目录
生物化学与分子生物学
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
DNA重组和重组DNA技术
DNA Recombination and
Recombinant DNA technology
第二十一章
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
DNA重组（DNA recombination）是指不
同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段
的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。
重 组 DNA技 术 （ recombinant DNA
technology）是指在体外将两个或两个以
上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖
形成新DNA分子的过程。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
第一节
自然界DNA重组和基因转移
DNA Recombination
and Gene Transfer in Nature
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
DNA重组
同源重组 (homologous recombination)
位点特异的重组(site-specific recombination)
转座重组(transposition recombination)
接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
发生在同源序列间的重组称为同源重组
(homologous recombination)，又称基本重组
（ general recombination）。是最基本的
DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在
两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片
段的交换。
以的同源重组为例，了解同源重组机制
的Holliday模型
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
Holliday模型的4个关键步骤：
两个同源染色体DNA排列整齐；
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体；
通过分支移动产生异源双链DNA；
Holliday中间体切开并修复，形成两个双链
重组体DNA，分别为：
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
片段重组体
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组
体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲
本DNA。
拼接重组体
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双
链区的两侧来自不同亲本DNA。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最
关键的是RecA蛋白、RecBCD复合物和RuvC蛋
白。
RecBCD复合物具有三种酶活性，即依赖于ATP
的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切
酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。
RecA蛋白可结合单链DNA（ ssDNA），形成
RecA-ssDNA复合物。
RuvC有内切酶活性，能专一性识别Holliday连
接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
内切酶
(recBCD)
DNA侵扰
(recA)
分支迁移
(recA)
内切酶
(recBCD)
DNA
连接酶
5´ 3´
5´
3´5´
3´
5´3´
5´ 3´
5´ 3´
5´3´
5´3´
5´ 3´
5´ 3´
5´3´
5´3´
5´
3´
5´ 3´
3´ 3´
5´3´
5´3´
3´5´
5´ 3´
5´3´
5´3´
Holliday中间体
5´ 3´
5´ 3´
5´3´
5´3´
Holliday中间体
5´ 3´
5´ 3´
5´3´
5´3´
5´
5´
3´
5´
5´
3´
3´
3´
3´
5´ 5´
5´5´
3´
3´
3´
3´
5´ 5´
5´
5´
3´
3´
3´
5´ 5´
5´
5´
3´
3´
3´
3´
5´ 5´
5´
5´
3´
3´
3´
3´
内切酶
(ruvC)内切酶
(ruvC)
DNA
连接酶
DNA
连接酶拼
接
重
组
体
片
段
重
组
体
目录
二、位点特异重组是发生在特异位点
间的DNA整合
位点特异重组(site-specific recombination)
是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异
位点间发生的整合。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染
色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录
病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒
cDNA的长末端重复序列 (long terminal
repeat, LTR)。
（一）λ噬菌体DNA的整合
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（二）细菌的特异位点重组
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
hix为反向重复序列，它们之间的H片段
可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。
H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基
因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因
表达，反向 (倒位 )时H2和rH1不表达。
rH1为H1的阻遏蛋白基因。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
H2鞭毛素
阻遏蛋白
Hin重组酶
转位片段
hin H2 I H1
H1鞭毛素
hin H2 I
DNA 启动序列
H1
启动序列
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（三）免疫球蛋白基因的重排
免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链
(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，
其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。
轻链的基因片段：
重链的基因片段：
L V J C
L V D J C
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基
因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片
段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧
均存在保守的重组信号序列(recombination
signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基
因rag (recombination activating gene)共有
两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC TGTTTTTGG
重组信号序列基因片段
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
免
疫
球
蛋
白
基
因
重
排
过
程
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
三、转座重组可使基因移位
由插入序列和转座子介导的基因移位或重
排称为转座(transposition)。
大多数基因在基因组内的位置是固定的，
但有些基因可以从一个位置移动到另一位
置。这些可移动的DNA序列包括插入序
列和转座子。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
插入序列(insertion sequences, IS)组成：
IR Transposase Gene IR
（一）插入序列转座
• 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列
• 特有的正向重复序列
• 一个转座酶（transposase)编码基因
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
插入序列发生转座的形式：
保守性转座(conservative transposition)
复制性转座(duplicative transposition)
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
插
入
序
列
的
复
制
性
转
座
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
转座子(transposons) ——可从一个染色体
位点转移到另一位点的分散重复序列。
IR IRTransposase Gene 有用基因
（二）转座子转座
转座子组成：
反向重复序列
转座酶编码基因
抗生素抗性等有用的基因
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
细菌的可流动性元件
A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)
B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因
C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
由转座子介导的转座
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
四、原核细胞可通过接合、转化和转导
进行基因转移或重组
（一）接合作用
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互
接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转
移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接
合作用(conjugation)。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
可接合质粒如 F 因子(F factor)
细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。
质粒
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（二）转化作用
通过自动获取或人为地供给外
源DNA，使细胞或培养的受体细胞
获得新的遗传表型，称为转化作用
(transformation)。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（三）转导作用
当病毒从被感染的（供体）细胞释放
出来、再次感染另一（供体）细胞时，发
生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移
及基因重组即为转导作用(transduction)。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
λ噬菌体的生活史
溶菌生长途径 (lysis pathway)
溶源菌生长途径 (lysogenic pathway)
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
第二节
重组DNA技术
Recombinant DNA Technology
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
重组DNA技术的发展史
1865年 的豌豆杂交试验。
1944年 的肺炎球菌转化实验。
1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。
1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传
工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的
药物。
1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。
1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
重组DNA技术相关概念
克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷
贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，
即无性繁殖。
DNA克隆
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
技术水平：分子克隆(molecular clone)
（即DNA 克隆）
细胞克隆
个体克隆（动物或植物）
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
其主要过程包括：在体外将目的DNA片段
与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，
形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、
扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。
重组DNA技术，又称分子克隆（molecular
cloning）或DNA克隆（DNA cloning）或基因工
程（genetic engineering）技术
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
目的：
① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA
② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
一、重组DNA技术中常用的工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
重组DNA技术中常用的工具酶
工 具 酶 功 能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二
酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ ①合成双链cDNA分子或片段连接；②缺口平移制作高比
活探针；③ DNA序列分析；④填补3末端
Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的
53聚合、35外切活性，而无53外切活
性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
反转录酶 ①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或
DNA序列分析
多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶 在3羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
目录
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
限 制 性 核 酸 内 切 酶 (restriction
endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别
双链DNA分子内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯
键。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G
+
Bam HⅠ
定义：
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
分类：
作用：
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。
命名：
Hin dⅢ
属 系 株 序
Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
切口 ：平端切口、粘端切口
GGGGAATTCCCC
CCCCTTAAGGGG
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
Bam HⅠ
GTC
CAG
G
CCTAG
GATCC
G
+
GGATCC
CCTAGG
HindⅡ
GTCGAC
CAGCTG
GAC
CTG+
平端切口 黏端切口
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全
相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，
称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配
伍末端(compatible end)。
Bam Bam HHⅠⅠ Bg Bg llⅡⅡ
GGATCC
CCTAGG
AGATCT
TCTAGA
G
CCTAG
GATCC
G
++ ++ATCTAG
GATCT
A
同尾酶
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
来源不同的限制酶，但能识别和切割
同一位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
Bam HⅠ
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
BstⅠ
同裂酶：
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
名 称 识别序列及切割位点 名 称 识别序列及切割点
切割后产生５’突出末端:
BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’
Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’
EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’
Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’
Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’
Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’
Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’
切割后产生3’突出末端:
Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’
Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’
Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’
Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’
Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’
切割后产生平末端:
Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’
EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’
Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’
Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’
Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’
限制性内切核酸酶
目录
二、重组DNA技术中常用的载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或
表达有意义的蛋白质所采用的一些
DNA分子。
载体按功能分为
克隆载体(cloning vector)
表达载体(expression vector)
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector)
为使插入的外源DNA序列可转录翻译成
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（一）克隆载体
至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制，
并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；
至少有一个选择标志（selection marker）：选择标志
是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性
基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因
等。
有适宜的RE的单一切点：载体中一般都构建有一段特异
性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，
可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multiple
cloning sites，MCS）。
1. 克隆载体应具备的基本特点
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（1）质粒 (plasmid)
特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些
遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 常用的克隆载体
细菌染色体外的小型
环状双链DNA分子。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
pUC18质粒载体图谱
目录
λ噬菌体DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
（2）噬菌体(phage)
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）
M13mp系列
pUC系列
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）
酵母人工染色体
(yeast artificial chromosome, YAC)
细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome, BAC)
动物病毒DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
（3）其他克隆载体
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（二）表达载体
表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因
的载体。
根据宿主细胞分为：
原核表达载体
真核表达载体
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
1. 原核表达载体
原核表达载体的基本组成
R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
2. 真核表达载体
真核表达载体的基本组成
OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；
TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
第三节
重组DNA技术基本原理
和操作步骤
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
基本原理
目的基因的获取
DNA导入受体细胞外源基因与载体的连接
克隆载体的选择和构建
重组体的筛选 克隆基因的表达
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
以
质
粒
为
载
体
的
DNA
克
隆
过
程
目录
（一）目的基因的分离获取——分
1. 化学合成法
要求：已知目的基因的核苷酸序列或
其产物的氨基酸序列 。
2. PCR法
3. 从基因组DNA文库中获取目的DNA
4. 从cDNA文库中获取目的DNA
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
5
Primer 1
5 Primer 2
Cycle 2
Cycle 1
5
5
5
5
5
5
Template DNA
2、PCR技术的工作原理
5
5
5
5
5 5
5 5
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
Cycle 3
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5
5
25～30 次循环后，模板DNA的含量
可以扩大100万倍以上。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
PCR技术原理示意图
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸
72˚C
退火
Tm-5˚C
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
• 模板DNA
• 特异性引物
• 耐热DNA聚合酶
• dNTPs
• Mg2+
PCR体系基本组成成分
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
•利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获
得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直
接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；
•利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得
序列相似的基因片段；
•利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆
基因。
PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
利用PCR技术可以随意设计引物在体
外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突
变等改造。
PCR技术高度敏感，对模板DNA的
量要求很低，是DNA和RNA微量分析的
最好方法。
（三）DNA和RNA的微量分析
（二）基因突变
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
将PCR技术引入DNA序列测定，使测序
工作大为简化，也提高了测序的速度；
待测DNA片段既可克隆到特定的载体后
进行序列测定，也可直接测定。
PCR与其他技术的结合可以大大提高基
因突变检测的敏感性 。
（四）DNA序列测定
（五）基因突变分析
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-
PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合
应用的一种技术。
RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因
以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分
析的最有效方法。
（一）逆转录PCR技术
几种重要的PCR衍生技术
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片
上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异
性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或
RNA是否在该组织或细胞中存在。
原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术
的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一
种最佳方法。
（二）原位PCR技术
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（三）实时PCR技术
实时PCR(real-time PCR)技术通过动态
监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积
对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
实时PCR技术原理
QR
3'
3'
5'
5'
上游
引物
下游
引物
荧光标记引物
R
Q
3'
3'
5'
5'
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
实时PCR分类：
实时PRC
非探针类
探针类
1. TaqMan探针法
2. 分子信标探针法
3. FRET探针法
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
图20-3 TaqMan探针法实时PCR原理示意图
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
组织或细胞染色体DNA
基因片断
克隆载体
重组DNA分子
含重组分子的转化菌
限制性内切酶
受体菌
基因组DNA文库
存在于转化细胞内
由克隆载体所携带的所
有基因组DNA的集合
从基因组DNA文
库获取目的基因
限制酶切位点
限制酶消化
除去中间片段
cos L R cos
cos L
左臂
R cos
右臂
真核生物染
色体DNA
限制酶部分消化
外源DNA与载体DNA混合
连接反应
体外包装
用重组噬菌体
感染大肠杆菌
~20 Kb DNA 片段
cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段
基因文库
用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库
mRNA
cDNA
双链cDNA
重组DNA分子
cDNA文库
反转录酶
载体
受体菌
复制
从cDNA文库获取目的基因
逆转录酶
A A A A
T T T T
AAAA
SI核酸酶
DNA聚合酶Ⅰ
碱水解
T T T T
目录
（二）载体的选择与构建——选
目的不同，操作基因的性质不同，载
体的选择和改建方法也不同。
目的：
① 获得某一目的基因或DNA片段
② 获得目的DNA片段所编码的蛋白质
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
载体 插入DNA片段 宿主细胞
质粒 <5~10kb 细菌，酵母
λ噬菌体载体 ~20kb 细菌
黏粒 ~50 kb 细菌
BAC ~400kb 细菌
YAC ~3 Mb 酵母
不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
（三）目的DNA与载体连接——接
方式：（1）单一相同黏端连接
（2）不同黏端连接
（3）通过其他措施产生黏端进行连接
1. 黏端连接
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
Bam HⅠ切割反应 GGATCC
CCTAGG
T4 DNA连接酶
15ºC
GATCC
G
G
CCTAG
+
目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割
重组体载体自连 目的基因自连
单
一
相
同
黏
端
连
接
不同黏端连接（定向克隆）
Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点
++
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
Eco RⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
T4 DNA连接酶
15ºC
重组体
目录
由平端加上新的酶切位点，再用限制
酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
人工接头(linker)连接
通过其他措施产生黏端进行连接
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
人
工
接
头
及
其
应
用
CCGAATTCG
GGCTTAAGC
5´-
3´-
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
在末端转移酶(terminal transferase) 的作
用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制
造出粘性末端，再进行粘端连接。
同聚物加尾连接
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
5´
3´
3´
5´
载体DNA
5´
3´
3´
5´
目的基因
限制酶或机械剪切 限制酶
5´
3´
3´
5´
5´
3´ T(T)nT
T(T)nT 3´
5´
5´
3´
3´
5´
3´ A(A)nA
A(A)nA 3´
5´
λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶
末端转移酶
+ dATP
末端转移酶
+ dTTP
T(
T) n
T
A(
A) n
A A(A
)
n A
T(T)
n T
T4 DNA连接酶
15ºC
重组体
5´
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
PCR法
针对目的DNA的5-和3-端，设计一对特异引物，
在每条引物的5-端分别加上不同的RE位点，然
后以目的DNA为模板，经PCR 扩增便可得到带有
引物序列的目的DNA，再用相应RE切割PCR产物，
产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化
载体进行有效连接。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
2. 平端连接
•限制性内切酶切割产生的平端
•粘端补齐或切平形成的平端
适用于：
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶
15ºC
重组体
载体自连 目的基因
自连
目录
3. 粘-平末端连接
黏-平末端连接是指目的DNA和载体之间通过一
端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。
属于定向克隆
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
受体菌条件：
安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent)
导入方式：
转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（四）重组DNA转入受体细胞——转
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选
(1) 利用抗生素抗性标志筛选
(2) 利用基因的插入失活/插入表达
特性筛选
(3) 利用标志补救筛选
(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选
（五）重组体的筛选与鉴定——筛
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
2. 序列特异性筛选
(1) RE酶切法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法
(4) DNA测序法
3. 亲和筛选法
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
插入失活筛选带有重组载体的克隆
α互补筛选（蓝-白筛选）
菌落或噬斑原位杂交筛选重组体
目录
重组DNA技术操作过程可形象归纳为：
小结
分 分离获取目的基因
选 载体的选择与构建
接 目的DNA与载体连接
转 重组DNA转入受体细胞
筛 重组体的筛选与鉴定
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
限制酶消化
开环载体DNA 目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
表达体系的建立：
表达载体的构建
受体细胞的建立
表达产物的分离纯化
（六）克隆基因的表达
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
标准：选择标志 强启动子
翻译调控序列 多接头克隆位点
表达体系的不足：
不宜表达真核基因组DNA；
不能加工表达的真核蛋白质；
表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion
body) ；
很难表达大量可溶性蛋白。
1. 原核表达体系 (表达体系最为常用)
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA
可适当修饰表达的蛋白质
表达产物分区域积累
缺点：操作技术难、费时、经济
转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程
方法：磷酸钙转染
DEAE葡聚糖介导转染
电穿孔
脂质体转染
显微注射
2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
第三节
重组DNA技术在医学中的应用
Application of Recombinant DNA
Technology in Medicine
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
目录
一、重组DNA技术广泛应用于生物制药
利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多
肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将
有望成为21世纪的支柱产业。
美国Eli Lilly公司于 1982年首先利用重组
DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着
生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有
50多种基因工程药物上市，近千种处于研发
状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生
了不可估量的社会效益和经济效益。
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
重组DNA医药产品
产 品 功 能
组织胞浆素原激活剂 抗凝
血液因子VIII 促进凝血
颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成
促红细胞生成素 剌激白细胞生成
生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化
生长素 治疗侏儒症
胰岛素 治疗糖尿病
干扰素( 1b, 2a, 2b, ) 抗病毒感染及某些肿瘤
白细胞介素 激活、剌激各类白细胞
超氧化物歧化酶 抗组织损伤
单克隆抗体
利用其结合特异性进行诊断试验、肿
瘤导向治疗
乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝
口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱
目录
二、重组DNA技术还应用于医学的其他
诸多方面
疾病相关基因的发现与鉴定
转基因和基因打靶
加速了人类基因组计划的完成
疾病的基因诊断和基因治疗
E:%5C%E6%95%99%E5%AD%A6%5C98%E6%9C%9F%E4%BA%94%E5%B9%B4%E5%88%B6%E6%95%B4%E5%90%-%E5%85%AB%E7%89%88%5CEighth%20version_PPT%5C%E5%90%8E%E5%8D%8A%E9%83%A8%E5%88%86%
