- 1 -
中国科技论文在线
降血压活性肽多聚体的基因设计、载体构建
及其鉴定#
杨艳俊，苏宇杰，杨严俊**
基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）（213AA102207）
作者简介：杨艳俊（1989-），女，硕士，主要研究方向：食品生物技术
通信联系人：杨严俊（1965-）男，教授，主要研究方向：食品生物技术
（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122） 5
摘要：降血压活性肽已经作为功能因子添加到各种食品中，取得了良好的社会效益和经济效
益。其中基因工程手段更是推进了降血压活性肽的产业化发展。然而，如何利用一些串联策
略将不同的降血压活性肽单体连接起来，以使得获得的多聚体在体内能够释放出单体肽而达
到降低血压的目的，这是基因设计的关键点。本研究基于降血压活性肽的氨基酸组成和结构
与其降血压效果的关系，将筛选得到的降血压活性肽单体串联成多聚体，并进行基因优化，10
以期利用体内胃肠消化酶水解相应的酶切位点，完整地释放出活性肽单体。
关键词：食品生物技术；降血压肽；降血压活性肽多聚体；基因设计；基因优化
中图分类号：TS201;R91;Q78
Gene Design, Plasmid Construction and Identification of 15
Antihypertensive Peptide Multimer
YANG Yanjun, SU Yujie, YANG Yanjun
(School of Science and Technology, Jiangnan University, Jiangsu Wuxi 214122)
Abstract: Antihypertensive peptide was added to various kinds of food as function factor and
achieved good social benefits and economic benefits. Antihypertensive peptide was developed by 20
gene engineering in industrialization. However, it needs to solve how to use specific strategies to
compose multimer by different antihypertensive peptide monomers. The monomers can be
released from antihypertensive peptide multimer to lower blood pressure. These were the key
point of gene design. This study intended to construct a novel recombinant plasmid to produce
antihypertensive peptide. According to amino acid composition of antihypertensive peptide and 25
relationship between structure and effect, variant antihypertensive peptide monomers were used to
compose multimer. The antihypertensive peptide monomers can be released by the hydrolysis of
gastrointestinal proteases in the human body.
Key words: Food biotechnology; Antihypertensive peptide; Antihypertensive peptide multimer;
Gene design; Gene optimization 30
0 引言
全球健康风险报告对人口死亡的归因分析发现，在导致人口死亡的危险因素排序中高血
压占第一位[1]。目前我国高血压患者人数已经突破 亿，15 岁及以上人群高血压患病率
24%。与此同时，约有 亿患者不知道自己患有高血压。 35
降血压活性肽是一种能够降低人体血压的小分子肽的总称，它以药效明显、温和、无副
作用的优势成为生物医药领域研究的新兴热点[2]。我国对降血压活性肽的研究尚处于起步阶
段，但多肽类药物越来越受到专家学者的关注。
降血压活性肽的制备方法包括：酶水解法，发酵法和基因工程法。自从 Oshima 等[3]首
次从食物蛋白明胶中提取出降血压活性肽以来，国内外学者已经通过酶水解法和微生物发酵40
- 2 -
中国科技论文在线
法，成功分离出大量具有体内高活性的降血压肽段。但是，酶法和发酵法的制备降血压活性
肽的步骤繁琐，产量低，成分复杂，成本高，难以实现产业化大规模生产[2]。基因工程技术
的出现使降血压肽的大规模生产成为可能。利用基因工程法制备降血压活性肽弥补了酶法和
发酵法的不足。因为降血压活性肽单体仅由几个氨基酸组成，肽段较短，易被宿主菌体内蛋
白酶降解，失去活性，故难以在宿主菌体内直接表达。因此，基因串联的方式被人们广泛采45
用。目前，日本对降血压活性肽的研究最为深入，已经有一部分产品实现了工业化生产[1]。
而我国利用基因工程法制备降血压活性肽还处于探索阶段，如何制备出高产量高活性的降血
压活性肽是目前需要解决的问题。利用降血压活性肽体内构效关系以及胃肠酶消化特性进行
基因设计、优化，提高基因表达水平具有较好的研究意义和应用价值，可为后续降血压肽的
分离纯化和活性鉴定提供前提。 50
本研究选择经文献报道的高体内降血压活性肽单体，根据胃肠酶消化特性，串联成相应
的降血压活性肽多聚体，设计并对多聚体基因进行优化分析；构建表达载体，转化宿主菌株，
构建重组菌株。通过本研究为后续活性肽单体的释放奠定基础。
1 材料和方法
实验材料 55
菌株与培养基
菌株 Top10/pUC57-Simple-AHPM 由南京金斯瑞生物科技有限公司构建。克隆宿主菌
JM109 和表达宿主菌 BL21（DE3）均为本实验室保存
LB 固体培养基：1% Tryptone，% Yeast extract，1% NaCl，%琼脂糖，pH ；
LB 液体培养基：1% Tryptone，% Yeast extract，1% NaCl，pH 。 60
主要试剂
SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒、SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒、SanPrep
柱式 DNA 胶回收试剂盒、快速 DNA 连接试剂盒、高效感受态细胞制备试剂盒、卡那霉素、
DNA Marker (DL2000)，生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶 HindIII 和 XhoI、
DNA Marker (DL10000)，宝生物(大连)工程有限公司。 65
本研究中所用引物及测序均由上海生物工程有限公司完成。AHPM 基因的特异性引物：
A-F (Forward primer)：5'-CATGAAGCTTAGTTTACATCAAGCCGTTCCGTG-3'
A-R (Reverse primer)：5'-GATCTCGAGTCACAGGATCGGGTAGCGTT-3'
主要仪器
高速冷冻离心机 5415 R，美国 eppendorf 公司；梯度 PCR 仪，英国 G-Storm 公司；电70
热恒温水浴锅 HWS12，上海恒科学仪器有限公司；pH 计、AB204-N 分析天平，梅特勒-托
利多仪器（上海）有限公司；C-MAG HS7 磁力搅拌器，德国 IKA；手提式不锈钢压力蒸汽
灭菌锅，上海申安医疗器械厂；超净工作台，苏净集团安泰公司；核酸电泳仪，GelDoc XR
型凝胶成像仪，美国 Bio-Rad 公司。
实验方法 75
降血压活性肽单体的筛选
本研究筛选降血压活性肽单体的原则主要有以下两个方面：其一，选择经体内 SHR 动
- 3 -
中国科技论文在线
物实验或者体外胃肠消化模拟实验证实具有高活性的降血压活性肽肽段作为单体；其二，根
据已经报道的降血压活性肽的构效关系进行类比应用；其三，选择 C 端或者 N 端具有胃肠
酶切割位点的肽段作为连接片段，将不同的单体串联成多聚体。根据以上原则筛选 20 种降80
血压活性肽单体，其体内外降血压活性见表 1。
表 1 筛选的降血压活性肽单体
Table 1 Chosen antihypertensive peptides
单体 IC50/(μ mol/L) 剂量/(mg/kg) SBP/(mmHg), h 文献
VY 26 100 17, 4h [4]
LW 60 22, 2h [5]
IKW 60 17, 4h [5]
IMY - - [6]
IKPFR - - [7]
IKPFY - - - -
IAPFR - - - -
LRPFR - - - -
LKPNM 10 80, 6h [5]
IVY 1 , 1h [6]
YQEPVL 280 - - [8]
FALPQY - - [9]
IFVPAF - - [10]
VAW - - [11]
DVWY - , 3-6h [12]
ESIINP - 10 30, 4h [13]
NGTVVFEPP - - [2]
DERF - - [14]
YADHPFL - - -
YAEERYPIL - - [15]
降血压活性肽多聚体的设计思路 85
降血压活性肽多聚体设计的串联策略为：
一是针对 C-末端为 Pro 残基的高活性降血压肽段难以从其前体多肽中高效率释放的问
题，且有实验证实 FR 是用于辅助释放 C-末端为 Pro 残基活性肽段的潜力连接片段[7]。且在
肽段 C-末端为碱性氨基酸残基时，被切割效率高。IKPFR 具有很高的 ACE 抑制活性
（IC50=μmol/L）。因为 K 和 K 相邻或 K、R 各自与 D 或者 E 相邻时，会引起胰蛋白酶90
的漏切[16]，所以设计 IKPFY 与 DVWY 连接。
二是采用高效释放的串联结构作为连接片段。六肽的羧基端或氨基端为芳香族氨基酸或
亮氨酸残基，倒数第三位为脯氨酸残基时，经胃肠消化酶处理后能够完全释放。从而保证两
段六肽中间串联的肽段得到完整释放。因此设计以经胃肠酶水解液 UPLC-MALDI-TOF-TOF
分析证实能够高效率释放的六肽 FALPQY（IC50=μmol/L）、 IFVPAF（IC50=μmol/L）95
和 YQEPVL （IC50=280μmol/L）作为连接片段辅助释放具有高体内降压活性的肽段。另外
将此发现应用到 YADHPFL （IC50=μmol/L）七肽。
降血压活性肽多聚体基因优化与合成
根据以上提及的筛选和设计原则将 20 种降血压肽单体串联成降血压活性肽多聚体
AHPM(Antihypertensive Peptide Multimer)。目标多肽的氨基酸序列中包含胃肠消化酶的酶切100
位点。通过优化大肠杆菌密码子偏爱性、GC 含量、mRNA 二级结构等因素，将降血压肽多
- 4 -
中国科技论文在线
聚体的氨基酸序列转化成相应的寡核苷酸序列。其中在目的基因的 5’ 端和 3’ 端分别插入
HindIII 酶切位点 AAGCTT 和 XhoI 酶切位点 CTCGAG，并由南京金斯瑞生物科技有限公司
人工合成。
目的基因的 PCR 扩增 105
采用质粒 DNA 小量抽提试剂盒从重组菌株 Top10/pUC57-Simple-AHPM 中提取重
组质粒 pUC57-Simple-AHPM。
设计引物 A-F (Forward primer)：
5'-CATGAAGCTTAGTTTACATCAAGCCGTTCCGTG-3'；A-R (Reverse primer)：
5'-GATCTCGAGTCACAGGATCGGGTAGCGTT-3'，下划线分别为 HindIII/XhoI 内切酶识别110
位点。PCR 反应总体系：2×PCR Master 25 µL，引物 A-F（20 μmol/L）1 µL，引物 A-R（20
μmol/L） 1 µL，模板 DNA 1 µL，双蒸水补足至 50 µL。PCR 反应扩增条件：94℃变性 5 min；
28 次循环（94℃ 40 s，62℃ 45 s，72℃ 40 s）；72℃保温 10 min。PCR 产物纯化试剂盒对
PCR 产物进行纯化。
表达载体的连接与鉴定 115
PCR 纯化产物和质粒 pET28a-L2(252-273)-SUMO-EGFP 分别进行 HindIII/XhoI 双酶切，
接着分别对目的片段使用 DNA 胶回收试剂盒进行回收，质粒 DNA 采用快速 DNA 连接试剂
盒对目的片段进行连接，转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞，提取质粒 DNA，再转化大肠杆
菌 BL21 感受态细胞，涂卡那霉素抗性平板，待长出单菌落进行菌液 PCR，接着抽提质粒，
进行双酶切验证并送往上海生工测序。 120
回收用酶切体系：质粒 DNA 25 µL，HindIII µL，XhoI µL，10×M buffer 5µL，蒸
馏水补足至 50µL；验证用酶切体系：质粒 DNA 5 µL，HindIII 1 µL，XhoI 1 µL，10×M buffer
2 µL，加入双蒸水至 20 µL。
2 结果与讨论
实验材料降血压活性肽多聚体基因的设计 125
20 种降血压活性肽单体的串联结果如图 1 所示。
130
135
V Y↓ I K P F R↓ E S I I N F ↓ L K P-
5’- CATGAAGCTTA GTT TAC ATC AAG CCG TTC CGT GAA TCT ATC ATC AAC TTT CTG AAG CCG
HindIII 140
N M ↓ L W ↓ I K P F Y ↓D V W Y ↓ I A P F R ↓V-
- 5 -
中国科技论文在线
AAT ATG CTG TGG ATC AAG CCG TTC TAC GAC GTG TGG TAT ATT GCG CCG TTT CGT GTT
A W↓L R P F R ↓ I M Y ↓N G T V V F E P P ↓
GCC TGG CTG CGT CCG TTC CGC ATC ATG TAT AAC GGC ACC GTG GTT TTT GAA CCG CCG 145
L W↓Y Q E P V L↓ I K W ↓ F A L P Q Y ↓ I V-
CTG TGG TAC CAG GAA CCG GTC CTG ATT AAA TGG TTC GCA CTG CCG CAA TAT ATT GTC
Y↓ I F V P A F ↓ D E R F↓Y A D H P F L↓Y 150
TAC ATC TTT GTG CCG GCG TTC GAT GAA CGC TTT TAT GCC GAC CAT CCG TTT CTG TAT
A E E R Y P I L↓ * -AHPM
GCT GAA GAA CGC TAC CCG ATC CTG TGA CTCGAG -3’
XhoI 155
图 1 降血压活性肽多聚体 AHPM 及其相应的多聚体基因
注：垂直箭头表示为潜在的胃肠消化酶的酶切位点；灰色区域表示降血压活性肽单体；下划线表示基因的
限制性酶切位点；星号表示终止密码子
The antihypertensive peptide multimer and the corresponding gene 160
Vertical arrows mean potential restriction sites of gastrointestinal enzyme and the AHP monomers are
marked in grey. Restriction sites are underlined and stop codon is denoted as asterisk
降血压活性肽多聚体基因优化分析
基因表达水平受许多因素的影响，通过密码子优化技术尽可能考虑到这些因素，以达到165
最高的表达水平。未进行优化的基因可能由于串联稀有密码子而导致翻译效率降低甚至丧失
翻译能力。密码子适应指数 Codon Adaptation Index（CAI）： （CAI=1，基因表达程度
达到最佳；CAI〉，基因实现高水平表达）表示随着基因序列的长度密码子使用频率的分
布（图 2）。最优密码子的频率表示计算密码子质量组的密码子分布百分数，100 为大肠杆
菌中给定氨基酸的最高使用频率（图 3）。通过优化密码子适应指数和最优密码子频率改变170
密码子使用偏好性。接着考虑优化 GC 含量与分布，理想的 GC 含量百分比在 30-70%。通
过去除不利的峰顶，达到延长 mRNA 半衰期的目的，使得影响 mRNA 核糖体结合和稳定性
的茎环结构消失。Theoretical pI/Mw: Adaptation Index（CAI）：
（〉）；GC 含量：% （30-70%）。 基于大肠杆菌偏爱密码子将氨基酸序列转化
为相应的寡核甘酸序列，并由金斯特（南京）公司人工合成，构建相应的表达载体及其重组175
菌。
合成后的全长基因被克隆入载体 pUC57-Simple ，并将重组克隆载体命名为
pUC57-AHPM。
- 6 -
中国科技论文在线
180
图 2 密码子适应指数
Codon Adaptation Index
图3 最优密码子的频率
Frequency of Optimal Condons 185
图4 GC含量的优化
GC Content Adjustment The
携带目的基因质粒的酶切验证
经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切产物在约 316bp 处出现特异条带，与理论大小一致。190
酶切验证结果显示目的基因 AHPM 被插入重组大肠杆菌 TOP10 基因序列中。
- 7 -
中国科技论文在线
195
图 5：双酶切验证
M: DNA Marker(10000bp); 1: 质粒酶切产物
Fig. 5: The identification by enzyme cleavage
M: DNA Marker(10000bp); 1: The product of Plasmid by double digestion
目的基因的 PCR 扩增 200
通过 PCR 从上述质粒中扩增得到 AHPM 基因。经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR 产物
约为 316bp 的特异条带，与理论大小一致。
图 6：质粒 PCR
M: DNA Marker (2000bp); 1, 质粒 PCR 产物 205
Plasmid PCR
M: Marker (2000bp); 1, Plasmid PCR product
重组表达载体的双酶切鉴定
挑选转化后的单菌落，取适量菌液经引物 PCR 扩增后，得到约 316 bp 的核苷酸片段，210
与理论大小一致。同时将构建的表达质粒 pET28a-L2(252-283)-SUMO-AHPM 经引物 PCR 扩
增后，得到约 316 bp 的核苷酸片段，也与理论大小一致。该 PCR 产物经 HindIII 和 XhoI 双
- 8 -
中国科技论文在线
酶切后，获得长度约 316 bp 的片段，与目的基因片段理论大小一致。
图 7：重组质粒的双酶切鉴定 215
M: DNA Marker (10000bp); 1, 重组质粒; 2, 双酶切产物
Fig. 7 The identification of recombinant plasmid by restriction enzyme
Lane M: DNA 10000 marker; Lane 1: recombinant plasmid; Lane 2: product of recombinant plasmid by double
digestion
重组表达载体构建完成 220
将转化有该质粒的克隆菌送往生海生工测序，测序结果显示目标基因被正确克隆入表达
载体 pET28a 中，命名为 pET28a-L2(252-273)-SUMO-AHPM。目标基因片段被插入 L2 基因
的下游，在目的片段与 L2 之间有 SUMO 组成 L2(252-273)-SUMO 融合标签。
225
图 8 目的基因的测序结果
Fig. 8 Blast result of target gene
- 9 -
中国科技论文在线
3 结论
降血压活性肽是一类由几个氨基酸残基组成的小分子多肽，因其降压效果温和、易于吸
收且对正常血压无影响等优点被人们广泛关注。本研究将筛选得到的降血压活性肽单体，依230
靠具有胃肠消化酶切割位点的连接片段，串联降血压活性肽多聚体。再将设计得到的多聚体
进行基因优化，分析密码子使用偏好性以及 GC 含量等因素。最后构建基因表达载体并进行
鉴定，转化得到重组菌株。
本文坚持一定的筛选原则，采取合理的串联策略，设计优化降血压活性肽多聚体基因，
以期提高基因表达水平的同时无需后续蛋白酶的处理，在体内自然高效释放单体，达到降低235
血压的目的。降血压活性肽多聚体的基因设计、优化及构建策略为基因工程手段制备降血压
活性肽打下了坚实的基础，也就是说为基因表达、蛋白纯化以及生物活性鉴定提供了理论依
据，以期推动降血压活性肽的工业化进程，同时也为其他生物活性肽的制备提供了新的思路。
[参考文献] (References)240
[1] SERGIO RM; LUZ MARIA TERESITA PM; DANIA O. GA; SCHUYLER S. K. Engineering production of
antihypertensive peptides in plants[J]. Plant Cell, Tissue and Organ Culture(PCTOC), 2012, 112(2), 159-169.
[2] GHASSEM M; ARIHARA K; BABJI A S; SAID M; IBRAHIM S. Purification and identification of ACE
inhibitory peptides from Haruan (Channa striatus) myofibrillar protein hydrolysate using HPLC-ESI-TOF
MS/MS[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4), 1770-1777. 245
[3] OSHIMA G, SHIMABUKUKO H, NAGASAWA K. Peptide inhibitors of angiotensin-converting enzyme in
digests of gelation by bacterial collagenas [J]. Biochim Biophys Acta, 1979, 566: 128-137.
[4] SAITO Y, WANEZAKI K, KAWATO A, IMAYASU S. Antihypertensive effects of peptide in sake and its
by-products on spontaneously hypertensive rats [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1994, 58(5): 812-816.
[5] FUJITA H, YOKOYAMA K, YOSHIKAWA M. Classification and antihypertensive activity of angiotensin 250
I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins [J]. J Food Sci, 2000, 65(4): 564-569.
[6] MATSUI T, YUKIYOSHI A, DOI S, SUGIMOTO H, YAMADA H, MATSUMOTO K. Gastrointestinal
enzyme production of bioactive peptides from royal jelly protein and their antihypertensive ability in SHR [J]. J
Nutr Biochem, 2002, 13(2): 80-86.
[7] RAO S Q, LIU S, JU T, XU W Q, MEI G M, XU Y S, YANG Y J. Design of substrate-type ACE inhibitory 255
pentapeptides with an antepenultimate C-terminal proline for efficient release of inhibitory activity[J].
Biochemical Engineering Journal, 2012, 60: 50-55.
[8] ROBERT MC, RAZANAME A, MUTTER M, JUILLERAT MA. Identification of angiotensin-I-converting
enzyme inhibitory peptides derived from sodium caseinate hydrolysates produced by Lactobacillus helveticus
NCC 2765 [J]. J Agr Food Chem, 2004, 52(23): 6923-6931. 260
[9] TAUZIN J, MICLO L, GAILLARD JL. Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic
hydrolysate of bovine alphaS2-casein [J]. Febs Letters, 2002, 531(2): 369-374.
[10] HE H L, CHEN X L, SUN C Y, ZHANG Y Z, ZHOU B C. Analysis of novel angiotensin-I-converting
enzyme inhibitory peptides from protease-hydrolyzed marine shrimp Acetes chinensis [J]. J Pept Sci, 2006, 12(11):
726-733. 265
[11] RAO S Q, JU T, SUN J, SU Y J, XU R R, YANG Y J. Purification and characterization of angiotensin
I-converting enzyme inhibitory peptides from enzymatic hydrolysate of hen egg white lysozyme[J]. Food Research
International, 2012, 46:127-134.
[12] KOYAMA M, NARAMOTO K, NAKAJIMA T, AOYAMA T, WATANABE M, NAKAMURA K.
Purification and identification of antihypertensive peptides from fermented buckwheat sprouts[J]. Journal of 270
Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(12): 3013-3021.
[13] MIGUEL M, MANSO M, ALEIXANDRE A, ALONSO M J, SALAICES M, ROSINA Effects,
Angiotensin I-Converting Enzyme (ACE)-Inhibitory Activity, and Antihypertensive Properties of Peptides
Derived from Egg White[J]. 2007, 55(26): 10615-10621.
[14] JIANG Z M, TIAN B, BRODKORB A, HUO G C. Production, analysis and in vivo evaluation of novel 275
angiotensin－I－converting enzyme inhibitory peptides from bovine casein. Food Chemistry, 2010, 123(3): 779－
786.
[15] MIGUEL M, RECIO I, GOMEZ-RUIZ J A, RAMOS M, LOPEZ-FANDINO R. Angiotensin I-Converting
Enzyme Inhibitory Activity of Peptides Derived from Egg White Proteins by Enzymatic Hydrolysis[J]. Journal of
Food Protection, 2004, 67(9): 1914-1920. 280
[16] 王勇, 李水明, 何曼文, 邹永东. 蛋白质胰蛋白酶水解过程双位点漏切台端的质谱鉴定[N]. 质谱学报,
2013, 34(1).
