qPCR 结果分析及作图示例（以基因表达量检测为例）
本示例以“不同处理组（对照组、药物 A 组、药物 B 组）对人肝癌细胞 HepG2 中 AKT1 基因表达量的影
响”为实验背景，采用实时荧光定量 PCR（qPCR）的相对定量法（ΔΔCt 法）进行结果分析，同步提供 Excel、
GraphPad Prism 两种常用工具的作图步骤及最终图表，覆盖熔解曲线、Ct 值原始数据、相对表达量柱状图等核
心内容。
一、实验基础信息
1. 实验设计
目的基因：AKT1（与细胞增殖相关的关键基因）
内参基因：GAPDH（管家基因，用于校正样本间的 RNA 质量与加样误差）
分组：对照组（未加药物，仅加等量培养基）、药物 A 组（50μmol/L 药物 A 处理 24h）、药物 B 组（50μmol/L
药物 B 处理 24h）
生物学重复：每组设置 3 个生物学重复（记为 Rep1、Rep2、Rep3），每个样本设置 3 个技术重复
实验仪器：StepOnePlus™ Real-Time PCR System（Thermo Fisher）
检测方法：SYBR Green I 染料法（需验证引物特异性）
2. 核心公式（ΔΔCt 法）
相对表达量（2）计算逻辑： ℃ 技术重复 Ct 值校正：同一样本同一基因的 3 个技术重复 Ct 值取平均值
（剔除异常值，异常值判定：偏离平均值＞ Ct）； ℃ ΔCt（样本）= 目的基因平均 Ct 值 - 内参基因平均
Ct 值； ℃ ΔΔCt = 各实验组 ΔCt - 对照组 ΔCt； ℃ 相对表达量 = 2（数值越大，代表目的基因表达量越高）。
二、原始数据及初步分析
1. 技术重复 Ct 值原始数据（部分仪器输出结果整理）
分
组
样本编号 AKT
1 技术重
复 1（Ct）
AKT
1 技术重
复 2（Ct）
AKT
1 技术重
复 3（Ct）
GAPD
H 技术重复
1（Ct）
GAPD
H 技术重复
2（Ct）
GAPD
H 技术重复
3（Ct）
对 Control-Rep1
分
组
样本编号 AKT
1 技术重
复 1（Ct）
AKT
1 技术重
复 2（Ct）
AKT
1 技术重
复 3（Ct）
GAPD
H 技术重复
1（Ct）
GAPD
H 技术重复
2（Ct）
GAPD
H 技术重复
3（Ct）
Control-Rep2 照组
Control-Rep3
DrugA-Rep1
DrugA-Rep2
药
物 A 组
DrugA-Rep3
DrugB-Rep1
DrugB-Rep2
药
物 B 组
DrugB-Rep3
2. 数据校正及相对表达量计算
分
组
样本编号 AKT
1 平均 Ct
值
GAPD
H 平均 Ct 值
ΔCt
（AKT1-GAPD
H）
ΔΔCt（实验组
-对照组均值）
相
对表达
量（2）
Control-Rep1
Control-Rep2
对
照组
Control-Rep3
对
照组均
值
- - - （归一化
后设为 ）
药 DrugA-Rep1 =
分
组
样本编号 AKT
1 平均 Ct
值
GAPD
H 平均 Ct 值
ΔCt
（AKT1-GAPD
H）
ΔΔCt（实验组
-对照组均值）
相
对表达
量（2）
DrugA-Rep2 = 物 A 组
DrugA-Rep3 =
药
物 A 组
均值
- - - -
DrugB-Rep1 =
DrugB-Rep2 =
药
物 B 组
DrugB-Rep3 =
药
物 B 组
均值
- - - -
3. 引物特异性验证（熔解曲线分析）
SYBR Green I 法需通过熔解曲线确认引物无非特异性扩增、无引物二聚体： ℃ 结果判断标准：目的基因
（AKT1）和内参基因（GAPDH）均呈现单一、尖锐的熔解峰，无杂峰；熔解温度（Tm）稳定（AKT1
Tm≈℃，GAPDH Tm≈℃）； ℃ 本实验熔解曲线结果：所有样本的 AKT1 和 GAPDH 均出现单一熔解
峰，无杂峰，说明引物特异性良好，qPCR 扩增结果可靠。
三、qPCR 结果作图（分工具示例）
1. 核心作图类型及目的
需呈现 3 类核心图表：℃ 熔解曲线图（验证引物特异性）；℃ 各样本 Ct 值散点图（展示数据分布）；℃
相对表达量柱状图（直观对比组间差异）。以下重点说明应用最广泛的“相对表达量柱状图”制作方法。
2. Excel 作图步骤（相对表达量柱状图）
数据整理：新建 Excel 表格，列 1 为“分组”（对照组、药物 A 组、药物 B 组），列 2 为“相对表达量均值”
（、、），列 3 为“标准差（SD）”（对照组 SD=，药物 A 组 SD=，药物 B 组
SD=）；
插入图表：选中“分组”和“相对表达量均值”数据区域，点击「插入」→「柱形图」→「簇状柱形图」；
添加误差线（展示数据离散度）：右键点击柱形图，选择「添加误差线」→「更多选项」，在“误差线选
项”中选择“自定义”，设置“正误差值”和“负误差值”为标准差数据，误差线末端样式设为“短横线”；
图表美化与标注：℃ 坐标轴命名：横轴（X 轴）标注“处理组”，纵轴（Y 轴）标注“AKT1 基因相对表达
量（2）”；℃ 设置 Y 轴范围：因相对表达量最小为 ，Y 轴最小值设为 0，最大值设为 ，便于观察差异；
℃ 添加标题：图表标题设为“药物 A、B 对 HepG2 细胞 AKT1 基因表达的影响”；℃ 配色：对照组柱形设为灰
色，药物 A 组设为蓝色，药物 B 组设为红色，颜色区分清晰；
统计显著性标注：若通过 t 检验（两组比较）或 ANOVA（多组比较）验证组间差异显著（本实验：对照
组 vs 药物 A 组，P＜；对照组 vs 药物 B 组，P＜），可在柱形上方添加显著性标记（*代表 P＜，
**代表 P＜，***代表 P＜），具体操作：点击「插入」→「文本框」，输入标记并放置在对应柱形
上方。
3. GraphPad Prism 作图步骤（相对表达量柱状图，专业期刊常用）
新建项目：打开 GraphPad Prism 9，选择「New Project」→「Column」→「Enter replicate values, stacked by
group」，点击「Create」；
输入数据：在“Data Table”中，列 A 命名为“Control”，输入对照组 3 个重复的相对表达量（、、
）；列 B 命名为“Drug A”，输入（、、）；列 C 命名为“Drug B”，输入（、、）；
生成基础柱状图：点击左侧「Graphs」→选择对应图表，默认生成带误差线的柱状图（误差线默认为 SD，
可在「Format」中切换为标准误 SE）；
统计分析与显著性标注：点击「Analyze」→「Column analyses」→「One-way ANOVA」→「OK」，完
成多组间差异分析后，选择「Post hoc tests」（事后检验）中的「Tukey's test」，勾选“Show significance
letters”或“Show P values”，自动在图表中标注组间显著性；
图表标准化（适配期刊要求）：℃ 双击坐标轴，设置字体（Arial）、字号（12 号），Y 轴标题标注“AKT1
relative expression (2)”；℃ 双击柱形，设置填充颜色和边框（无边框更美观）；℃ 图表标题设为“Effect of Drug
A and B on AKT1 expression in HepG2 cells”，放置在图表下方（期刊常用格式）；℃ 导出图片：点击「File」→
「Export」，选择格式（PNG，分辨率设为 300 dpi；或 EPS，矢量图，适合印刷）。
4. 最终图表示例及解读
（1）相对表达量柱状图核心要素：横轴为处理组，纵轴为相对表达量，柱形高度代表均值，误差线代表
SD，柱形上方标注显著性标记； （2）图表解读：对照组 AKT1 基因相对表达量设为 ，药物 A 组和药物
B 组的相对表达量分别降至 和 ，且与对照组相比均存在极显著差异（**P＜，***P＜）；药
物 B 组的 AKT1 表达量低于药物 A 组，说明药物 B 对 AKT1 基因表达的抑制作用更强。
5. 熔解曲线图制作（仪器软件+Excel）
℃ 仪器导出原始数据：从 StepOnePlus 软件中导出熔解曲线数据（包含“温度”和“荧光强度导数”两列数
据）；℃ Excel 作图：选中“温度”（X 轴，范围设为 60-95℃）和“荧光强度导数”（Y 轴）数据，点击「插入」→
「散点图」→「带平滑线的散点图」；℃ 标注：添加图表标题“AKT1 和 GAPDH 基因熔解曲线”，标注两条曲
线分别对应 AKT1（Tm≈℃）和 GAPDH（Tm≈℃），突出“单一熔解峰，无杂峰”的核心结论。
四、结果分析与作图注意事项
数据质量把控：Ct 值需在有效范围内（一般 15-35 Ct，Ct＞35 视为未检出），技术重复 Ct 值差异需＜
，否则需重新实验；
误差线选择：展示生物学重复离散度用“标准差（SD）”，展示实验精密度用“标准误（SE）”，期刊论文
需在图注中明确标注；
显著性标注：必须基于统计分析结果（t 检验/ANOVA），不可主观标注；多组比较需先做 ANOVA，再
做事后检验（如 Tukey's test）；
图表规范性：坐标轴需清晰标注名称及单位，图表标题简洁明了，图例完整；期刊投稿需按期刊要求设置
字体（常用 Arial）、字号（正文 12 号，标题 14 号）和图片分辨率（≥300 dpi）；
阴性对照设置：实验需设置“No Template Control（NTC，无模板对照）”，若 NTC 出现扩增（Ct＜35），
说明存在污染，需排查试剂或实验环境。
附：实验结论 50μmol/L 药物 A 和药物 B 处理 HepG2 细胞 24h 后，均能显著抑制 AKT1 基因的表达（P＜
）；其中药物 B 的抑制效果更强（相对表达量仅为对照组的 12%），提示药物 B 可能通过下调 AKT1 表
达抑制肝癌细胞增殖。
