指导原则编号： 【H】GPT 4-1 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则 （第二稿） 二○○四年三月一日 1
目录 一、概述……………………………………………………………………4 二、总则……………………………………………………………………4 三、刺激性试验……………………………………………………………5 ㈠、定义……………………………………………………………………5 ㈡、目的……………………………………………………………………5 ㈢、刺激性试验设计中应考虑的问题……………………………………5 ㈣、皮肤刺激性试验………………………………………………………6 ㈤、注射给药部位刺激性试验……………………………………………6 ㈥、眼刺激性试验…………………………………………………………6 ㈦、其他途径给药部位刺激性试验………………………………………7 四、过敏性试验……………………………………………………………7 ㈠、定义……………………………………………………………………7 ㈡、目的……………………………………………………………………7 ㈢、过敏性试验设计中应考虑的问题……………………………………7 ㈣、经皮给药过敏性试验…………………………………………………8 ㈤、注射给药过敏性试验…………………………………………………8 ㈥、其他途径给药过敏性试验……………………………………………8 ㈦、试验方法………………………………………………………………8 五、溶血性试验……………………………………………………………9 ㈠、定义……………………………………………………………………9 ㈡、目的……………………………………………………………………9 ㈢、适用范围………………………………………………………………9 ㈣、溶血性试验设计中应考虑的问题……………………………………9 ㈤、试验方法………………………………………………………………9 六、试验报告………………………………………………………………9 七、结果评价………………………………………………………………9 八、关注的几个问题………………………………………………………10 九、参考文献………………………………………………………………10 十、附录……………………………………………………………………11 ㈠、刺激性试验方法………………………………………………………11 2
⒈皮肤刺激性试验………………………………………………………11 ⒉注射给药部位刺激性试验……………………………………………13 ⒊眼刺激性试验…………………………………………………………14 ㈡、过敏性试验方法……………………………………………………17 ⒈被动皮肤过敏试验……………………………………………………17 ⒉全身主动过敏试验……………………………………………………17 ⒊豚鼠最大化试验和Buehler试验……………………………………19 ⒋皮肤光毒性试验………………………………………………………21 ⒌皮肤光过敏性试验……………………………………………………23 ㈢、溶血性试验方法……………………………………………………23 ⒈常规体外试管法（肉眼观察法）……………………………………23 ⒉改进的体外溶血性试验法（分光光度法）…………………………25 十一、起草说明…………………………………………………………26 十二、著者………………………………………………………………28 3
一、 概述 ㈠、定义和目的 化学药物刺激性、过敏性和溶血性是指化学药物制剂经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如过敏性和溶血性等）。它是临床前安全性评价的组成部分。 药物的活性成分及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，而严重的毒性可以影响用药的安全有效性，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围、临床研究监测指标并为临床解毒或解救措施提供参考，保障临床用药的安全有效。 ㈡、适用范围 本原则适用于化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究。 ㈢、主要内容 本指导原则的主要内容包括化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究和评价的总体原则、一般原则和常用试验方法。 二、总则 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。 试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究试验设计应结合毒性的发生机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法等来考虑。动物种属的选择应依据拟采用的试验模型和观察的指标。动物的性别、年龄和生理状态应符合拟采用试验方法的要求。试验用药物应与用于人体的制剂一致。给药方式（包括剂量、途径和方案）应根据所采用的试验模型和拟定临床应用的情况来决定。观察部位应选择给药部位，同时考虑选择周围组织或可能暴露于受试药物的部位。 如果其他非临床安全性研究（如长期毒性）的受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，其研究结果可反映化学药物刺激性、过 4
敏性和溶血性中的某一毒性，则可不进行相应的毒性研究。 进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究时应尽可能明确受试物的成分（包括主药、辅料和杂质等的名称和量）。 有相同给药途径上市制剂刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究提示有一定毒性时，应与已上市制剂进行比较性研究，毒性应相当或更小。比较性研究的样本例数的确定应遵循统计学的基本原理。 由于动物试验存在一定的局限性，因此进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性评价时，应结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，明确药物是否能进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。 三、刺激性试验 ㈠、定义 刺激性是指非口服药物制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症改变，若给药部位产生了不可逆性的组织损伤则称为腐蚀性。 ㈡、目的 观察动物局部接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后给药部位可能出现的炎症反应、组织的变性和坏死等不良反应。 ㈢、刺激性试验设计中应考虑的问题 ⒈实验动物的选择 依据观察指标和拟采用试验模型选择试验动物，一般每个试验选择一种动物进行评价。 ⒉给药的频率与期限 给药频率和期限应依据拟定临床应用的情况来决定。重复给药试验，一般每天给药一次，给药期限最长不超过4周。偶尔给药的受试物可用单次给药的方法进行试验。 ⒊可逆性观察 为明确毒性反应的恢复情况，建议进行停药后恢复期的观察。局部毒性反应的可逆性评价应包括局部及相关部位的反应。 ⒋受试物 受试物应与用于人体的制剂一致。 ⒌对照组 以溶媒和/或赋形剂作为阴性对照。必要时采用阳性对照或已上市 5
制剂。 ⒍剂量 剂量设计主要应该考虑受试物浓度和总剂量。一般采用与临床制剂相同浓度，设一个剂量组，可以通过改变给药频率进行剂量的调整，但皮肤给药刺激性研究通过增加涂敷厚度或加大涂布面积来提高给药剂量是不合适的。必要时应该进行不同浓度的刺激性试验。 ⒎给药方式 给药方案应尽量与临床用药方案一致。 给药途径和给药部位应与临床用药一致。 设计给药容积，给药速率和给药频率时，应考虑所选用动物模型给药部位的解剖和生理特点。 ⒏只要相互之间不影响且全身耐受性许可，则可在同一动物身上进行不同给药途径的刺激性试验研究，并可在对侧进行对照试验。 ⒐数据统计：根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。 ㈣、皮肤刺激性试验 ⒈对于经皮给药制剂及可能接触皮肤的非口服给药制剂应考虑进行皮肤刺激性试验。 ⒉在急性毒性试验、长期毒性试验或皮肤过敏性试验中已经评价过皮肤刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的皮肤刺激性试验。 ⒊试验方法 参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。 ㈤、注射给药部位刺激性试验 ⒈对于注射剂应考虑进行注射给药部位刺激性试验。 ⒉在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过注射给药部位刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的注射给药部位刺激性试验。 ⒊试验方法 参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。 ㈥、眼刺激性试验 ⒈眼用药物及可能接触眼睛的药物等均应考虑进行眼刺激性试验。 6
⒉在急性毒性试验、长期毒性试验中已经评价过眼刺激性，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不必进行单独的眼刺激性试验。 ⒊试验方法 参见附录中刺激性试验常用方法和相关文献。 ㈦、其他途径给药部位刺激性试验 可在总则和刺激性试验设计中应考虑的问题的指导下参考皮肤、注射给药部位和眼刺激性试验进行。 四、过敏性试验 ㈠、定义 本指导原则中的过敏性是指变态反应又称超敏反应，指机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应，是异常或病理性免疫反应。其分类采用目前普遍接受的分类法：Ⅰ型又称快发或速发过敏型，由IgE介导，主要表现为荨麻疹、过敏性休克、支气管哮喘、变应性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应等；Ⅱ型又称细胞毒型或溶细胞型，由IgG介导，主要表现为库姆斯试验阳性的溶血性贫血，粒细胞减少和血小板减少性紫癜；Ⅲ型又称免疫复合物型或血管炎型，由IgG、IgM介导，主要表现为局限性肺炎、血管炎、狼疮样反应、肾小球肾炎等；Ⅳ型又称迟发型或结核菌素型，由T淋巴细胞介导，主要表现为接触性皮炎。光敏性包括光毒性（光刺激性）和光过敏性（光变态反应）两类，光毒性是由光诱导的非免疫性的皮肤对光的反应，药物可通过直接作用或通过血循环间接作用。光过敏性是获得性的免疫性介导的由光激活的皮肤对光的反应，系光感物质经皮吸收或通过循环到达皮肤后与吸收的光线在表皮细胞层发生的反应，为Ⅳ型变态反应的特殊类型。 ㈡、目的 观察动物接触受试物后所产生的全身或局部过敏反应。 ㈢、过敏性试验设计中应考虑的问题 ⒈进行何种过敏性研究应根据药物自身特点（如化学结构等）、其他药理毒理的实验结果，特别是长期毒性试验的结果、临床适应症及给药方式等确定。 7
⒉具体试验方法的选择应根据给药途径，以及需考察的过敏性可能的发生机制确定，并应阐明合理性。如经皮给药需考虑做豚鼠最大化试验（GPMT）、Buehler试验（BT）；注射给药需考虑做全身主动过敏试验（ASA）和皮肤被动过敏试验（PCA）；吸入给药需考虑做豚鼠吸入诱导和刺激试验。 ⒊剂量设计应合理，注意量效关系。应设立阳性和阴性对照组。 ⒋若其他试验如长期毒性试验，已确定过敏反应类型，其受试物与拟进行临床研究的制剂相同或具有可比性，可不再单独进行该类型过敏反应的考察。 ⒌由于实验动物模型的局限性，如目前仍无理想的Ⅱ和Ⅲ型过敏反应的动物模型；光过敏性动物模型的临床意义尚不明确等，因此一些药物的过敏性临床前评价可采取灵活的方式，但应有充分的理由，并应在医师使用手册和说明书中详细描述其可能的毒性，临床研究时进行相应的考察。 ⒍数据统计：根据实验模型和试验方法选择合适的统计方法。 ㈣、经皮给药过敏性试验 应考察皮肤过敏性反应，通常采用BT或GPMT或其他合理的试验方法。若药物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如全身过敏性反应等）。 ㈤、注射给药过敏性试验 通常采用ASA和PCA或其他合理的方法考察全身过敏性反应，采用其他方法应阐明合理性。若药物的化学结构与文献报道产生其他过敏性反应的化合物相同或相似者，尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏性反应（如皮肤过敏性反应等）。 ㈥、其他途径给药过敏性试验 吸入途径药物应采用豚鼠吸入诱导和刺激试验。粘膜给药药物应结合药物的自身特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。若药物的化学结构与文献报道产生其他过敏反应的化合物相同或相似者尚应考虑采取适当的试验方法以考察其是否能引起其他过敏反应（如光敏反应等）。 ㈦、试验方法 8
参见附录中过敏性试验常用方法和相关文献。 五、溶血性试验 ㈠、定义 溶血性是指药物制剂引起的血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等反应。溶血性反应包括免疫性溶血与非免疫性溶血。免疫性溶血是药物通过免疫反应产生抗体而引起的溶血，为Ⅱ型和Ⅲ型过敏反应；非免疫性溶血包括药物为诱发因素导致的氧化性溶血和药物制剂引起血液稳态的改变而出现的溶血和红细胞凝聚等。 ㈡、目的 考察药物是否能够引起血管外或血管内溶血和红细胞凝聚等反应。 ㈢、适用范围 凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他药物制剂均应进行溶血性试验。 ㈣、溶血性试验设计中应考虑的问题 ⒈溶血反应发生机制复杂，目前尚无标准的临床前体内试验方法以全面评价药物制剂的溶血反应，因此推荐未有相同给药途径上市制剂在长期毒性研究中兼顾考察制剂的溶血性。试验时应注意观察溶血反应的有关指标及体征（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白、肾炎和脾脏淤血等），如出现溶血时，应进行进一步研究。 ⒉对于已有相同给药途径上市注射剂常可采用常规体外试管法评价药物的溶血性，若体外试管法试验结果为阳性，建议与相同给药途径上市制剂进行比较性研究，必要时进行动物体内试验。 ㈤、试验方法 参见附录中溶血性试验常用方法和相关文献。 六、试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：实验方法、受试物、实验动物、实验步骤、观察指标、实验结果和结果评价。 七、结果评价 说明方法、受试物和动物选用的合理性并分析其对实验结果的可能影响。 正确分析实验结果并理解实验结果的意义，判断毒性反应和毒性作9
用靶器官。 分析毒性试验的完整性，判断该毒性研究是否能较全面地反映药物给药后产生的毒性，并分析引起毒性作用的可能原因。 结合药学、药理、毒理及临床应用进行综合评价，明确药物是否能进行临床应用及临床应用时应关注的问题等。 八、关注的几个问题 对于化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究，有以下几个方面值得关注。 ⒈应体现整体性、综合性的原则 实际工作中应根据药物自身特点，通过结合药物的药学、药理、毒理和临床研究工作进行刺激性、过敏性和溶血性研究和评价。 ⒉具体情况具体分析 目前已有试验方法仍存在一定的局限性，因此我们可采用新方法以提供更有价值的试验结果，提高刺激性、过敏性和溶血性研究预测的灵敏性和准确性。但采用其他方法时应阐明其合理性并说明具体方法及操作流程。 九、参考文献 ⒈FDA Guidance for Industry Skin irritation and sensitization testing of generic transdermal drug products ⒉FDA Guidance for Industry Photosafety testing ⒊FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of investigation new drug ⒋EPA Health effects test guidelines OPPTS Immunotoxicity ⒌EPA Health effects test guidelines OPPTS Acute dermal irritation ⒍EPA Health effects test guidelines OPPTS Skin sensitization ⒎EPA Health effects test guidelines OPPTS Acute eye irritation ⒏EMEA Non-clinical local tolerance testing of medicinal products ⒐ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices- 10
Part 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity ⒑中华人民共和国卫生部药政局 新药（西药）临床及临床前研究指导原则汇编 ⒒徐叔云 卞如濂 陈修 药理实验方法学 ⒓陈奇 中药药理研究方法学 十、附录 本附录中收载的试验方法仅供参考，研究者应根据所研究药物的自身特点采用国内外公认的科学合理的试验方法，而并不仅限于附录中所收载的试验方法。 ㈠、刺激性试验方法 ⒈皮肤刺激性试验 定义 皮肤刺激性是指动物经皮肤给予受试物后在皮肤上产生的可逆性炎症改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为皮肤腐蚀性。 目的 观察动物皮肤接触受试物后所产生的刺激反应，提示药物临床应用后皮肤可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。 试验方法 试验动物：首选家兔，动物数4－8只，雌、雄各半。应设赋形剂对照，采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时对给药区（通常在背部）进行脱毛处理（可剪、剃或用适宜的脱毛剂）。去毛范围左、右各3cm×3cm。给药前应检查去毛皮肤是否因去毛而受损伤，有损伤的皮肤不宜进行试验。但若需考察破损皮肤的刺激性，则可在用药部位用砂纸磨或划“井”字并以渗血为度。 受试物的给予：取受试物 ml直接涂布于一侧已去毛的皮肤上，然后用二层纱布（ cm×）和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定；另一侧涂布赋型剂做对照。贴敷时间至少4小时。贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4周。 动物观察：在自然光线或全光谱灯光下观察皮肤反应。按表 11
1给出的评分标准对皮肤红斑和水肿进行评分。 单次给药皮肤刺激性试验，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。 多次给药皮肤刺激性试验，在每次去除药物后1小时以及再次贴敷前观察及记录红斑及水肿、涂敷部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄情况及其发生时间及消退时间，并对红斑及水肿进行评分。末次贴敷后，在去除药物后30-60分钟，24、48和72小时肉眼观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限以评价上述变化的恢复情况和时间。但延长期一般不超过14天。对出现中度及以上皮肤刺激性的动物应在观察期结束时对给药局部进行病理组织学检查。 结果评价：单次给药皮肤刺激性试验，计算每一观察时间点各组受试物及赋形剂皮肤反应积分的平均分值。将受试物皮肤反应积分的平均分值减去赋形剂皮肤反应积分的平均分值得到原发性刺激指数，按表2进行刺激强度评价。 多次给药皮肤刺激性试验，首先计算每一观察时间点各组原发性刺激积分均值，然后计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值即累积刺激指数，按表2进行刺激强度评价。 表1.皮肤刺激反应评分标准 刺激反应 分值 红斑 无红斑 0 轻度红斑（勉强可见） 1 中度红斑（明显可见） 2 重度红斑 3 紫红色红斑到轻度焦痂形成 4 水肿： 无水肿 0 12
轻度水肿（勉强可见） 1 中度水肿（明显隆起） 2 重度水肿（皮肤隆起1mm，轮廓清楚） 3 严重水肿（皮肤隆起1mm以上并有扩大） 4 最高总分值 8 表2.皮肤刺激强度评价标准 分值 评价 无刺激性 轻度刺激性 中度刺激性 强刺激性 试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的皮肤反应积分；具体描述其它毒性反应；试验结论等。 试验结果的解释 该试验系统比人皮肤刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激性，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。 ⒉注射给药部位刺激性试验 定义 注射给药部位刺激性是指动物经注射给予受试物后在注射部位产生的可逆性组织改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为腐蚀性。 目的 观察动物注射受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后注射部位可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。 试验方法 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3只。应设生理盐 13
水对照，可采用同体左右侧自身对比法。用药部位根据药物的给药途径确定，可选用耳缘静脉，耳中心动脉（其它动物可选用前、后肢静脉及股动脉等），股和背部肌肉，侧胸壁皮下组织，静脉旁组织等。 给药方法：按临床使用情况给予受试物，给药容积和速率应根据动物情况进行相应的调整。给药期限应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过7天。 动物观察：单次给药刺激性试验，在给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察；多次给药刺激性试验，每天给药前以及最后一次给药后48-96小时对动物和注射部位进行肉眼观察。观察期结束时应对部分动物进行给药部位组织病理学检查。留下的动物根据受试物的特点和刺激性反应情况，继续观察14－21天再进行病理组织学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。 结果评价：根据肉眼观察和病理检查的结果，对受试物使用的安全性进行评价。 试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的刺激反应情况；具体描述其它毒性反应；试验结论等。 ⒊眼刺激性试验 定义 眼刺激性是指动物经眼给予受试物后在眼前部表面产生的可逆性组织改变，若产生了不可逆性的组织损伤则为腐蚀性。 目的 观察动物经眼给予受试物后所产生的刺激性反应，提示药物临床应用后眼可能出现的炎症、组织变性和坏死等不良反应。 试验方法 试验动物：首选家兔，动物数每组不少于3只。应设置生理盐水对照组，可采用同体左右侧自身对比法。试验前24小时内对每只14
动物的双眼进行检查（包括使用荧光素钠检查）。有眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的动物不能用于试验。 给药方法：每只眼睛滴入或涂敷受试物，然后轻合眼睑约10s。一般不需冲洗眼睛。用药周期应根据药物拟用于临床的情况来决定，多次给药一般不超过4周。 眼部观察：单次给药眼刺激试验，在给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查；多次给药眼刺激试验，每天给药前以及最后一次给药后1、24、48和72小时对眼部进行检查。如果在72小时未见任何刺激症状，试验则可结束。如存在持久性损伤，有必要延长观察期限。但一般不超过21天。 可使用放大镜、裂隙灯、生物显微镜和其他合适的器械进行眼刺激反应检查。在记录了24h的观察后，可进一步用荧光素染色检查。每次检查，都应记录眼部反应的分值（见表3）。除了观察结膜、角膜和虹膜外，其他所观察到的损伤也应记录和报告。 结果评价：按表3的要求，将每一个观察时间每一动物的眼角膜、虹膜和结膜的刺激反应分值相加得总积分，将一组的积分总和除以动物数，即得最后分值。按表4判断其刺激程度。 表3 眼刺激反应分值标准 眼刺激反应 分值 角膜 无混浊 0 散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见 1 半透明区易分辨，虹膜模糊不清 2 出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见 3 角膜不透明，虹膜无法辨认 4 虹膜 正常 0 皱褶明显加深、充血、肿胀，角膜周围轻度充血，瞳孔对1 光仍有反应 出血/肉眼可见坏死/对光无反应（或其中一种） 2 结膜 15
充血（指睑结膜和球结膜） 血管正常 0 血管充血呈鲜红色 1 血管充血呈深红色，血管不易分辨 2 弥漫性充血呈紫红色 3 水肿 无水肿 0 轻微水肿（含眼睑） 1 明显水肿伴部分眼睑外翻 2 水肿至眼睑近半闭合 3 水肿至眼睑超过半闭合 4 分泌物 无分泌物 1 少量分泌物 2 分泌物使眼睑和睫毛潮湿或粘着 3 分泌物使整个眼区潮湿或粘着 4 最大总积分 16 表4 眼刺激性评价标准 分值 评价 0-3 无刺激性 4-8 轻度刺激性 9-12 中度刺激性 13-16 强度刺激性 试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每只动物在每一观察时间点的眼睛反应分值；具体描述其它毒性反应；试验结论等。 试验结果的解释 16
该试验系统比人眼睛刺激反应敏感，刺激反应阴性大多可确定为无刺激，阳性反应要排除假阳性。除非受试物有大范围或长时间的使用，否则轻度刺激性可不予重视。 ㈡、过敏性试验方法 ⒈被动皮肤过敏试验（PCA） 基本原理 将致敏动物的血清（内含丰富的IgE抗体）皮内注射于正常动物。IgE与皮肤肥大细胞的Fcз受体结合，使之被动致敏。当致敏抗原激发时，引起局部肥大细胞释放过敏介质，从而使局部血管的通透性增加，注入染料可渗出于皮丘，形成一个蓝斑。根据蓝斑范围或分光光度计法测定，判定过敏反应程度。 试验动物：PCA反应常用的动物是大鼠，亦用小鼠，有时根据试验需要用家兔。因这些动物PCA反应是由IgE介导的。 试验分组：应设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予卵白蛋白或天花粉或已知致敏阳性药物。每组动物数至少4只。 致敏途径及方式：应按临床拟给药途径。隔日致敏一次，共5次。末次致敏后10天左右采血，2000转/分离心10分钟，分离血清，-20℃保存，2周内备用。 激发：上述各组抗血清一般用生理盐水稀释成1：2、1：8、1：232。在动物背部预先脱毛3×4cm的皮内注射各对应组的抗血清。经24或48小时后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的-1%伊文思兰染料共1mL。 测定及结果评价：30分后麻醉处死各组动物，剪取背部皮肤，测量皮肤内层的斑点大小，直径大于5mm者判定为阳性。 ⒉全身主动过敏试验（ASA） 基本原理 对致敏成立的动物体内，静脉注射抗原，观察抗原与IgE抗体结合 17
后导致肥大细胞、嗜碱性细胞脱颗粒、释放活性介质而致的全身性过敏反应。 目的 观察受试物经全身给药后对动物引起的过敏性反应。 试验方法 动物 通常选用体重为300-400克的Hartley种雄性豚鼠。 剂量组别 应设阴性对照组，阳性对照组，低剂量组和高剂量组。每组动物至少4只。 2.⒊3致敏 致敏途径：按临床给药途径。 致敏次数：隔日一次，共5次。 致敏剂量： 阴性对照组：给予同体积溶解药物的溶媒。 阳性对照组：给予1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质。 2低剂量组：给予临床最大剂量（/kg或m）。 高剂量组：低剂量的数倍量。 激发 激发途径：通常静脉内给药。 激发次数：末次注射后第10-14日一次激发。 激发剂量：通常为致敏剂量的2-5倍量。 观察指标 致敏期间：每日观察每只动物的症状。初次，最后一次致敏和激发当日测定每组每只动物的体重。 激发：静脉注射后立刻至30分钟，按表5症状详细观察每只动物的反应，症状的出现及消失时间。最长应观察3小时。 表5 过敏反应症状 0 正常 7 呼吸急促 14 步态不稳 1 不安宁 8 排尿 15 跳跃 18
2 立毛 9 排粪 16 喘息 3 发抖 10 流泪 17 痉挛 4 搔鼻 11 呼吸困难 18 横转 5 喷嚏 12 罗音 19 潮式呼吸 6 咳嗽 13 紫癜 20 死亡 表6 全身致敏性评价标准 0 - 过敏反应阴性 1-4症状 + 过敏反应弱阳性 1-10症状 ++ 过敏反应阳性 1-19症状 +++ 过敏反应强阳性 20 ++++ 过敏反应极强阳性 ⒊豚鼠最大化试验（GPMT）和Buehler试验（BT） ⒊1定义 试验动物皮内或涂皮给予诱导剂量，经过10－14天的诱导期，此时免疫反应发生，然后给予激发剂量，以观察是否出现了过敏反应。在诱导期和攻击期的皮肤反应及其程度均应进行对比，并与伪处理组进行比较。 ⒊2目的 观察受试物经皮给药后对动物引起皮肤过敏反应的可能性。 ⒊3试验方法 ⒊实验动物 ⒊种系 最好选择年轻成年的豚鼠，选择实验室常用的种系。 ⒊饲养条件 试验温度为20±3℃，相对湿度30－70％，如为人工照明，应该12小时白天与12小时黑夜交替，给予常规的实验室饮食，不限制饮水，豚鼠应该给予足量的VitC。 ⒊动物数量和性别 动物数量和性别取决于所选择的试验方法，两种性别均可使用。如果使用雌性动物，应选择未产和未孕的动物。Buehler试验试验组不少于20只、对照组不少于10只。GPMT试验试验组不少于10只、对照组不少于5只，如果试验结果不能提示受试物为致敏剂，则应继续进行试验研究，其中试验组不少于20只、对照组不少于10只。 19
⒊对照动物 ⒊每6个月，应用已知的轻－中度的阳性物质检测方法的灵敏性和可靠性，轻－中度的致敏剂在加佐剂的试验中至少30%和不加佐剂试验中至少15%应有反应。推荐的阳性物质有巯基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331环氧树脂等，也可以使用其它的阳性对照物。 ⒊为了确保激发反应源于过敏性而非刺激性，应设立只有溶剂的伪处理组，所选择的溶剂应不干扰或改变试验结果的判断。 ⒊试验剂量 取决于所选择的方法。在Buehler试验中，致敏剂量应当足够高，以产生轻微的刺激性，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。在GPMT试验中，致敏剂量应足够高以产生轻－中度的皮肤刺激性且能很好地全身耐受，激发剂量为不产生刺激性的最高剂量。 ⒊动物的观察 ⒊皮肤反应应分级并在方法学所确定的激发时间进行判定和记录，一般为24和48小时。对于异常的反应，应相应地调整时间。 ⒊记录开始和结束时的动物体重。 ⒊试验步骤 ⒊试验在第0，6-8和13-15天用封闭片局部给药以诱导，在第27-28天在未给药的肋腹部贴6小时以局部激发。去除封闭片24和48小时后读取结果。如果结果难以判定，一周后再次激发，可采用原来的对照组或新的对照组。 ⒊试验采用皮内注射给药，使用或者不使用佐剂进行诱导，局部诱导5－8天后，第20－22天给予激发剂量24小时，在去除激发剂量24和48小时后读取结果。同Buehler试验一样，如果结果难以判定，一周后再次激发，如果初试选择的动物数量只有10只而结果难以判断时，应再增加10只试验动物和5只对照动物。 ⒊试验组和对照组均采取盲法读取结果。 ⒊建议采取用水或适当溶剂去除受试物，不应改变已经存在的皮肤反应和表皮的完整性。 ⒊根据试验方法，可采用剪、刮或脱毛的手段去除试验部位的毛发。 ⒊4试验报告 20
试验报告应该符合GLP实验室管理规范，内容应该包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；实验动物的种属、品系、性别、体重和来源（注明动物合格证号和动物级别）；实验动物饲养环境（包括饲料来源、室温、湿度、照明、实验动物设施合格证号）；详细的试验操作；每个动物在诱发接触1和24小时以及激发接触后24和48小时的皮肤反应结果，至少应给红斑和水肿分等级，记录任何异常反应，每一组过敏的比例和每一动物过敏程度（轻、中和重）；试验结论等。 试验结果的解释 该试验系统比人皮肤过敏反应敏感，在豚鼠身上强过敏者在人身上引起过敏反应的可能性很大，而在豚鼠身上弱过敏者有可能或不可能在人身上引起过敏反应。 ⒋皮肤光毒性试验 定义 光毒性反应是指药物吸收的紫外光能量在皮肤中释放导致皮肤损伤的作用，即皮肤或全身接触或应用化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引起的一种皮肤毒性反应。光毒性反应是光敏中最常见的一种副反应。具有剂量依赖性，其临床表现与晒伤相似，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒和色素沉着。严重者可产生局部坏死、溃烂或表皮脱落。一旦发生，反应十分迅速，一般在光照24小时左右或更短时间发生。 试验方法 试验动物：健康300-500g白化或无毛豚鼠，至少14只，雌雄各半。 试验分组：将豚鼠按体重性别随机分为二组，即对照组4只，试验组10只，雌雄各半。对照组在给予受试物和阳性对照药后不接受光照，试验组则在给予受试物和阳性对照药后接受光照。 药物和给药剂量：阳性对照药可选用8-甲氧基补骨脂素；根据受试物的溶解性、试验所需浓度、理化特性和动物局部、全身的耐受性等确定给药剂量并说明理由。一般选用二种浓度，其中低浓度为临床用药浓度。 给药方法：将背部去毛区划分为四个部位，每个部位按（g）/cm给药。给药情况如下： 21
组别 部位 给药处理 光照射 对照组 1 溶剂或赋形剂 否 2 受试物浓度1 否 3 受试物浓度2 否 4 阳性对照 否 试验组 1 溶剂或赋形剂 是 2 受试物浓度1 是 3 受试物浓度2 是 4 阳性对照 是 给药后，立即将动物放到特制的制动器上以限制动物活动。在光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在60min左右为宜。给药后适当时间（一般-4小时），用温水或无刺激性的适宜溶剂除去对照组动物受试部位残留的受试物或赋形剂，将动物放回笼子中。试验组动物受试部位残留的受试物或赋形剂在光照后被清除。 光照方法：应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。试验时将动物放在光照台上固定并遮盖头部后，用适宜的光源（如水冷式氙灯）照射适当长的时间。一般认为波长应在280-450nm的范围内，照射时间在-2小时之间，照射强度应适当，并在照射前后分别测定光照强度。 检查项目：至少在试验开始前及结束时称量体重，于24、48小时观察皮肤反应情况并以照片记录及表示。按表7记录各时间皮肤反应分值。 表7 皮肤反应程度的评分标准 皮肤反应情况 分值 无红斑 0 轻度红斑 1 中度红斑 2 重度红斑（不伴或伴有水肿） 3 结果判断及评价：与对照组比较，如果对照组动物的分值均 22
小于1，则试验组动物分值大于等于1即为阳性；如果对照组动物分值为1或更大，则试验组动物分值大于对照组最大者为阳性。进一步可计算阳性率。 ⒌皮肤光过敏性试验 定义 光过敏性系药物吸收光能后成激活状态，并以半抗原形式与皮肤中的蛋白结合成为药物-蛋白质结合物（全抗原），经表皮的郎格罕氏细胞传递给免疫活性细胞，引起过敏反应的作用。光过敏性属IV型迟发型过敏反应。其发生时间相对较长，且有一定的潜伏期。通常5～10天的连续用药和光照射可诱导免疫系统产生光过敏反应。再次给药时，药物和日照作用24～48小时之内即会有光过敏性反应发生。 试验方法 准备：动物皮肤脱毛，形成约2×4cm脱毛区。在脱毛区四角各注射弗氏完全佐剂各。 致敏：于脱毛区涂20%十二烷基硫酸钠溶液，再将受试物涂于该部位，一定时间后拭去表面残留药物。阳性对照药可选用溴化水杨酰苯胺。 照射：应利用对不同受试物敏感的波长段进行试验。应先进行预试验，对照射剂量、光强度和照射时间及照距等进行确定。以选定波长紫外线照射涂药部位，以产生显著红斑为准。隔日重复涂抹十二烷基硫酸钠和给受试物，并照射涂药部位的步骤，共5次。 激发：于末次致敏后2周，在准备的皮肤区再次涂药，浓度宜低于致敏浓度，以免刺激和光毒反应。光照前应尽量保证受试物及对照物有足够的时间穿透皮肤角质层，以与表皮细胞发生作用，一般在60min左右为宜。光照时以不引起红斑反应的亚红斑量（1/2-2/3最小红斑量）紫外线照射。 结果观察：照射后1～72小时内观察皮肤反应并以照片记录表示。凡与受试物多次接触并在紫外线照射后出现皮肤反应甚至全身反应者，均可认为是该受试物引起的光过敏性。 ㈢、溶血性试验方法 ⒈常规的体外试管法（肉眼观察法） 23
试验目的：观察受试物对红细胞状态是否产生影响。 试验方法 血细胞悬液的配制：取兔血（或羊血）数毫升（约20 ml），放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000-1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用%氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用%氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。 受试物的制备：除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用%氯化钠溶液1∶3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以各药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。 试验方法：取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37℃±℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。按下列顺序加入各种溶液： 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 2％红细胞悬液(ml) 生理盐水(ml) 蒸馏水（ml） 受试物（ml） 结果观察：若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。 结果判断：当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有24
溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。 试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；试验方法；详细的试验操作；每只试管在每一观察时间点观察的结果；试验结论等。 ⒉改进的体外溶血性试验法（分光光度法） 试验目的：观察受试物对红细胞状态是否产生影响。 试验方法 血细胞悬液的配制：取兔血（或羊血）数毫升（约20 ml），放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。加入%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000-1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用%氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用%氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。 受试物的制备：除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用%氯化钠溶液1∶3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以各药品使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。 试验方法：取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。按下表所示依次加入2%红细胞悬液、%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37℃±℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。按下列顺序加入各种溶液： 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 2％红细胞悬液(ml) 生理盐水(ml) 蒸馏水（ml） 受试物（ml） 结果观察：将各管的溶液置入干燥离心管中离心，取上清在25
分光光度计上，545 nm处，以蒸馏水为空白读取各管OD值。 结果判断：用下式计算各试验管的溶血率％： 溶血率（％）＝（OD－OD）/(OD－OD) X 100％ tncpcnc式中：OD：试验管吸光度； tOD：阴性对照管吸光度； ncOD：阳性对照管吸光度。 pc溶血率>5％表明出现了溶血，不宜注射使用。 试验报告 试验报告应符合GLP实验室管理规范，内容包括：受试物名称、理化性状、配制方法和用量；试验方法；详细的试验操作；每只试管的测定结果；试验结论等。 十一、起草说明 基于原《新药审批办法》，我国曾经对皮肤给药刺激性和过敏性，眼刺激性，滴鼻剂和吸入剂刺激性，应用于直肠、阴道制剂刺激性，静脉给药刺激性、过敏性和溶血性如何进行研究和评价有一个原则性要求。但随着科学技术的发展，我们对刺激性、过敏性和溶血性的发生机制、影响因素和临床意义有了更深入的认识，对刺激性、过敏性和溶血性在药物非临床安全性评价中的地位有了更深入的理解，因此我们依据《药品注册管理办法》，参考ICH框架下三方各国的相关技术指导原则和国内外有关非口服给药药物的刺激性、过敏性和溶血性研究进展，结合药品非临床安全性评价的一般规律和我国药物研究技术的工作实际，重新制定了化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则。旨在为化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究和审评提供技术参考。该技术指导原则仅反映了现阶段对化学药物刺激性、过敏性和溶血性的认识、观点和建议，并随科学技术的发展而将不断修订以期逐步完善。 修订后的指导原则是对已颁布的指导原则的继承和发展。与已颁布的指导原则相比，它重点阐述如何科学合理地进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究设计。其研究样品为拟用于临床的药物制剂，研究范围涵括了经眼、耳、鼻、口腔、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、静脉、动脉、肌肉、皮下、静脉旁和鞘内等途径给药制剂给药后产生的局部和/或全身毒性。强调了化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究必 26
须执行《药物非临床研究质量管理规范》；还强调了试验设计应以毒性产生的机制和临床相关性为基础，结合药学（如药物的构效关系和/或理化特性）、药理毒理（如急性毒性、长期毒性、药代动力学和药效学）及药物的临床应用来综合判断如何进行化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究和评价，但应注意具体问题具体分析，并体现整体性和综合性的原则。 考虑到药物的毒性与药物制剂密切相关，而我国的新药研发以仿制为主，药物临床前动物安全性评价常缺乏系统性和完整性，因此在修订后的技术指导原则中建议有相同给药途径上市制剂的毒性研究出现阳性结果时应与已上市制剂进行比较性研究以保证药物临床应用的安全有效性。 修订后的技术指导原则在毒性研究内容方面较已颁布的指导原则有较大的发展，如过敏性包括全身过敏性、皮肤过敏性和光敏性等；溶血性包括免疫性溶血和非免疫性溶血等。经皮给药制剂除考察刺激性和皮肤过敏性反应外，若有可能产生其他毒性（如全身过敏性、溶血性等）时还应采取适当的试验方法考察相应的毒性以充分揭示药物制剂临床应用时可能出现的毒性；注射给药制剂除考察刺激性、全身过敏性和溶血性外，若有可能产生其他毒性（如皮肤过敏性等）时也应采取适当的试验方法考察相应的毒性反应；其他途径给药制剂根据药物自身特点进行刺激性和/或过敏性和/或溶血性等毒性研究。 修订后的技术指导原则在毒性研究方法方面较已颁布的指导原则也有较大的不同，如皮肤过敏性反应通常采用BT或GPMT；全身过敏性通常采用ASA和PCA等。也可在进行其他毒性试验如长期毒性试验中兼顾进行刺激性和/或过敏性和/或溶血性研究，但受试物应与拟用于临床的制剂相同或具有可比性，试验结果应能充分揭示药物制剂临床应用时可能出现的刺激性和/或过敏性和/或溶血性。 修订后的技术指导原则附录中收载了常用试验方法，但值得注意的是收载的试验方法仅作参考。由于受试药物的化学结构和剂型、临床应用，毒性反应的发生机制、性质和强弱不同，因此实验者应根据受试药物的特点，选择国内外公认的试验方法进行试验。 本指导原则参考《药理试验方法学》、EPT、OECD和化妆品皮肤和 27
眼刺激性技术指导原则将刺激性定义为对给药部位产生的可逆性炎症改变，而不可逆性的组织损伤定义为腐蚀性。 目前刺激性、过敏性和溶血性临床前安全性研究预测的灵敏性和准确性尚不高，可能与以下几方面有关：⒈试验设计未结合毒性的发生机制、影响因素、临床意义和药物临床应用的适应症和给药方法来考虑，如①皮肤过敏性试验常采用主动皮肤过敏试验，而该试验方法是根据Ⅰ型变态反应发病机制设计的，因此试验结果只能预测皮肤给药引起全身过敏反应的可能性，而对于皮肤给药而言，用药后引起的皮肤过敏反应对用药的安全有效性的影响更为重要，因此其过敏性试验尚需根据Ⅳ型变态反应发病机制设计，如采用BT或GPMT试验方法；②试验设计中受试物、给药剂量、途径、周期、次数等不能反映药物临床使用情况。⒉现有试验方法的局限性，如①目前仍无理想的Ⅱ和Ⅲ型过敏反应的动物模型；②光过敏性动物模型的临床意义尚不明确；③PCA和ASA对小分子物质检测的可靠性尚不确切等。⒊试验设计中忽视了对某些毒性反应的考察，如①溶血性试验常只采用常规体外试管法，而该方法对免疫性溶血和药物为诱发因素导致的氧化性溶血无法预测；②静脉途径给药注射剂只考察血管刺激性，而忽视其在临床应用中可能渗漏到血管外而可能对肌肉产生的刺激性。⒋检测方法的灵敏度不够，如采用常规的体外试管法考察药物的溶血性时常通过肉眼观察来判断溶血情况，主观误差较大，又易受到药物色泽、浑浊等因素的影响。⒌评价方法和标准尚不完善，如某些给药途径刺激试验无半定量和/或定量的评价方法等。 由于科学研究是不断进步和发展的，因此我们鼓励研究者针对品种的具体情况和科研中的具体问题，采用其他方法以提供更有价值的试验结果，提高刺激性、过敏性和溶血性研究的预测性，但在采用其他方法时应注意阐明其合理性并说明具体方法及操作流程。 十二、著者 化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则课题研究组 28
