵，酒精发酵次之，醋酸发酵最少。另外，还伴随一些有害发酵，如丁酸发
酵等。酵等。酵等。
乳酸发酵是剁辣椒腌制过程中最主要的发酵作用，任何剁辣椒腌制品在腌乳酸发酵是剁辣椒腌制过程中最主要的发酵作用，任何剁辣椒腌制品在腌乳酸发酵是剁辣椒腌制过程中最主要的发酵作用，任何剁辣椒腌制品在腌
制过程中都存在不同程序的乳酸发酵。根据乳酸菌发酵产生乳酸的情况，可将制过程中都存在不同程序的乳酸发酵。根据乳酸菌发酵产生乳酸的情况，可将制过程中都存在不同程序的乳酸发酵。根据乳酸菌发酵产生乳酸的情况，可将
乳酸发酵分为正型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。乳酸发酵分为正型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。乳酸发酵分为正型乳酸发酵和异型乳酸发酵两类。
正型乳酸发酵的微生物通常在正型乳酸发酵的微生物通常在正型乳酸发酵的微生物通常在 45℃45℃45℃或较高的温度下生长，以葡萄粮和某些或较高的温度下生长，以葡萄粮和某些或较高的温度下生长，以葡萄粮和某些
双糖为发酵底物，主要产物为双糖为发酵底物，主要产物为双糖为发酵底物，主要产物为 80%80%80%左右或更多的乳酸，不产气。剁辣椒腌制中常左右或更多的乳酸，不产气。剁辣椒腌制中常左右或更多的乳酸，不产气。剁辣椒腌制中常
见的正型乳酸菌有植物乳杆菌和乳球菌等。这几种乳酸菌的乳酸发酵是剁辣椒见的正型乳酸菌有植物乳杆菌和乳球菌等。这几种乳酸菌的乳酸发酵是剁辣椒见的正型乳酸菌有植物乳杆菌和乳球菌等。这几种乳酸菌的乳酸发酵是剁辣椒
腌制过程中有的主要形式。异型乳酸发酵的微生物常在腌制过程中有的主要形式。异型乳酸发酵的微生物常在腌制过程中有的主要形式。异型乳酸发酵的微生物常在 15~45℃15~45℃15~45℃下生长，以葡萄下生长，以葡萄下生长，以葡萄
糖等单糖和双糖为发酵底物，主要产物为糖等单糖和双糖为发酵底物，主要产物为糖等单糖和双糖为发酵底物，主要产物为 50%50%50%左右的乳酸和大量左右的乳酸和大量左右的乳酸和大量 COCOCO222、乙醇、乙、乙醇、乙、乙醇、乙
酸。在剁辣椒腌制过程中常见的有短乳杆菌和肠膜明串珠菌等。酸。在剁辣椒腌制过程中常见的有短乳杆菌和肠膜明串珠菌等。酸。在剁辣椒腌制过程中常见的有短乳杆菌和肠膜明串珠菌等。
乳酸菌是一群可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，这个名称就乳酸菌是一群可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，这个名称就乳酸菌是一群可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，这个名称就
细菌分类学而言是一个非正式、非规范的名称细菌分类学而言是一个非正式、非规范的名称细菌分类学而言是一个非正式、非规范的名称[2][2][2]。乳酸菌在自然界分布广泛，。乳酸菌在自然界分布广泛，。乳酸菌在自然界分布广泛，
在工业、农业、医药和食品行业等与人类生活密切相关的重要领导都有很高的在工业、农业、医药和食品行业等与人类生活密切相关的重要领导都有很高的在工业、农业、医药和食品行业等与人类生活密切相关的重要领导都有很高的
应用价值。目前在自然界已发现的乳酸菌在细菌分类学上可划分出至少应用价值。目前在自然界已发现的乳酸菌在细菌分类学上可划分出至少应用价值。目前在自然界已发现的乳酸菌在细菌分类学上可划分出至少 323232 个个个
属，涉及到的有关属则更多，包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属，涉及到的有关属则更多，包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属，涉及到的有关属则更多，包括乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌
属等。乳酸菌特征包括革兰氏染色阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼属等。乳酸菌特征包括革兰氏染色阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼属等。乳酸菌特征包括革兰氏染色阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼
性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等，其最适生长温度一般在性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等，其最适生长温度一般在性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等，其最适生长温度一般在
15~45℃15~45℃15~45℃，耐酸性较好，在，耐酸性较好，在，耐酸性较好，在 PHPHPH＜＜＜555 的环境中仍然良好生长。根据乳酸菌菌体细胞的环境中仍然良好生长。根据乳酸菌菌体细胞的环境中仍然良好生长。根据乳酸菌菌体细胞
的形态，可分为球菌和杆菌。球菌包括链球菌属、明串珠菌属及片球菌属等；的形态，可分为球菌和杆菌。球菌包括链球菌属、明串珠菌属及片球菌属等；的形态，可分为球菌和杆菌。球菌包括链球菌属、明串珠菌属及片球菌属等；
杆菌包括乳杆菌属、双歧杆菌属等杆菌包括乳杆菌属、双歧杆菌属等杆菌包括乳杆菌属、双歧杆菌属等[2[2[2，，，333，，，444，，，5]5]5]。。。
发酵过程及的乳酸菌主要有乳杆菌属细菌、明串珠菌最细菌等。发酵过程及的乳酸菌主要有乳杆菌属细菌、明串珠菌最细菌等。发酵过程及的乳酸菌主要有乳杆菌属细菌、明串珠菌最细菌等。（（（111）乳杆）乳杆）乳杆
菌属细菌的细胞形态多样，从长和细长状到弯曲形及短杆状，也常有棒形球杆菌属细菌的细胞形态多样，从长和细长状到弯曲形及短杆状，也常有棒形球杆菌属细菌的细胞形态多样，从长和细长状到弯曲形及短杆状，也常有棒形球杆
状，一般形成链；通常不运动，不产芽孢，革兰氏染色阳性。这类细菌一般都状，一般形成链；通常不运动，不产芽孢，革兰氏染色阳性。这类细菌一般都状，一般形成链；通常不运动，不产芽孢，革兰氏染色阳性。这类细菌一般都
是兼性厌氧菌，通常套氧或减少氧分压能增加固体培养基上的表面生长量，最是兼性厌氧菌，通常套氧或减少氧分压能增加固体培养基上的表面生长量，最是兼性厌氧菌，通常套氧或减少氧分压能增加固体培养基上的表面生长量，最
适宜生长温度为适宜生长温度为适宜生长温度为 30~40℃30~40℃30~40℃，不还原硝酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产吲哚，不还原硝酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产吲哚，不还原硝酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产吲哚
和硫化氢，接触酶阴性。和硫化氢，接触酶阴性。和硫化氢，接触酶阴性。（（（222）明串珠菌属细菌细胸为球形，通常呈豆状，常成）明串珠菌属细菌细胸为球形，通常呈豆状，常成）明串珠菌属细菌细胸为球形，通常呈豆状，常成
对或链状排列。革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢，兼性厌氧，最适生长温对或链状排列。革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢，兼性厌氧，最适生长温对或链状排列。革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢，兼性厌氧，最适生长温
度度度 20~30℃20~30℃20~30℃[2][2][2]。。。
剁辣椒发酵过程所涉及的乳酸菌具有一些共同特点剁辣椒发酵过程所涉及的乳酸菌具有一些共同特点剁辣椒发酵过程所涉及的乳酸菌具有一些共同特点[2[2[2，，，4]4]4]：（：（：（111）具有很强的）具有很强的）具有很强的
抗酸能力。抗酸能力。抗酸能力。（（（222）大部分乳酸菌具有很强的耐盐性，一般都能耐）大部分乳酸菌具有很强的耐盐性，一般都能耐）大部分乳酸菌具有很强的耐盐性，一般都能耐 5%5%5%以上的以上的以上的 NaC1NaC1NaC1 溶溶溶
液。液。液。（（（333）其中常见的乳酸菌一般都不含硝协还厚酶。）其中常见的乳酸菌一般都不含硝协还厚酶。）其中常见的乳酸菌一般都不含硝协还厚酶。（（（444）乳酸菌的代谢产物中）乳酸菌的代谢产物中）乳酸菌的代谢产物中
除了乳酸等有机酸能抑制其他杂菌生长外，还产生其他一些抑菌性物质，如细除了乳酸等有机酸能抑制其他杂菌生长外，还产生其他一些抑菌性物质，如细除了乳酸等有机酸能抑制其他杂菌生长外，还产生其他一些抑菌性物质，如细
菌素、双乙酰等。菌素、双乙酰等。菌素、双乙酰等。
剁辣椒乳酸发酵是一种传统的保藏方法和风味食品制作方法。辣椒剁辣椒乳酸发酵是一种传统的保藏方法和风味食品制作方法。辣椒剁辣椒乳酸发酵是一种传统的保藏方法和风味食品制作方法。辣椒
（（（PepperPepperPepper）属于茄科辣椒属植物的果实，富含维生素）属于茄科辣椒属植物的果实，富含维生素）属于茄科辣椒属植物的果实，富含维生素 CCC、胡萝卜素、维生素、胡萝卜素、维生素、胡萝卜素、维生素 EEE、、、
钙、铁、磷等营养成分。辣椒含有的辣椒素是一种挥发油，呈现辣味，其含量钙、铁、磷等营养成分。辣椒含有的辣椒素是一种挥发油，呈现辣味，其含量钙、铁、磷等营养成分。辣椒含有的辣椒素是一种挥发油，呈现辣味，其含量
大约为大约为大约为 %%%———%%%[6][6][6]。近。近。近 101010 年来随着辣椒基础研究的深化，辣椒的营养保健价年来随着辣椒基础研究的深化，辣椒的营养保健价年来随着辣椒基础研究的深化，辣椒的营养保健价
值越来越为消费者所认为。辣椒产业已逐渐成为我省的特色经济产业，其中将值越来越为消费者所认为。辣椒产业已逐渐成为我省的特色经济产业，其中将值越来越为消费者所认为。辣椒产业已逐渐成为我省的特色经济产业，其中将
鲜辣椒剁碎后在厌氧条件下自然酵而成为鲜辣椒剁碎后在厌氧条件下自然酵而成为鲜辣椒剁碎后在厌氧条件下自然酵而成为“““剁辣椒剁辣椒剁辣椒”””，因其风味独特，香辣突，因其风味独特，香辣突，因其风味独特，香辣突
出，开胃消食而倍受消费者欢迎。但目前上市的剁辣椒基本上为自然发酵制出，开胃消食而倍受消费者欢迎。但目前上市的剁辣椒基本上为自然发酵制出，开胃消食而倍受消费者欢迎。但目前上市的剁辣椒基本上为自然发酵制
作，存在着工艺不规范、微生物种群不一致、质量不稳定、存储易引起风味改作，存在着工艺不规范、微生物种群不一致、质量不稳定、存储易引起风味改作，存在着工艺不规范、微生物种群不一致、质量不稳定、存储易引起风味改
变等诸多问题，远远达不到现代食品加工的要求。变等诸多问题，远远达不到现代食品加工的要求。变等诸多问题，远远达不到现代食品加工的要求。
因此我们可以采用人们喜爱的剁辣椒为研究对象，通过研究剁辣椒在发酵因此我们可以采用人们喜爱的剁辣椒为研究对象，通过研究剁辣椒在发酵因此我们可以采用人们喜爱的剁辣椒为研究对象，通过研究剁辣椒在发酵
过程中的一系更理化特性以获得控制工业化生产的最佳条件的数据。在腌制的过程中的一系更理化特性以获得控制工业化生产的最佳条件的数据。在腌制的过程中的一系更理化特性以获得控制工业化生产的最佳条件的数据。在腌制的
一开始就严格控制各种理化因素，创造一种从营养到生态环境都有利于乳酸菌一开始就严格控制各种理化因素，创造一种从营养到生态环境都有利于乳酸菌一开始就严格控制各种理化因素，创造一种从营养到生态环境都有利于乳酸菌
生长的微生物条件，以促进乳酸菌的旺盛生长，抑制其它杂菌的生长，达到控生长的微生物条件，以促进乳酸菌的旺盛生长，抑制其它杂菌的生长，达到控生长的微生物条件，以促进乳酸菌的旺盛生长，抑制其它杂菌的生长，达到控
制发酵过程和改善剁辣椒产品风味和质量的目的。在取得一定的数据得到最佳制发酵过程和改善剁辣椒产品风味和质量的目的。在取得一定的数据得到最佳制发酵过程和改善剁辣椒产品风味和质量的目的。在取得一定的数据得到最佳
控制条件后即考虑人工接纯种优势乳酸菌的方法增强发酵体系中有益菌的生长控制条件后即考虑人工接纯种优势乳酸菌的方法增强发酵体系中有益菌的生长控制条件后即考虑人工接纯种优势乳酸菌的方法增强发酵体系中有益菌的生长
抑制杂菌生长繁殖。本次实验，主要是纯化和鉴定该发酵过程中的典型菌种，抑制杂菌生长繁殖。本次实验，主要是纯化和鉴定该发酵过程中的典型菌种，抑制杂菌生长繁殖。本次实验，主要是纯化和鉴定该发酵过程中的典型菌种，
是达到以上目的的重要部分。是达到以上目的的重要部分。是达到以上目的的重要部分。
222 材料和方法材料和方法材料和方法
试验材料试验材料试验材料
样品样品样品
分离出的乳酸杆菌、芽孢乳杆菌、明串珠菌、乳球菌、植物乳杆菌分离出的乳酸杆菌、芽孢乳杆菌、明串珠菌、乳球菌、植物乳杆菌分离出的乳酸杆菌、芽孢乳杆菌、明串珠菌、乳球菌、植物乳杆菌
分离培养基分离培养基分离培养基[2,5][2,5][2,5]
乳酸杆菌分离培养基乳酸杆菌分离培养基乳酸杆菌分离培养基
蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g10g10g 酵母提取物酵母提取物酵母提取物 5g5g5g
牛肉浸膏牛肉浸膏牛肉浸膏 10gK10gK10gK222HPOHPOHPO4442g2g2g
柠檬酸二铵柠檬酸二铵柠檬酸二铵 2g2g2g 乙酸钠乙酸钠乙酸钠 5g5g5g
葡萄糖葡萄糖葡萄糖 20g20g20g 吐温吐温吐温
琼脂琼脂琼脂 30g30g30g 蒸馏水蒸馏水蒸馏水 1L1L1L
调调调 ———,121℃,121℃,121℃灭菌灭菌灭菌 151515 分钟分钟分钟
芽孢乳杆菌分离培养基芽孢乳杆菌分离培养基芽孢乳杆菌分离培养基
葡萄糖葡萄糖葡萄糖 20g20g20g 酵母提取物酵母提取物酵母提取物 10g10g10g
蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g10g10g 乙酸钠乙酸钠乙酸钠 10g10g10g
琼脂琼脂琼脂 30g30g30g
调调调 ,121℃,121℃,121℃灭菌灭菌灭菌 151515 分钟分钟分钟
明串珠菌分离培养基明串珠菌分离培养基明串珠菌分离培养基
葡萄糖葡萄糖葡萄糖 20g20g20g 蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g10g10g
牛肉浸膏牛肉浸膏牛肉浸膏 8g8g8g 酵母提取物酵母提取物酵母提取物 5g5g5g
KKK222HPOHPOHPO4442gMgSO2gMgSO2gMgSO4447H7H7H222O2gO2gO2g
柠檬酸铵柠檬酸铵柠檬酸铵 2g2g2g
乙酸钠乙酸钠乙酸钠 5g5g5g 吐温吐温吐温 801ml801ml801ml
蒸馏水蒸馏水蒸馏水 1L1L1L
调调调 ,121℃,121℃,121℃灭菌灭菌灭菌 .
乳球菌分离培养基（乳球菌分离培养基（乳球菌分离培养基（EllikerEllikerElliker 琼脂培养基）琼脂培养基）琼脂培养基）
胰胨胰胨胰胨 20g20g20g 蔗糖蔗糖蔗糖
酵母提取物酵母提取物酵母提取物 5gNacl4g5gNacl4g5gNacl4g
明胶明胶明胶 乙酸钠乙酸钠乙酸钠
葡萄糖葡萄糖葡萄糖 5g5g5g 抗坏血酸抗坏血酸抗坏血酸
乳糖乳糖乳糖 5g5g5g 琼脂琼脂琼脂 15g15g15g
调调调 ,121℃,121℃,121℃灭菌灭菌灭菌 .
植物乳杆分离培养基植物乳杆分离培养基植物乳杆分离培养基
蛋白胨蛋白胨蛋白胨 10g10g10g 牛肉膏牛肉膏牛肉膏 10g10g10g
醋酸钠醋酸钠醋酸钠 5g5g5g 葡萄糖葡萄糖葡萄糖 3g3g3g
乳糖乳糖乳糖 2g2g2g 吐温吐温吐温 801ml801ml801ml
枸橼酸三氨枸橼酸三氨枸橼酸三氨 2g2g2g
琼脂琼脂琼脂
121℃121℃121℃灭菌灭菌灭菌 15min15min15min，冷却至，冷却至，冷却至 15℃15℃15℃左右。加入总量的左右。加入总量的左右。加入总量的 2%2%2%无菌无菌无菌 CaCO(CaCO(CaCO(333。。。
鉴别的培养基鉴别的培养基鉴别的培养基[][][]
糖发酵试验培养基糖发酵试验培养基糖发酵试验培养基
蛋白胨蛋白胨蛋白胨 5g5g5g 吐温吐温吐温
蒸馏水蒸馏水蒸馏水 1L1L1L 牛肉膏牛肉膏牛肉膏 5g5g5g
糖类或醇类糖类或醇类糖类或醇类 10g10g10g 酵母提取物酵母提取物酵母提取物 5g5g5g
琼脂琼脂琼脂 5g5g5g 溴甲紫水溶液（溴甲紫水溶液（溴甲紫水溶液（%%%）））
调调调 ———，分装试管。，分装试管。，分装试管。115℃115℃115℃灭菌灭菌灭菌 303030 分钟分钟分钟
吲哚试验培养基吲哚试验培养基吲哚试验培养基
1%1%1%胰胨水溶液胰胨水溶液胰胨水溶液
调调调 ———，分装试管。，分装试管。，分装试管。115℃115℃115℃灭菌灭菌灭菌 303030 分钟分钟分钟
明胶液化试验培养基明胶液化试验培养基明胶液化试验培养基
蛋白胨蛋白胨蛋白胨 1g1g1g 盐溶液盐溶液盐溶液 4ml4ml4ml
酵母提取物酵母提取物酵母提取物 1g1g1g 葡萄糖葡萄糖葡萄糖
水水水 1000ml1000ml1000ml
调调调 ，在拟分装的试管内加入明胶，在拟分装的试管内加入明胶，在拟分装的试管内加入明胶
养基分装其中养基分装其中养基分装其中 5ml/5ml/5ml/管。管。管。115℃115℃115℃灭菌灭菌灭菌 151515 分钟。分钟。分钟。
硫化氢试验培养基硫化氢试验培养基硫化氢试验培养基
胰胨胰胨胰胨 10gNaC15g10gNaC15g10gNaC15g
酵母提取物酵母提取物酵母提取物 5g5g5g 肉浸膏肉浸膏肉浸膏 3g3g3g
葡萄糖葡萄糖葡萄糖 2g2g2g 蒸馏水蒸馏水蒸馏水 1000ml1000ml1000ml
半胱氨酸半胱氨酸半胱氨酸
调调调 ———，分装试管。，分装试管。，分装试管。115℃115℃115℃灭菌灭菌灭菌 202020 分钟分钟分钟
主要仪器主要仪器主要仪器
DHG-9075ADHG-9075ADHG-9075A 型电热恒温鼓风干燥箱型电热恒温鼓风干燥箱型电热恒温鼓风干燥箱
PYX-DHS-40×50PYX-DHS-40×50PYX-DHS-40×50 型隔水式电热恒温培养箱型隔水式电热恒温培养箱型隔水式电热恒温培养箱
XS2-3GXS2-3GXS2-3G 型双目显微镜型双目显微镜型双目显微镜
SW-CJ-IFDSW-CJ-IFDSW-CJ-IFD 型无菌工作台型无菌工作台型无菌工作台
中意电冰箱中意电冰箱中意电冰箱
HVE-50HVE-50HVE-50 自动高压灭菌锅自动高压灭菌锅自动高压灭菌锅
试验方法试验方法试验方法
主要操作流程主要操作流程主要操作流程
菌种的纯化菌种的纯化菌种的纯化→→→菌种的鉴定菌种的鉴定菌种的鉴定→→→菌种的保存菌种的保存菌种的保存
菌种的纯化菌种的纯化菌种的纯化
具体操作为，用接种环在无菌操作的条件下，沾取分离菌样品在具体操作为，用接种环在无菌操作的条件下，沾取分离菌样品在具体操作为，用接种环在无菌操作的条件下，沾取分离菌样品在 MRSMRSMRS 分离分离分离
培养基上划线分离，然后将其放置在培养基上划线分离，然后将其放置在培养基上划线分离，然后将其放置在 37℃37℃37℃恒温培养箱内培养恒温培养箱内培养恒温培养箱内培养 24~2824~2824~28 小时。挑取小时。挑取小时。挑取
单个疑似菌落，做革兰氏染色，镜检。对有代表性的菌落继续进行接种到单个疑似菌落，做革兰氏染色，镜检。对有代表性的菌落继续进行接种到单个疑似菌落，做革兰氏染色，镜检。对有代表性的菌落继续进行接种到 MRSMRSMRS
分离培养基平板上，再培养，镜检，反复如此，直到菌落大小、颜色一致，最分离培养基平板上，再培养，镜检，反复如此，直到菌落大小、颜色一致，最分离培养基平板上，再培养，镜检，反复如此，直到菌落大小、颜色一致，最
后在后在后在 MRSMRSMRS 琼脂培养基斜面上保存备用。琼脂培养基斜面上保存备用。琼脂培养基斜面上保存备用。
革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色
制片（涂菌、干燥、固定）制片（涂菌、干燥、固定）制片（涂菌、干燥、固定）→→→初梁（滴加结晶紫染液，初梁（滴加结晶紫染液，初梁（滴加结晶紫染液，111 分钟后水洗）分钟后水洗）分钟后水洗）→→→媒媒媒
染（滴加卢戈氏碘酒液，染（滴加卢戈氏碘酒液，染（滴加卢戈氏碘酒液，111 分钟后水洗）分钟后水洗）分钟后水洗）→→→脱色（滴加脱色（滴加脱色（滴加 95%95%95%乙醇脱色，直到玻片乙醇脱色，直到玻片乙醇脱色，直到玻片
上紫色不再被洗脱为止）上紫色不再被洗脱为止）上紫色不再被洗脱为止）→→→复染（滴加番红染液复染（滴加番红染液复染（滴加番红染液 222 分钟，水洗）分钟，水洗）分钟，水洗）→→→干燥干燥干燥→→→镜检镜检镜检
革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。
菌种的鉴定试验菌种的鉴定试验菌种的鉴定试验[2,5][2,5][2,5]
糖发酵试验糖发酵试验糖发酵试验
以幼龄斜面培养物穿刺接种于糖发酵试验培养基上，以幼龄斜面培养物穿刺接种于糖发酵试验培养基上，以幼龄斜面培养物穿刺接种于糖发酵试验培养基上，37℃37℃37℃温箱培养温箱培养温箱培养
111、、、333、、、555 天后观察，如培养基内指示剂变色表示产酸为阳性，不变或变蓝（昆）天后观察，如培养基内指示剂变色表示产酸为阳性，不变或变蓝（昆）天后观察，如培养基内指示剂变色表示产酸为阳性，不变或变蓝（昆）
则为阴性。则为阴性。则为阴性。
吲哚试验吲哚试验吲哚试验
把新鲜的菌种于吲哚试验培养基上，适温培养。用培养把新鲜的菌种于吲哚试验培养基上，适温培养。用培养把新鲜的菌种于吲哚试验培养基上，适温培养。用培养 111、、、222、、、444、、、777 天的培天的培天的培
养液沿管壁缓缓加入养液沿管壁缓缓加入养液沿管壁缓缓加入 333———5mm5mm5mm 高的试剂（对二甲基氨基苯甲醛高的试剂（对二甲基氨基苯甲醛高的试剂（对二甲基氨基苯甲醛 8g8g8g，，，95%95%95%乙醇乙醇乙醇
760ml760ml760ml，浓盐酸，浓盐酸，浓盐酸 160ml160ml160ml）于培养液表面。若在液面层发生红色，即为阳性反应；）于培养液表面。若在液面层发生红色，即为阳性反应；）于培养液表面。若在液面层发生红色，即为阳性反应；
若颜色反应不明显，可加若颜色反应不明显，可加若颜色反应不明显，可加 444———555 滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，滴乙醚至培养液，摇动，使乙醚分散于液体中，
将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。如培养液有吲哚时，吲将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。如培养液有吲哚时，吲将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。如培养液有吲哚时，吲
哚可被提取在乙醚中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。哚可被提取在乙醚中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。哚可被提取在乙醚中，浓缩的吲哚和试剂反应，则颜色明显。
明胶液化试验明胶液化试验明胶液化试验
取取取 242424———484848 小时生长的斜面培养物穿刺接种于明胶液化试验培养基上。于适小时生长的斜面培养物穿刺接种于明胶液化试验培养基上。于适小时生长的斜面培养物穿刺接种于明胶液化试验培养基上。于适
温培养温培养温培养 222、、、777、、、141414 和和和 303030 天。在培养时需有两支未接种的试管培养基作对照。将天。在培养时需有两支未接种的试管培养基作对照。将天。在培养时需有两支未接种的试管培养基作对照。将
已接种培养和未接种的对照试管置于冰箱或冷水中，待对照管凝固，观察已接已接种培养和未接种的对照试管置于冰箱或冷水中，待对照管凝固，观察已接已接种培养和未接种的对照试管置于冰箱或冷水中，待对照管凝固，观察已接
种的试管中菌体的生长情况和明胶是否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且种的试管中菌体的生长情况和明胶是否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且种的试管中菌体的生长情况和明胶是否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且
为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如明胶部分或全部在室温下为可流动的液为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如明胶部分或全部在室温下为可流动的液为稳定的凝块，则为明胶水解阴性；如明胶部分或全部在室温下为可流动的液
体，则为明胶水解阳性。如菌已生长、明胶未液化，但明较表面菌苔出现凹陷体，则为明胶水解阳性。如菌已生长、明胶未液化，但明较表面菌苔出现凹陷体，则为明胶水解阳性。如菌已生长、明胶未液化，但明较表面菌苔出现凹陷
小窝也是轻度水解，按阳性记录。小窝也是轻度水解，按阳性记录。小窝也是轻度水解，按阳性记录。
硫化氢试验硫化氢试验硫化氢试验
取取取 242424———484848 小时培养的斜面培养接种于硫化氢试验的培养基。接种后，用无小时培养的斜面培养接种于硫化氢试验的培养基。接种后，用无小时培养的斜面培养接种于硫化氢试验的培养基。接种后，用无
镊子夹取镊子夹取镊子夹取——————乙酸铅纸条（已灭菌）悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而乙酸铅纸条（已灭菌）悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而乙酸铅纸条（已灭菌）悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而
不接触液面，上端用硅胶塞寒紧，试验中设空白对照，在未接种的试管培养基不接触液面，上端用硅胶塞寒紧，试验中设空白对照，在未接种的试管培养基不接触液面，上端用硅胶塞寒紧，试验中设空白对照，在未接种的试管培养基
上悬挂乙酸铅纸条。适温培养。于接种后上悬挂乙酸铅纸条。适温培养。于接种后上悬挂乙酸铅纸条。适温培养。于接种后 333、、、777、、、141414 天观察。纸条变黑为阳性反天观察。纸条变黑为阳性反天观察。纸条变黑为阳性反
应。应。应。
过氧化酶试验过氧化酶试验过氧化酶试验
将将将 242424———484848 小时培养的斜面培养物，以铂丝拉种环取一小环涂抹于已滴有小时培养的斜面培养物，以铂丝拉种环取一小环涂抹于已滴有小时培养的斜面培养物，以铂丝拉种环取一小环涂抹于已滴有 3%3%3%
过氧化氢的玻片上，如有空泡产生，则为阳性，无气泡为阴性。过氧化氢的玻片上，如有空泡产生，则为阳性，无气泡为阴性。过氧化氢的玻片上，如有空泡产生，则为阳性，无气泡为阴性。
其他生物学特性研究其他生物学特性研究其他生物学特性研究
乳酸菌的其他生物学特性研究包括菌落形态的观察，菌体形态的观察。乳酸菌的其他生物学特性研究包括菌落形态的观察，菌体形态的观察。乳酸菌的其他生物学特性研究包括菌落形态的观察，菌体形态的观察。
需氧试验是将分离纯化后的各菌种分别接入高层液体培养基内，需氧试验是将分离纯化后的各菌种分别接入高层液体培养基内，需氧试验是将分离纯化后的各菌种分别接入高层液体培养基内，37℃37℃37℃静置静置静置
培养培养培养 242424 小时后，观察生长情况。接种管经培养后，凡液体清亮，管底大量菌体小时后，观察生长情况。接种管经培养后，凡液体清亮，管底大量菌体小时后，观察生长情况。接种管经培养后，凡液体清亮，管底大量菌体
沉淀（有时管壁点状絮凝）为厌氧菌；凡淮面上层清亮（约沉淀（有时管壁点状絮凝）为厌氧菌；凡淮面上层清亮（约沉淀（有时管壁点状絮凝）为厌氧菌；凡淮面上层清亮（约 1cm1cm1cm））），下层混浊，，下层混浊，，下层混浊，
管底大量沉淀为微好氧菌；液体均匀混浊为兼性厌氧菌；液体清亮，液面有菌管底大量沉淀为微好氧菌；液体均匀混浊为兼性厌氧菌；液体清亮，液面有菌管底大量沉淀为微好氧菌；液体均匀混浊为兼性厌氧菌；液体清亮，液面有菌
膜、菌环的为好氧菌。膜、菌环的为好氧菌。膜、菌环的为好氧菌。
333 结果与分析结果与分析结果与分析
分离乳酸菌菌株的鉴定分离乳酸菌菌株的鉴定分离乳酸菌菌株的鉴定
从腌制的剁辣椒中分离，纯化，得到从腌制的剁辣椒中分离，纯化，得到从腌制的剁辣椒中分离，纯化，得到 555 个疑似菌株。根据表型特征鉴定方个疑似菌株。根据表型特征鉴定方个疑似菌株。根据表型特征鉴定方
法从形态和生理生化特征两个方面鉴定这法从形态和生理生化特征两个方面鉴定这法从形态和生理生化特征两个方面鉴定这 555 株菌。株菌。株菌。
其中形态特征包括群体形态特征和个体形态特征。群体形态特征包括菌落其中形态特征包括群体形态特征和个体形态特征。群体形态特征包括菌落其中形态特征包括群体形态特征和个体形态特征。群体形态特征包括菌落
形态、大小、表面、隆起程度、透明度以及色泽，以液体培养基中的特征（生形态、大小、表面、隆起程度、透明度以及色泽，以液体培养基中的特征（生形态、大小、表面、隆起程度、透明度以及色泽，以液体培养基中的特征（生
长量、生长形态、混浊度、表面生长状态、沉淀物、气味和颜色等）长量、生长形态、混浊度、表面生长状态、沉淀物、气味和颜色等）长量、生长形态、混浊度、表面生长状态、沉淀物、气味和颜色等）。个体形态。个体形态。个体形态
特征主要有染色反应（革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等）特征主要有染色反应（革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等）特征主要有染色反应（革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等）、细胸形态大小和、细胸形态大小和、细胸形态大小和
排列方式、运动性等等。排列方式、运动性等等。排列方式、运动性等等。
对于乳酸菌来说生理生化特征检测主要有过氧化氢酶试验、明胶液化试对于乳酸菌来说生理生化特征检测主要有过氧化氢酶试验、明胶液化试对于乳酸菌来说生理生化特征检测主要有过氧化氢酶试验、明胶液化试
验、糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验和从葡萄糖产酸产气试验等。验、糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验和从葡萄糖产酸产气试验等。验、糖发酵试验、吲哚试验、硫化氢试验和从葡萄糖产酸产气试验等。
表表表 分离得到的分离得到的分离得到的 555 种菌的形态特征种菌的形态特征种菌的形态特征
菌菌菌,,L1,L2,L3,L4,L5,,L1,L2,L3,L4,L5,,L1,L2,L3,L4,L5
落形态落形态落形态,,,透明度透明度透明度
颜色颜色颜色
形态形态形态
隆起庆隆起庆隆起庆
菌落大小菌落大小菌落大小
革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色
芽孢芽孢芽孢,,,不透明不透明不透明
灰白灰白灰白
豆形豆形豆形
隆起隆起隆起
大大大
阳阳阳
无无无,,,不透明不透明不透明
黄白黄白黄白
杆形杆形杆形
隆起隆起隆起
小小小
阳阳阳
无无无,,,不透明不透明不透明
白色白色白色
短杆状短杆状短杆状
不隆起不隆起不隆起
小小小
阳阳阳
无无无,,,不透明不透明不透明
黄白黄白黄白
豆形豆形豆形
隆起隆起隆起
大大大
阳阳阳
无无无,,,不透明不透明不透明
白色白色白色
杆形杆形杆形
不隆起不隆起不隆起
小小小
阳阳阳
有有有
表表表 分离得到的分离得到的分离得到的 555 株菌生理生化实验结果株菌生理生化实验结果株菌生理生化实验结果
菌菌菌,,L1,L2,L3,L4,L5,,L1,L2,L3,L4,L5,,L1,L2,L3,L4,L5
生化试验生化试验生化试验
糖发酵试验糖发酵试验糖发酵试验,,,明胶液化明胶液化明胶液化
吲哚试验吲哚试验吲哚试验
硫化氢试验硫化氢试验硫化氢试验
过氧化氢试验过氧化氢试验过氧化氢试验
葡萄糖产酸试验葡萄糖产酸试验葡萄糖产酸试验
葡萄糖产气试验葡萄糖产气试验葡萄糖产气试验
葡萄糖葡萄糖葡萄糖
半乳糖半乳糖半乳糖
乳糖乳糖乳糖
甘露糖甘露糖甘露糖
山梨醇山梨醇山梨醇
D-D-D-木糖木糖木糖
海藻糖海藻糖海藻糖
树胶醛糖树胶醛糖树胶醛糖,,,－－－
－－－
－－－
－－－
+++
－－－
+++
－－－
－－－
－－－
－－－
－－－
－－－
－－－,,,－－－
－－－
－－－
－－－
+++
－－－
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+,+,+,－－－
－－－
－－－
－－－
+++
+++
+++
+++
+++
－－－
－－－
－－－
+++
+,+,+,－－－
－－－
+++
+++
+++
－－－
+++
－－－
+++
+++
+++
+++
+++
－－－,,,－－－
－－－
－－－
－－－
+++
+++
+++
+++
+++
－－－
－－－
－－－
－－－
－－－
注：注：注：“+”“+”“+”表示试验结果阳性；表示试验结果阳性；表示试验结果阳性；“““－－－”””表示试验结果阴性。表示试验结果阴性。表示试验结果阴性。
由表由表由表 和表和表和表 所示表型特征结合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》所示表型特征结合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》所示表型特征结合《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、、、
《常见细菌系统鉴定手同》《常见细菌系统鉴定手同》《常见细菌系统鉴定手同》、、、《伯杰细菌鉴定手册》等参考文献进行结果分析，《伯杰细菌鉴定手册》等参考文献进行结果分析，《伯杰细菌鉴定手册》等参考文献进行结果分析，
进一步确定：进一步确定：进一步确定：L1L1L1 为膜明串珠菌；为膜明串珠菌；为膜明串珠菌；L2L2L2 为乳酸杆菌；为乳酸杆菌；为乳酸杆菌；L3L3L3 为短乳酸杆菌；为短乳酸杆菌；为短乳酸杆菌；L4L4L4 为乳球为乳球为乳球
菌；菌；菌；L5L5L5 为芽孢杆菌。为芽孢杆菌。为芽孢杆菌。
经实验，发现芽孢杆菌发酵能力很弱，因此淘汰放弃这个菌种。经实验，发现芽孢杆菌发酵能力很弱，因此淘汰放弃这个菌种。经实验，发现芽孢杆菌发酵能力很弱，因此淘汰放弃这个菌种。
菌种保藏（液体石蜡保藏法）菌种保藏（液体石蜡保藏法）菌种保藏（液体石蜡保藏法）
液体石蜡灭菌液体石蜡灭菌液体石蜡灭菌
将液体石置于将液体石置于将液体石置于 250ml250ml250ml 的锥形瓶中，每瓶装的锥形瓶中，每瓶装的锥形瓶中，每瓶装 100ml100ml100ml，塞上棉塞，外包牛皮纸、，塞上棉塞，外包牛皮纸、，塞上棉塞，外包牛皮纸、
高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌， 灭菌灭菌灭菌 30mm30mm30mm，灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于，灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于，灭菌后将装有液体石蜡锥形瓶置于 105105105———
110℃110℃110℃的烘箱内约的烘箱内约的烘箱内约 1h1h1h，以除去液体石蜡的水分。，以除去液体石蜡的水分。，以除去液体石蜡的水分。
接种接种接种
将菌种接种至适宜的斜面培养基上。将菌种接种至适宜的斜面培养基上。将菌种接种至适宜的斜面培养基上。
培养培养培养
在适宜温度条件下培养，使其充分生长。在适宜温度条件下培养，使其充分生长。在适宜温度条件下培养，使其充分生长。
为液体石蜡为液体石蜡为液体石蜡
用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入到已长好菌的斜面上，液体石蜡
的用量以高出斜面顶端的用量以高出斜面顶端的用量以高出斜面顶端 1cm1cm1cm 左右为准，使菌种与空气隔绝。左右为准，使菌种与空气隔绝。左右为准，使菌种与空气隔绝。
保藏保藏保藏
将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于将已注入液体石蜡的斜面培养物直立，置于 444———5℃5℃5℃冰箱或室温下保存。冰箱或室温下保存。冰箱或室温下保存。
转接转接转接
到保藏期后，需将菌种转换至新的斜面培养基上，培养后再加入到保藏期后，需将菌种转换至新的斜面培养基上，培养后再加入到保藏期后，需将菌种转换至新的斜面培养基上，培养后再加入
适量灭菌液体石蜡，再保藏。适量灭菌液体石蜡，再保藏。适量灭菌液体石蜡，再保藏。
结论：结论：结论：
在剁辣椒腌制过程中，至少有在剁辣椒腌制过程中，至少有在剁辣椒腌制过程中，至少有 444 种菌参与了微生物发酵过程，此种菌参与了微生物发酵过程，此种菌参与了微生物发酵过程，此 444 种菌为种菌为种菌为
肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、乳球菌和短乳杆菌。其，肠膜明串珠菌首先启动肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、乳球菌和短乳杆菌。其，肠膜明串珠菌首先启动肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、乳球菌和短乳杆菌。其，肠膜明串珠菌首先启动
乳酸发酵并成为前期的优势菌；植物乳杆菌出现在发酵的中后期；短乳杆菌出乳酸发酵并成为前期的优势菌；植物乳杆菌出现在发酵的中后期；短乳杆菌出乳酸发酵并成为前期的优势菌；植物乳杆菌出现在发酵的中后期；短乳杆菌出
现在发酵后期和成熟期；乳球菌则出现在各个时期。现在发酵后期和成熟期；乳球菌则出现在各个时期。现在发酵后期和成熟期；乳球菌则出现在各个时期。
在这在这在这 444 种菌中，短乳杆菌的生长活力较其他种菌中，短乳杆菌的生长活力较其他种菌中，短乳杆菌的生长活力较其他 333 种菌要强很多；产酸能力量种菌要强很多；产酸能力量种菌要强很多；产酸能力量
最强的是植物乳杆菌。最强的是植物乳杆菌。最强的是植物乳杆菌。
因此，我们可以考虑选择短乳杆菌和植物乳杆菌按照适宜的菌种配比做剁因此，我们可以考虑选择短乳杆菌和植物乳杆菌按照适宜的菌种配比做剁因此，我们可以考虑选择短乳杆菌和植物乳杆菌按照适宜的菌种配比做剁
辣椒腌制的发酵剂选择试验，用以提高发酵过程中产酸速度，缩短诱导期，减辣椒腌制的发酵剂选择试验，用以提高发酵过程中产酸速度，缩短诱导期，减辣椒腌制的发酵剂选择试验，用以提高发酵过程中产酸速度，缩短诱导期，减
少被杂菌污染的几率，降低发酵失败的风险；同时，提高产品风味，获得感观少被杂菌污染的几率，降低发酵失败的风险；同时，提高产品风味，获得感观少被杂菌污染的几率，降低发酵失败的风险；同时，提高产品风味，获得感观
效应和营养价值都高的剁辣椒产品。效应和营养价值都高的剁辣椒产品。效应和营养价值都高的剁辣椒产品。
当今世界食品发展的潮流是保健食品，即不仅具有较好的色、香、味，而当今世界食品发展的潮流是保健食品，即不仅具有较好的色、香、味，而当今世界食品发展的潮流是保健食品，即不仅具有较好的色、香、味，而
且还具有调节人体生理功能的作用。就乳配菌发酵食品的特点来看，乳酸菌发且还具有调节人体生理功能的作用。就乳配菌发酵食品的特点来看，乳酸菌发且还具有调节人体生理功能的作用。就乳配菌发酵食品的特点来看，乳酸菌发
酵食品属于营养保健食品。但在乳酸菌发酵食品的功能和机理的研究上，我国酵食品属于营养保健食品。但在乳酸菌发酵食品的功能和机理的研究上，我国酵食品属于营养保健食品。但在乳酸菌发酵食品的功能和机理的研究上，我国
的水平与一些发达国家还有一定的距离。对于工业化生产还达不到理想的水的水平与一些发达国家还有一定的距离。对于工业化生产还达不到理想的水的水平与一些发达国家还有一定的距离。对于工业化生产还达不到理想的水
平。平。平。
自自自 202020 世纪初俄国科学家梅契尼柯夫提出乳酸菌可防止人体衰老的学说以世纪初俄国科学家梅契尼柯夫提出乳酸菌可防止人体衰老的学说以世纪初俄国科学家梅契尼柯夫提出乳酸菌可防止人体衰老的学说以
来，各国科学家对乳酸菌的特殊生理作用以及在食品中的应用进行了深入广泛来，各国科学家对乳酸菌的特殊生理作用以及在食品中的应用进行了深入广泛来，各国科学家对乳酸菌的特殊生理作用以及在食品中的应用进行了深入广泛
的研究。乳酸菌是一类对人体健康具人特殊作用的菌群，采用乳酸发酵的食的研究。乳酸菌是一类对人体健康具人特殊作用的菌群，采用乳酸发酵的食的研究。乳酸菌是一类对人体健康具人特殊作用的菌群，采用乳酸发酵的食
品，除了能产生大量对人体有益的乳酸菌外，还能产酸以及醛、醇、酯、烃类品，除了能产生大量对人体有益的乳酸菌外，还能产酸以及醛、醇、酯、烃类品，除了能产生大量对人体有益的乳酸菌外，还能产酸以及醛、醇、酯、烃类
低分子物质，赋予发酵食品特殊的风味。低分子物质，赋予发酵食品特殊的风味。低分子物质，赋予发酵食品特殊的风味。
乳酸菌发酵剂起源于乳品行业，在乳酸菌发酵剂起源于乳品行业，在乳酸菌发酵剂起源于乳品行业，在 202020 世纪世纪世纪 606060 年代，欧洲的年代，欧洲的年代，欧洲的
和和和 就率先将纯菌接种发酵技术应用于泡菜研究。而后就率先将纯菌接种发酵技术应用于泡菜研究。而后就率先将纯菌接种发酵技术应用于泡菜研究。而后
CaldwellBiofermentationCanadaCaldwellBiofermentationCanadaCaldwellBiofermentationCanada 公司在蔬菜发酵领域处于领先地位，并于公司在蔬菜发酵领域处于领先地位，并于公司在蔬菜发酵领域处于领先地位，并于
199819981998 年获得了复合菌种接种的蔬菜发酵专利技术年获得了复合菌种接种的蔬菜发酵专利技术年获得了复合菌种接种的蔬菜发酵专利技术[12[12[12，，，13]13]13]。与传统的自然发酵。与传统的自然发酵。与传统的自然发酵
方式相比，接种发酵很多优点，这是因为传统的自然发酵方式不可避免的受许方式相比，接种发酵很多优点，这是因为传统的自然发酵方式不可避免的受许方式相比，接种发酵很多优点，这是因为传统的自然发酵方式不可避免的受许
多条件制约，如生产季节、食盐用量、操作卫生条件等，在生产过程中若稍有多条件制约，如生产季节、食盐用量、操作卫生条件等，在生产过程中若稍有多条件制约，如生产季节、食盐用量、操作卫生条件等，在生产过程中若稍有
不慎，极易污染菌而导致发酵不良或发酵失败；而且采用自然发酵还存在着发不慎，极易污染菌而导致发酵不良或发酵失败；而且采用自然发酵还存在着发不慎，极易污染菌而导致发酵不良或发酵失败；而且采用自然发酵还存在着发
酵周期长，发酵质量不稳定以有不利于工厂化，规模化及标准化生产等诸多弊酵周期长，发酵质量不稳定以有不利于工厂化，规模化及标准化生产等诸多弊酵周期长，发酵质量不稳定以有不利于工厂化，规模化及标准化生产等诸多弊
端。采用纯接种发酵剂配比，从而大大的缩短发酵时间，减少发酵失败风险，端。采用纯接种发酵剂配比，从而大大的缩短发酵时间，减少发酵失败风险，端。采用纯接种发酵剂配比，从而大大的缩短发酵时间，减少发酵失败风险，
掏杂菌生长，提高产品质量，获得感观特征和营养品质一致的产品。筛选菌种掏杂菌生长，提高产品质量，获得感观特征和营养品质一致的产品。筛选菌种掏杂菌生长，提高产品质量，获得感观特征和营养品质一致的产品。筛选菌种
时应遵循：性状稳定，生长繁殖迅速，在蔬菜发酵环境中具有较强的生存竞争时应遵循：性状稳定，生长繁殖迅速，在蔬菜发酵环境中具有较强的生存竞争时应遵循：性状稳定，生长繁殖迅速，在蔬菜发酵环境中具有较强的生存竞争
能力，易保存且存活期长，产酸缓和，产香性强，对亚硝酸盐的降解能力强，能力，易保存且存活期长，产酸缓和，产香性强，对亚硝酸盐的降解能力强，能力，易保存且存活期长，产酸缓和，产香性强，对亚硝酸盐的降解能力强，
且不产生生物胺等有害物质等等。且不产生生物胺等有害物质等等。且不产生生物胺等有害物质等等。
我国的蔬菜产业还有巨大的发展空间，尤其是蔬菜的产后加工方面。作为我国的蔬菜产业还有巨大的发展空间，尤其是蔬菜的产后加工方面。作为我国的蔬菜产业还有巨大的发展空间，尤其是蔬菜的产后加工方面。作为
蔬菜加工的一条重要途径蔬菜加工的一条重要途径蔬菜加工的一条重要途径——————蔬菜腌制当然也具有巨大的发展空间。但是要把蔬菜腌制当然也具有巨大的发展空间。但是要把蔬菜腌制当然也具有巨大的发展空间。但是要把
蔬菜产业的资源优势转变为竞争优势需要一人过程，要把我国的发酵蔬菜产业蔬菜产业的资源优势转变为竞争优势需要一人过程，要把我国的发酵蔬菜产业蔬菜产业的资源优势转变为竞争优势需要一人过程，要把我国的发酵蔬菜产业
做大做强需要我们做出更多方面的努力，其中很关键的一条就是深入研究发酵做大做强需要我们做出更多方面的努力，其中很关键的一条就是深入研究发酵做大做强需要我们做出更多方面的努力，其中很关键的一条就是深入研究发酵
蔬菜的生产工艺。在提高我省特色产业之一蔬菜的生产工艺。在提高我省特色产业之一蔬菜的生产工艺。在提高我省特色产业之一———剁辣椒产业方面，我们更需要付剁辣椒产业方面，我们更需要付剁辣椒产业方面，我们更需要付
出努力，进一步研究影响剁辣椒发酵过程的各种乳酸菌及其发酵特性，选择优出努力，进一步研究影响剁辣椒发酵过程的各种乳酸菌及其发酵特性，选择优出努力，进一步研究影响剁辣椒发酵过程的各种乳酸菌及其发酵特性，选择优
良菌种或利用基因工程等技术得到发酵性能强的特殊菌种进行接种发酵研究。良菌种或利用基因工程等技术得到发酵性能强的特殊菌种进行接种发酵研究。良菌种或利用基因工程等技术得到发酵性能强的特殊菌种进行接种发酵研究。
参考文献：参考文献：参考文献：
[1][1][1]罗晓妙罗晓妙罗晓妙...控制酶解和发酵提高榨菜品质的研究控制酶解和发酵提高榨菜品质的研究控制酶解和发酵提高榨菜品质的研究[D].[D].[D].重庆：西南农业大学重庆：西南农业大学重庆：西南农业大学,,,
.
[2][2][2]凌代文凌代文凌代文,,,东秀珠东秀珠东秀珠...乳酸菌分类鉴定及实验方法乳酸菌分类鉴定及实验方法乳酸菌分类鉴定及实验方法[M].[M].[M].北京北京北京:::中国轻工业出版中国轻工业出版中国轻工业出版
社社社,1996:6-16,27-54,84-129.,1996:6-16,27-54,84-129.,1996:6-16,27-54,84-129.
[3][3][3]江汉湖江汉湖江汉湖...食品微生物学食品微生物学食品微生物学[M].[M].[M].北京北京北京:::中国农业出版社中国农业出版社中国农业出版社,2002:123-131.,2002:123-131.,2002:123-131.
[4][4][4]杨洁彬杨洁彬杨洁彬,,,凌代文凌代文凌代文...乳酸菌乳酸菌乳酸菌——————生物学基础及应用生物学基础及应用生物学基础及应用[M].[M].[M].北京北京北京:::中国轻工业出中国轻工业出中国轻工业出
版社版社版社,1996:96-101.,1996:96-101.,1996:96-101.
[5][5][5]东秀珠东秀珠东秀珠,,,蔡妙英蔡妙英蔡妙英...常见细菌系统鉴定手册常见细菌系统鉴定手册常见细菌系统鉴定手册[M].[M].[M].北京北京北京:::科学出版社科学出版社科学出版社,2001:77-,2001:77-,2001:77-
82,,,192-193.
[6][6][6]尹利端尹利端尹利端...几种泡菜的安全性研究与优良乳酸菌的分离鉴定几种泡菜的安全性研究与优良乳酸菌的分离鉴定几种泡菜的安全性研究与优良乳酸菌的分离鉴定[D].[D].[D].北京北京北京:::中国中国中国
农业大学农业大学农业大学,2005.,2005.,2005.
[7][7][7]沈萍沈萍沈萍...微生物学实验微生物学实验微生物学实验[M].[M].[M].北京北京北京:::高等教育出版社高等教育出版社高等教育出版社,1999:28-31.,1999:28-31.,1999:28-31.
[8][8][8]蔡信之蔡信之蔡信之,,,黄军红黄军红黄军红...微生物学微生物学微生物学(((第二版第二版第二版)[M].)[M].)[M].北京教育出版社北京教育出版社北京教育出版社,2002:189-230.,2002:189-230.,2002:189-230.
[9][9][9]张一凡张一凡张一凡,,,冉陆冉陆冉陆...乳酸菌检测方法乳酸菌检测方法乳酸菌检测方法[J].[J].[J].北京北京北京:::中国食品卫生杂志中国食品卫生杂志中国食品卫生杂志,,,
2002,29:,29:,29:11-13.
[10].[10].[10].布坎南布坎南布坎南...伯杰细菌鉴定手册伯杰细菌鉴定手册伯杰细菌鉴定手册(((第八册第八册第八册)[M].)[M].)[M].北京北京北京:::科学出版社科学出版社科学出版社,,,
1984:376-380,391-402,702-709,:376-380,391-402,702-709,:376-380,391-402,702-709,797-812.
[11][11][11]严维凌严维凌严维凌,,,赵琦赵琦赵琦,,,谢志镭谢志镭谢志镭...发酵条件对乳酸菌发酵蔬菜汁产品指标的影响发酵条件对乳酸菌发酵蔬菜汁产品指标的影响发酵条件对乳酸菌发酵蔬菜汁产品指标的影响[R].[R].[R].
上海上海上海:::上海市食品研究所上海市食品研究所上海市食品研究所,2001.,2001.,2001.
[12][12][12]陈仲翔陈仲翔陈仲翔,,,董英董英董英...泡菜工业化生产的研究进展泡菜工业化生产的研究进展泡菜工业化生产的研究进展[J].[J].[J].食品科技食品科技食品科技,2004,4:3-35.,2004,4:3-35.,2004,4:3-35.
[13][13][13]杨春哲杨春哲杨春哲,,,冉红颜冉红颜冉红颜...乳酸菌在泡菜生产中的应用乳酸菌在泡菜生产中的应用乳酸菌在泡菜生产中的应用[J].[J].[J].食品工业食品工业食品工业,2003,1:6-8.,2003,1:6-8.,2003,1:6-8.
[14][14][14] 斯克尔曼斯克尔曼斯克尔曼...细菌属的鉴定指导细菌属的鉴定指导细菌属的鉴定指导[M].[M].[M].北京北京北京:::科学出版社科学出版社科学出版社,1978:301-,1978:301-,1978:301-
.
[15][15][15]郭本恒郭本恒郭本恒...益生菌益生菌益生菌[M].[M].[M].北京北京北京:::化学工业出版社化学工业出版社化学工业出版社,2004:48-49.,2004:48-49.,2004:48-49.
[16],[16],[16],
forlacticacidfermentationifcarrot,cabbage,beetandonionvegetablemixturforlacticacidfermentationifcarrot,cabbage,beetandonionvegetablemixturforlacticacidfermentationifcarrot,cabbage,beetandonionvegetablemixtur
e[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2001,64:[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2001,64:[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2001,64:261-275.
[17],[17],[17],
edriaisolatedformspontaneousfermentationof‘Almagro’eggplants[J].Intedriaisolatedformspontaneousfermentationof‘Almagro’eggplants[J].Intedriaisolatedformspontaneousfermentationof‘Almagro’eggplants[J].Int
ernationalJoumalofFoodMicrobiology,2000,59:,2000,59:,2000,59:9-17.
[18][18][18]畅天狮畅天狮畅天狮,,,刘俊果刘俊果刘俊果,,,张桂张桂张桂...基因工程改良乳酸菌发酵剂品质的研究进展基因工程改良乳酸菌发酵剂品质的研究进展基因工程改良乳酸菌发酵剂品质的研究进展[J].[J].[J].
北京北京北京:::中国乳品工业中国乳品工业中国乳品工业,2003,5:34-37.,2003,5:34-37.,2003,5:34-37.
致谢致谢致谢
本论文是在谢伟岸老师的悉心指导下完成的，在完成论文期间，谢伟岸老本论文是在谢伟岸老师的悉心指导下完成的，在完成论文期间，谢伟岸老本论文是在谢伟岸老师的悉心指导下完成的，在完成论文期间，谢伟岸老
师严谨的治学态度和诲人不倦的敬业精神让我们受益匪浅，他渊博的知识让我师严谨的治学态度和诲人不倦的敬业精神让我们受益匪浅，他渊博的知识让我师严谨的治学态度和诲人不倦的敬业精神让我们受益匪浅，他渊博的知识让我
们肃然起敬，同时他也教会了我们如何独立学习思考，让我们受用终生。在们肃然起敬，同时他也教会了我们如何独立学习思考，让我们受用终生。在们肃然起敬，同时他也教会了我们如何独立学习思考，让我们受用终生。在
此，谨致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！此，谨致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！此，谨致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！
茶陵光曲线
-5
0
5
10
15
20
25
30
0 50 100 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
PARi
P
H
O
T
O
茶陵野生稻与栽培稻光合生理比较茶陵野生稻与栽培稻光合生理比较茶陵野生稻与栽培稻光合生理比较
生命科学学院生命科学学院生命科学学院
学生姓名：于峰袁鸣孺田望专业：生物技术班级：学生姓名：于峰袁鸣孺田望专业：生物技术班级：学生姓名：于峰袁鸣孺田望专业：生物技术班级：030303
指导老师：徐孟亮研究员指导老师：徐孟亮研究员指导老师：徐孟亮研究员
实验主要设备、材料实验主要设备、材料实验主要设备、材料：：：
LI-6400LI-6400LI-6400 光合系统测定仪，干燥剂，光合系统测定仪，干燥剂，光合系统测定仪，干燥剂，COCOCO222 钢瓶，茶陵普通野生稻钢瓶，茶陵普通野生稻钢瓶，茶陵普通野生稻 931193119311 日本晴两优培九。日本晴两优培九。日本晴两优培九。
实验目的：实验目的：实验目的：
本实验可以学会使用本实验可以学会使用本实验可以学会使用 LI-6400LI-6400LI-6400 光合系统测定仪。光合系统测定仪。光合系统测定仪。LI-6400LI-6400LI-6400 光合系统测定仪功能强大，可光合系统测定仪功能强大，可光合系统测定仪功能强大，可
以测定很多光合生理指标，如：净光合速率，气孔导度，胞间二氧化碳浓度，蒸腾速率以测定很多光合生理指标，如：净光合速率，气孔导度，胞间二氧化碳浓度，蒸腾速率以测定很多光合生理指标，如：净光合速率，气孔导度，胞间二氧化碳浓度，蒸腾速率
等。还可以做一系列曲线，如：光强等。还可以做一系列曲线，如：光强等。还可以做一系列曲线，如：光强---光曲线，二氧化碳光曲线，二氧化碳光曲线，二氧化碳---光曲线，温度光曲线，温度光曲线，温度---光曲线等。其次，光曲线等。其次，光曲线等。其次，
通过光合特性的研究，可以对茶陵野生稻有一个初步的认识。通过光合特性的研究，可以对茶陵野生稻有一个初步的认识。通过光合特性的研究，可以对茶陵野生稻有一个初步的认识。
实验原理：实验原理：实验原理：
利用利用利用 LI-6400LI-6400LI-6400 光合系统测定仪，测定茶陵野生稻的净光合速率，光强光合系统测定仪，测定茶陵野生稻的净光合速率，光强光合系统测定仪，测定茶陵野生稻的净光合速率，光强---光曲线，温度光曲线，温度光曲线，温度---
光曲线，二氧化碳光曲线，二氧化碳光曲线，二氧化碳---光曲线。通过生物统计方法，得出茶陵野生稻的光合生理特性。光曲线。通过生物统计方法，得出茶陵野生稻的光合生理特性。光曲线。通过生物统计方法，得出茶陵野生稻的光合生理特性。
实验过程：实验过程：实验过程：
在晴朗的夏天上午在晴朗的夏天上午在晴朗的夏天上午 999：：：00-1100-1100-11：：：000000，在控制条件下：温度，在控制条件下：温度，在控制条件下：温度(30(30(30 度度度),CO),CO),CO222(400ppm),(400ppm),(400ppm),分别测定分别测定分别测定
净光合速率净光合速率净光合速率(((光强：光强：光强：1500µmolphotons·m1500µmolphotons·m1500µmolphotons·m222·s·s·s-1-1-1)))和光响应曲线。所得数据用和光响应曲线。所得数据用和光响应曲线。所得数据用 MSExcelMSExcelMSExcel 处理。处理。处理。
六、实验结果分析六、实验结果分析六、实验结果分析
111、、、 茶陵野生稻净光合速率的比较茶陵野生稻净光合速率的比较茶陵野生稻净光合速率的比较(µmolCO2·m2·s-1)(µmolCO2·m2·s-1)(µmolCO2·m2·s-1)
品种品种品种,,,茶陵野稻茶陵野稻茶陵野稻,,,两优培九两优培九两优培九,9311,,9311,,9311,日本晴日本晴日本晴
净光合速率净光合速率净光合速率,,,,,,,,,,,,
在上午九点到十一点，温度为在上午九点到十一点，温度为在上午九点到十一点，温度为 303030 度时，茶陵野生稻的净光合速率比对照的栽培稻度时，茶陵野生稻的净光合速率比对照的栽培稻度时，茶陵野生稻的净光合速率比对照的栽培稻
光合速率要低。所以在正常的光温条件下，茶陵野生稻的光合生理不显示出优势。光合速率要低。所以在正常的光温条件下，茶陵野生稻的光合生理不显示出优势。光合速率要低。所以在正常的光温条件下，茶陵野生稻的光合生理不显示出优势。
222、、、 茶陵野生稻光曲线比较，茶陵野生稻光曲线比较，茶陵野生稻光曲线比较，
333、、、 从上图表看出，茶陵野生稻的光饱和点在从上图表看出，茶陵野生稻的光饱和点在从上图表看出，茶陵野生稻的光饱和点在 180018001800 光通量左右，比光通量左右，比光通量左右，比 931193119311 和日本晴要和日本晴要和日本晴要
高，比两优培九要低。光补偿点在高，比两优培九要低。光补偿点在高，比两优培九要低。光补偿点在 252525 光通量左右，比两友培九要低，与日本晴，光通量左右，比两友培九要低，与日本晴，光通量左右，比两友培九要低，与日本晴，
931193119311 相差不大。说明茶陵野生稻能适应较高光强。同时也适应较低的光强。相差不大。说明茶陵野生稻能适应较高光强。同时也适应较低的光强。相差不大。说明茶陵野生稻能适应较高光强。同时也适应较低的光强。
9311光曲线
-5
0
5
10
15
20
25
0 50 100 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
PARi
P
H
O
T
O
