韩 山 师 范 学 院
学 生 毕 业 论 文
（2010 届）
题目（中文） 正交设计优化活菌型乳清饮料工艺
（英文） To optimize the technology of viable type
whey drink by orthogonal design
******************************
专业: 生物科学 班级: 20062312 班
姓名: 林锦彬 学号: 2006231206
系别: 生物系
指导老师: 李云(讲师)
韩山师范学院教务处制
诚 信 声 明
我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及
取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，
论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，我承诺，论文中的
所有内容均真实、可信。
毕业论文作者签名: 签名日期: 年 月 日
摘要：活菌型乳清饮料是利用乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一
定程度，以降低乳糖，产生乳酸，最后生成的一种营养丰富的乳清饮料。
乳清发酵过程受菌种比例、发酵温度、乳清浓度、接种量四种因子的影响。
本实验应用正交设计的方法优化发酵乳清饮料的四个影响因子，结果表明，
用乳酸菌发酵乳清饮料的最佳工艺条件为:菌种比例 ::=1:2:1，发酵
温度为 42℃，接种量为 7%，乳清浓度 5% 。
关键词： 乳清；正交设计法；益生菌；发酵饮料
Abstract: The viable type whey drink is use whey as the main raw
materialadding lactic ,adding lactic acid bacteria fermented to a certain extent, to
reduce the lactose, produce lactic acid, and finally generate a nutrient-rich whey
drinks. The process of whey fermentation affected by four factors which is strain
ratio,fermentationtemperature,whey concentration and experiment
to optimize four factors which affect the process of whey fermentation by
orthogonal design. The results showed that the best technological conditions of
the beverage of whey fermented by lactic acid bacteria was:Strain ratio of :
: = 1:2:1, fermentation temperature of 42 ℃, inoculation of 7%, whey
concentration of 5%.
Key Words: Whey; Orthogonal design; Probiotics; Fermented beverages
目录
1 材料和方法 …………………………………………………………………… 2
材料 …………………………………………………………………………… 2
菌种 …………………………………………………………………………… 2
培养基 ………………………………………………………………………… 2
主要试剂 ……………………………………………………………………… 2
仪器和设备 …………………………………………………………………… 3
方法 …………………………………………………………………………… 3
2 结果与分析 …………………………………………………………………… 6
乳清饮料发酵条件的优化结果与分析 ……………………………………… 6
验证实验结果 ………………………………………………………………… 9
3 讨论 …………………………………………………………………………… 10
4 参考文献 ……………………………………………………………………… 11
5 致谢 …………………………………………………………………………… 12
正交设计优化活菌型乳清饮料工艺
乳清(whey)是乳经酸凝乳或凝乳酶凝固后剩余的液态部分，是干酪和干酪素生产的
副产物，呈黄绿色[1]。一般每生产 1kg 干酪可得到 9kg 乳清，每生产 1kg 干酪素可得 27kg
乳清[2]。据 FAO 数据统计[3]，在近五年里，全球干酪产量增长了近 150 万吨，目前的生
产量约 1810 万吨。而乳清营养则相当于除去酪蛋白的脱脂乳，其营养物质占原料乳的
55%，干物质约占 6-8%，粗蛋白占 1%，粗脂肪占 %，总糖(乳糖约 %)占
3-5%，还有多种矿物质和水溶性维生素等[4，5]。乳清的多种营养成分具有重要生理功用，
如乳清蛋白是一种高营养优质蛋白质。乳清蛋白中的必需氨基酸非常丰富，其含量等于
或大于 FAO/ WHO 提出的对幼儿和成人的推荐值，因此对个体健康具有重要意义。乳
清中的糖类几乎都是乳糖，乳糖不仅可为机体提供能量，尚有多种营养与保健功能。另
外乳清矿物质处于良好的平衡状态，其中钾和钠的比例为 2℃1，具有完全的营养功效。
发酵型乳清饮料[9]是利用营养价值极丰富的乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一
定程度，乳清中的乳糖经β-半乳糖苷酶的作用，转化成高甜度的葡萄糖-半乳糖糖浆，以
降低乳糖，产生乳酸，最后生成一种口味纯正、酸甜可口、营养丰富的高档饮料。因此
发展研制乳清饮料，既可充分利用乳清资源，又具有比其他利用方式(乳清粉、乳清蛋
白粉等)工艺简单，投资设备少，产量大，经济效益高等特点，故是乳清利用的一个重
要方向。澳大利亚是将乳清加工成果汁饮料；日本是先用酸性蛋白酶制取透明乳清，然
后加入甜味料和着色剂等物质制成充气饮料；美国是先将乳清制成糖浆，再与葡萄汁配
制成“葡萄酒”，其风味相当于标准葡萄酒[10] 。
国内对乳清饮料的研究也有报道，内蒙古农牧学院的孙天松等人[6]研制了澄清发酵
饮料，找到了乳清发酵时的 pH 值、酸度随时间的变化关系；东北农学院的万贤生[7]作
了利用微生物生产乳清饮料的研究；内蒙古农牧学院食品工程系的张和平等人[8]作了酶
法多肽乳清饮料的研究。
国外对乳清利用的研究，饮料形式较其他形式相对较少，归纳起来，有以下几种情
况：℃直接调配，即取一部分乳清、一部分果汁或其他原料进行调配而成；℃制作蛋白
澄清饮料，即通过酸化或加热等方法使蛋白质沉淀后再加工成饮料；℃发酵型乳清饮料。
其中第二种形式研究的比较多。
正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的一种设计方法，
它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具
备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种
高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的
水平组合列成表格，称为正交表。例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，
需进行 33=27 种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。若按 L9(33)正交表安排实
验，只需作 9 次，按 L18(37)正交表进行 18 次实验，显然大大减少了工作量。因而正交
实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。
正交表的符号：Ln(ji)，其中 L 代表正交表的符号，n 代表正交表的行数(试验次数，
试验方案数)，j 代表正交表中的数码(因素的水平数)，i 代表正交表的列数(试验因素的
个数)。
通过前面对活菌型乳清饮料进行的单因素研究，我们知道菌种比例、发酵温度、乳
清浓度、接种量等因子对活菌型乳清饮料的发酵都有一定的影响；且发酵活菌型乳清饮
料的最佳菌种比例为：保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌:干酪乳杆菌:嗜酸乳杆菌=1:2:1:1，最
佳发酵温度为 38℃；最佳乳清培养浓度 4%；最佳接种量为 7%。在此基础上活菌型乳清
饮料的理化性质和风味都较好。
结合单因素实验结果，本实验应用正交试验设计的方法优化发酵乳清饮料的四种影
响因素:接种量、发酵温度、乳清浓度和菌种比例，确定最佳的工艺条件，以更好的满足
理论研究和工业生产的需要。
1 材料和方法
材料
市售脱脂奶粉
D90 脱盐乳清粉为荷兰进口（乳糖含量 82%），酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏为生化试剂，
其他试剂为分析纯。
菌种
保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus，简写为 )、嗜热链球菌（Streptococcus
thermophilus，简写为 ）、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简写为 )、干酪乳
杆菌（Lactobacillus casei，简写为 ）
培养基
脱脂乳培养基：脱脂奶粉 100g，蒸馏水 1L，自然 pH 值，用于菌种的保藏活化。
MRS 液体培养基：蛋白胨 ，牛肉膏 ，酵母膏 ，葡萄糖 ，吐温
-80 ，磷酸氢二钾 ，乙酸钠 ，柠檬酸氢二铵 ，硫酸锰 ，硫酸镁
，加蒸馏水至 1000 mL。调酸度至 pH 值为 ，压力为 MPa，灭菌 20 min
备用。MRS 固体培养基则另加 %的琼脂。
乳清培养基：乳清粉，水；按试验所需比例配制
主要试剂
标准乳糖糖溶液：
取分析纯乳糖置于 105℃烘箱干燥 2 h，精确称取 20 mg 溶解后置于 100 mL 容量瓶
内，用蒸馏水定容至刻度，配成 mg/mL 的标准乳糖溶液。
邻甲基苯胺试剂：
称取硼酸 溶于温热的 210 mL 冰醋酸中，再加入 g 硫脲，充分溶解后加
入邻甲基苯胺 mL，用冰醋酸定容至 250 mL，贮于棕色瓶内。
36％中性甲醛：
用酚酞指示剂，将甲醛用氢氧化钠中和至刚出现粉红色为止。
酚酞指示液：
称取 酚酞，用少量乙醇溶解并定容至 500 mL 氢氧化钠标准溶液
氢氧化钠标准滴定溶液 NaOH= mo1/L：分析纯
75%乙醇
仪器和设备
立式万用电炉 上海浦东荣丰科学仪器有限公司
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101A-1型电热鼓风干燥箱 上海市实验仪器总厂
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方法
正交实验设计
主要影响因素为接种量、发酵温度、菌种比例、乳清浓度,采用 4 因素 3 水平的正交表
L9(34), 各因素和水平的选取如表 1 所示。
表 1 乳清发酵液正交试验因素水平
Table1 Whey fermentation factor level orthogonal
因素及水平 菌种比例（A） 发酵温度（B） 乳清浓度（C） 接种量（D）
1 1:2:1（::） 35℃ 3% 5%
2 1:2:1（::） 38℃ 4% 7%
3 1:2:1:1(:::) 42℃ 5% 9%
表 2 乳清发酵饮料配比方案正交实验计划表
Table2 Whey fermented beverages orthogonal matching program schedule
试验号 菌种比例（A） 发酵温度（B） 乳清浓度（C） 接种量（D）
1 1:2:1（::） 35℃ 3% 5%
2 1:2:1（::） 38℃ 4% 7%
3 1:2:1（::） 42℃ 5% 9%
4 1:2:1（::） 35℃ 4% 9%
5 1:2:1（::） 38℃ 5% 5%
6 1:2:1（::） 42℃ 3% 7%
7 1:2:1:1(:::) 35℃ 5% 7%
8 1:2:1:1(:::) 38℃ 3% 9%
9 1:2:1:1(:::) 42℃ 4% 5%
按上述正交实验设计计划表进行发酵试验。
理化指标的测定
pH 值测定[11]
用 pHS-3D 型 pH 计直接测定发酵后的 pH 值
活菌数测定[12]
用稀释平板菌落计数法测定发酵后的活菌数
在无菌条件下吸取样品 lmL，转移至 9mL 无菌水中，将加有样品的无菌水摇匀，
再从中吸取 lmL 转移至另一无菌水中(9mL)，此过程依次重复，直至稀释到所需浓度。
吸取一定浓度的菌液 1mL 涂布在平皿上，35℃培养 48 小时，计菌落数。
样品菌数=菌落数×稀释倍数
酸度（滴定酸度）的测定[13]
吸取 5mL 已搅拌均匀的试样，置于 150 mL 锥形瓶中，加 40 mL 新煮沸放冷至 40℃
的水，混匀，然后加人 5 滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色在
内不消失为终点。消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数乘以 20，即为酸度(0T)。连续滴
定两次，取平均值。重复性条件下获得的两次独立滴定结果的绝对差值不得超过
mL。
氨基氮的测定-甲醛滴定法[14]
准确吸取 样品于 100mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀后准确移取 置
于 200mL 烧杯中，加 60mL 水,开动磁力搅拌器。用 氢氧化钠标准溶液滴定至
酸度计指示 pH＝，记录消耗氢氧化钠的毫升数，可计算总酸含量。
加 10mL 甲醛溶液于烧杯中混匀，再用 氢氧化钠标准溶液继续滴定至
pH=，记下消耗 氢氧化钠标准溶液的毫升数。同时取 80mL 蒸馏水，先用
氢氧化钠溶液滴定至 pH 为 ，再加 甲醛溶液，用 氢氧化
钠标准溶液滴定至 pH 为 ，做试剂空白试验。
结果计算：
式中 X —样品中氨基氮的含量（g/100mL）
V1—测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）
V2—试剂空白试剂加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）
V3—样品稀释液取用量（mL）
100
100
3
5
1000
14
21
V
CVV
X
y = 1. 5223x - 0. 0101
R
2
= 0. 9982
0. 00
0. 10
0. 20
0. 30
0. 40
0. 50
0. 000 0. 050 0. 100 0. 150 0. 200 0. 250 0. 300
吸光度 A635
乳
糖
含
量
m
g
C —氢氧化钠标准溶液的浓度（mol﹒L-1）
14—氮的摩尔质量（g﹒mol-1）
乳糖测定（邻甲基苯胺法）
(1) 乳糖标准曲线的制作
℃ 取干净试管 6 支，按表 3 加入各溶液；
℃ 将各试管内溶液摇匀，套上试管帽，置于沸水浴中加热 10 min；
℃ 取出，用流水冷却至室温；
℃ 用分光光度计在波长 635nm 下比色，读取吸光度，将结果填入表 3 中；
⑤ 以吸光度为横坐标，乳糖的毫克数为纵坐标，绘制标准曲线：如图 1。
表 3 乳糖标准曲线的制作
Table3 The production of lactose standard curve
管号 1 2 3 4 5 6
乳糖/mg
标准乳糖溶液/mL
蒸馏水/mL
O-TB 试剂/mL 4 4 4 4 4 4
A635
图 1 乳糖标准曲线图
Picture1 Standard curve of lactose
(2) 发酵液含糖量的测定
℃ 稀释：取 2mL 发酵液，先用蒸馏水定容到 6mL，充分摇匀，然后取 1mL 倒入 100mL
容量瓶中，用蒸馏水冲洗水解液，合并洗液，并定容至刻度，充分摇匀；
℃ 显色：吸取稀释后的水解液 2mL，置于干净试管中。再加入 O-TB 试剂，充分摇匀，
套上试管帽，置沸水浴加热 10min。取出后用流水冷却至室温；
℃ 比色：以 2mL 蒸馏水代替水解液作对照管，在 635nm 波长下测定吸光度；
℃ 计算：根据样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖毫克数，然后按下列
公式算出每 100mL 发酵液中的含糖量
发酵液含糖量（g/100mL）= [ (A×N)/ (V×1000)] ×100
式中：A 为由吸光度查标准曲线所得的糖毫克数
N 为样品稀释倍数
V 为测定时所取的样品毫升数
感官分析方法
根据活菌型乳清饮料的色泽、组织状态、气味、口感进行感官评分[15,16]，由 10 名
具有一定经验的人员组成评定小组，采用 100 分制，即感官综合评分=色泽评分+气味评
分+口感评分+组织状态评分，取其平均值作为总感官评分。产品感官评分标准具体见
表 4
表 4 活菌型乳清饮料感官鉴评标准表
Table4 Viable model Sensory evaluation of whey beverage standards list
项目 评分标准 分值
一级：纯乳白色，无其他杂色 15—20
二级：颜色淡黄 10—14色泽（20 分）
三级：颜色略深 < 10
一级：发酵香气，如牛奶香气，且有酸甜味 25—30
二级：发酵香气，有酸甜味，很淡 20—24气味（30 分）
三级：有酸腐味，刺鼻 < 20
一级：口感细腻，爽口，酸甜适中，无异味 25—30
二级：偏甜或偏酸，口感粘稠 20—24口感（30 分）
三级：太甜或太酸，口感粘稠 < 20
一级：均匀细腻，无沉淀和分层 15—20
二级：上部有少量清液析出 10—14组织状态（20 分）
三级：有明显沉淀和分层 < 10
2 结果与分析
乳清饮料发酵条件的优化结果与分析
以酸度实验结果进行正交
表 5 不同发酵条件的 L9(34)正交试验结果分析表
Table5 Different fermentation conditions L9 (34) orthogonal test results of table
试验号 菌种比例（A） 发酵温度（B） 乳清浓度（C） 接种量（D） 酸度 0T
1 1 1 1 1 98
2 1 2 2 2 105
3 1 3 3 3 100
4 2 1 2 3
5 2 2 3 1 120
6 2 3 1 2
7 3 1 3 2 105
8 3 2 1 3
9 3 3 2 1 115
K1
K2
K3
R
表 6 方差分析
Table6 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性
A 2 *
B 2
C 2 *
D 2 *
误差 2
从表 5 极差分析结果可以看出：影响因素的显著程度大小为：D＞C＞A＞B，即接
种量＞乳清浓度＞菌种比例＞发酵温度，从表 6 方差分析也可以得出同样的结论，根据
酸度正交试验结果，得出的发酵乳清饮料的最佳工艺条件是 A2B3C3D1，即菌种比例为
::=1:2:1，发酵温度为 42℃，乳清浓度为 5%，接种量为 5%。
以感官评价实验结果进行正交
表 7 不同发酵条件的 L9(34)正交试验结果分析表
Table7 Different fermentation conditions L9 (34) orthogonal test results of table
试验号 菌种比例（A） 发酵温度（B） 乳清浓度（C） 接种量（D） 感观评价
1 1 1 1 1 54
2 1 2 2 2 71
0
10
20
30
40
50
60
70
80
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3
菌种比例 发酵温度 乳清浓度 接种量
评
分
3 1 3 3 3 65
4 2 1 2 3 73
5 2 2 3 1 79
6 2 3 1 2 75
7 3 1 3 2 70
8 3 2 1 3 59
9 3 3 2 1 70
K1
K2
K3
R
表 8 方差分析
Table8 Analysis of variance
因素 偏差平方和 自由度 F 比 F 临界值 显著性
A 2 *
B 2
C 2 *
D 2 *
误差 2
图 2 正交实验直观分析图
Picture2 Orthogonal direct analysis chart
从表 7、表 8 和图 2 可以直观的看出：影响因素的显著程度大小为 A＞C＞D＞B，
即菌种比例＞乳清浓度＞接种量＞发酵温度。根据感官评价正交试验结果，得出发酵乳
清饮料的最佳工艺条件是 A2B3C3D2，即菌种比例为 ::=1:2:1，发酵温度为 42℃，
乳清浓度为 5%，接种量为 7%。
菌种比例对产品感官品质影响最大， 和 是两种非常有益的乳酸菌， 发酵
糖产生的 L(+)-乳酸酸味不强烈，但发酵能产生较多的香味物质如双乙醛[17]， 发酵糖
产生的 D(+)-乳酸有较强酸味，同时也能够产生一些香味物质，在试验中 与 的比
例都保持在 1:2， 的比例较高，使饮料的香味较好， 比例较低，为防止酸味不足，
加入 菌种，因 与 都是专性同型发酵，能够耐强酸，虽然 代谢产酸速率低，
但这对发酵饮料的后酸化作用有重要意义，从表 7 和图 2 可以直观的看出，菌种比例为
::=1:2:1 的感官品质是相对比较高的；加入 菌种，虽然 也能够耐强酸，
但可能因为 只能在低酸环境和 37℃以下的温度才能生长良好，而 和 比较适宜
在 pH 为 和较高温度中生长，所以加入 ，不利于菌种的共生关系，导致菌种
比例为 ::=1:2:1 的感官品质相对来说不是很好；同时加入 菌种和 菌种，
可能由于种内竞争和种间竞争比较激烈，影响菌种的共生关系，导致菌种比例为
:::=1:2:1:1 的感官品质相对来说也不是很好因此我们选择 ::=1:2:1 的
比例为最佳。
从表 7 的极差值可以看出温度对饮料的品质影响不大，在 38℃~42℃这一狭小的范
围内培养温度对饮料品质的影响较其它因素而言要弱。根据菌种的生长特性，菌种共生
时最适宜的发酵温度为 40℃~42℃。从图 2 可以看出在 42℃的评分是最高的。虽然在 38℃
的评分也比较高，但出现严重乳清析出现象，凝乳质地变差。因此我们选择 42℃的发酵
温度为最佳。
接种量对产品的组织状态和口感也有很大影响，接种量过低，产酸易受到抑制且不
稳定；接种量太大，产酸过快，会给产品的风味和组织状态带来缺陷，从表 7 中我们可
以看出在 7%时评分最高，结合先前做的单因素实验结果，我们选择 7%的接种量为最佳。
乳清的浓度对饮料品质的影响较大，浓度过高，可能造成乳清利用不彻底，浪费资
源或者菌种过度繁殖，酸味明显，浓度过低，使种内竞争和种间竞争更加激烈，没有发
酵香味。从表 7 我们可以看出乳清浓度在 5%时评分最高，因此我们选择浓度 5%为最佳。
综合考虑酸度正交分析结果和感官评价正交分析结果，确定乳酸菌发酵乳清饮料的
最佳发酵工艺条件为 A2B3C3D2，即菌种比例 ::=1:2:1，发酵温度为 42℃，接种
量为 7%，乳清浓度为 5%。此组合不在试验设计中，因此需要做验证实验。
验证实验结果
验证试验：按上面最佳条件 A2B3C3D2，平行试验 3 次，得滴定酸度为 106oT，且具
牛奶香气，有酸甜味，气味轻淡，淡黄色，无分层。通过验证实验，发现此试验设计的
试 验 结 果 酸 度 高 ， 感 官 评 价 也 较 高 。 因 此 ， 确 定 较 优 发 酵 条 件 为 ： 菌 种 比 例
::=1:2:1，发酵温度为 42℃，接种量为 7%，乳清浓度为 5%。
3 讨论
发酵型乳清饮料是利用营养价值极丰富的乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定
程度，以降低乳糖，产生乳酸最后生成一种口味纯正、酸甜可口、营养丰富的高档饮料。
这样既可充分利用乳清资源，又具有比其他利用方式(乳清粉、乳清蛋白粉等)工艺简单，
投资设备少，产量大，经济效益高等特点，故发展研制乳清饮料是乳清利用的一个重要
方向。同时，乳清的多种营养成分具有重要生理功用，属天然原料兼营养饮料，故是饮
料发展的一个重要方向。
在本试验中，乳清饮料的感官评价都不是很好，这可能跟发酵时间把握不当有关，
发酵 10 小时，时间可能过长，随着发酵时间的延长，酸度也随之增加，且发酵时间太
长将不利于工厂生产，可以尝试缩短发酵时间，也可通过添加一些调料来改善，使乳清
饮料更加可口。
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致谢
感谢李云老师在本人完成这篇论文过程中的悉心指导；感谢赖文娜同
学、李玉斌同学和陈薇薇同学对本文提出了大量的宝贵意见，还要感谢为
本文提供了许多有益建议的同学。
林锦彬
2010 年 5 月于韩师
