食品分析目录 前言 第一章 绪论 一、食品分析的性质和作用 二、食品分析的任务和内容 三、食品分析的学习方法 四、食品分析方法的选择与采用的标准 第二章 食品样品的采集与处理 第一节 样品的采集 一、样品的采集 二、样品的分类 三、采样的一般方法 四、采样要求与注意事项 第二节 样品的预处理 一、样品预处理的目的与要求 四、样品预处理的方法 第三章 食品的感官检验法 第一节 概述 一、感官检验的特点 二、检验的种类 三、感官检验的基本要求 第二节 感官检验常用方法 一、检验方法的选择和分类 二、常用的几种感官检方法 第四章 食品的物理检测法 第一节 概述 一、物理检测的意义 二、物理检验的内容与方法 第二节 物理检验的几种方法 一、相对密度法 二、折光法 三、旋光法 第三节 食品的物性测定 一、色度测定 二、粘度测定 三、质构测定 第五章 水分和水分活度的测定 第一节 概述 一、水分的存在状态 二、水分的测定方法 三、水分测定的意义 第二节 水分的测定 一、干燥法 二、蒸馏法
三、卡尔-费休（Karl-Fischer）法 四、其他方法 第三节 水分活度值的测定 一、水分活度值的测定意义 二、水分活度测定方法 第六章 灰分及几种重要矿物元素含量的测定 第一节 灰分的测定 一、概述 二、总灰分的测定 第二节 几种重要矿物元素的测定 一、概述 二、钙的测定 三、铁的测定 四、碘的测定 五、磷的测定 第七章 酸度的测定 第一节 概述 一、酸度的概念 二、酸度测定的意义 三、食品中有机酸种类与分布 第二节 酸度的测定 一、总酸度的测定 二、pH值的测定 三、挥发酸的测定 第三节 食品中有机酸的分离与定量 一、概述 二、有机酸的分离与定量方法简介 三、气相色谱法测定混合有机酸含量 四、高效液相色谱法 五、离子交换色谱法（羧酸分析仪） 六、酮酸的薄层色谱法 第八章 脂类的测定 第一节 概述 一、食品中的脂类物质和脂肪含量 二、脂类物质的测定意义 三、脂类的测定 第二节 脂类的测定方法 一、索氏提取法 二、酸水解法 三、罗紫－哥特里法 四、巴布科克法和盖勃氏法 五、其它方法简介 第三节 食用油脂几项理化特性的测定
一、酸价的测定 二、碘价的测定 三、过氧化值的测定四、皂化价的测定 五、羰基价的测定 第九章 糖类物质的测定 第一节 概述 一、糖类物质的定义和分类 二、食品中糖类物质的分布与含量 三、食品中糖类物质测定的意义 四、食品中糖类物质的测定方法 第二节 可溶性糖类的测定 一、可溶性糖类的提取和澄清 二、还原糖的测定 三、蔗糖的测定 四、总糖的测定 五、可溶性糖类的分离与定量 第三节 淀粉的测定 一、酸水解法 二、酶水解法 三、其它方法 四、淀粉其它性质的测定 第四节 粗纤维的测定 一、粗纤维的测定 二、不溶性膳食纤维的测定 第五节 果胶物质的测定 一、重量法 二、咔唑比色法 第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 二、复合蛋白质的显色反应 第三节 蛋白质的定量测定 一、凯氏定氮法 二、双缩脲法 三、紫外吸收法 四、福林-酚比色法 五、考马斯亮蓝染料比色法 六、染料结合法 七、水杨酸比色法 八、红外光谱法 九、4,4’-二羧基-2,2-联喹啉，BCA(Bicimchoninic Acid)法 十、比浊法 十一、杜马斯法（燃烧法）
第四节 蛋白质的末端测定 一、N-末端测定—丹磺酰化法 二、蛋白质及多肽C-末端测定及顺序分析（羧肽酶法） 第五节 氨基酸的定性测定 一、氨基酸的一般显色反应 二、个别氨基酸的显色反应 第六节 氨基酸定量测定 一、氨基酸的一般定量测定 二、个别氨基酸的定量测定 第七节 氨基酸的分离及测定 一、薄层色谱法 二、氨基酸自动分析仪法 三、气相色谱法 四、高效液相色谱法 第十一章 维生素的测定 第一节 概述 第二节 脂溶性维生素的测定 一、高效液相色谱法（HPLC）测定食物中维生素A、E的含量 二、比色法测定维生素A的含量 三、胡萝卜素的测定 四、维生素D的测定 第三节 水溶性维生素的测定 一、维生素B1的测定 二、维生素B2的测定 三、维生素B6的测定 四、维生素C的测定 第十二章 食品添加剂的测定 第一节 概述 一、食品添加剂的种类 二、食品添加剂的安全使用和管理 三、食品添加剂检测方法 第二节 几种甜味剂的检测 一、糖精钠的检测 二、其他几种重要甜味剂的检测 第三节 几种常用的防腐剂的检测 一、苯甲酸钠和山梨酸钾的检测 二、其他防腐剂的检测 第四节 发色剂的检测 一、亚硝酸盐的检测 二、硝酸盐的检测 第五节 漂白剂——二氧化硫及亚硫酸盐的检测 一、盐酸副玫瑰苯胺法 二、蒸馏法 三、离子色谱法
第六节 食用合成色素的检测 一、薄层层析法 二、高效液相色谱法 第十三章食品中限量元素的测定 第一节 概述 第二节 元素的提取与分离 一、鳌合萃取原理 二、鳌合反应与亲水性 三、萃取分离的基本原理 四、萃取平衡与条件 第三节 几种金属离子含量的测定 一、原子吸收分光光度法 二、溶剂萃取比色法 第四节 砷、硒、氟的测定 一、砷的测定 二、硒的测定 三、氟含量的测定 第十四章 食品中有害物质的检测 第一节 概论 一、有害物质与有毒物质的概念 二、食品中有害物质的种类与来源 三、加强食品中有害物质检测的必要性 第二节 食品中有害物质常用的检测方法 一、薄层色谱法 二、气相色谱法 三、高效液相色谱法 四、质谱法 五、色谱-质谱联用技术 六、酶联免疫吸附剂测定 第三节 食品中农药残留及其检测 一、有机氯农药残留及其检测 二、有机磷农药残留及其检测 三、氨基甲酸酯类农药残留及其检测 四、拟除虫菊酯类农药残留及其检测 第四节 食品中兽药残留及其检测 一、兽药残留的种类与危害 二、兽药残留检测举例 第五节 食品中霉菌毒素及其检测 一、霉菌毒素的种类 二、霉菌毒素的检测 第六节 食品中天然毒素及其检测 一、常见的动物性天然毒素 二、常见的植物性天然毒素 第七节 食品中源于包装材料的有害物质及其检测
一、主要的食品包装材料及其有害物的种类 二、食品包装材料中有害物质检测 第八节 食品加工过程中形成的有害物质及其检测 一、食品加工过程中形成的有害物质 二、该类有害物质的检测 第九节 食品中其他有害物质及其检测 一、食品中二恶英及其检测 二、食品中氯丙醇及其检测 第十五章 食品分析中的质量保证 第一节 分析数据的质量 一、误差 二、不确定度 三、误差和不确定度 四、如何提高分析结果的准确度，减少不确定度 第二节 分析测试中的质量保证 一、实验室内部质量保证 二、实验室外部质量保证 三、质量控制图 四、实验室认可 第十六章 实验方法评价与数据处理 第一节 实验方法评价 一、评价指标 二、实验结果的检验 第二节 实验数据处理 一、分析结果的表示 二、实验数据的处理 三、测定结果的校正
前 言 《食品分析》是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。自八十年代以来,先后由不同院校、不同编著者出版过不同版本的《食品分析》教材,这些教材带着当时的时代特点和各自不同的风格为食品科学与工程专业的人才培养做出过很大贡献,并总结出很多宝贵的经验。本教材由教育部高等学校食品科学与工程专业教学指导分委员会组织编写,以2002年在成都会议上审查通过的大纲为依据,在参考过去同类教材经验的基础上编写而成。 本教材的特色,在于突出了以教学为宗旨,着重培养学生的综合素质能力,提高教学效率及学生自学能力,大幅删减了以往教材中详细的试剂配制、繁琐的操作步骤等内容,强化了理论基础、方法选择和结果讨论。使得知识面增加,知识点突出,在内容上更加广泛,对于省略的操作步骤和试剂配制,教材中列出了资料出处,读者可方便地查找到原文,这也是区别教材与手册的地方。 鉴于社会对食品安全性的关注日益增强,本教材加大了食品安全性检测方面的内容,并加强了仪器分析的比重,尽量多地介绍一些先进食品设备在食品检测方面的应用。另一方面,由于美味可口是食品企业永远的追求目标,而评价食品风味最有效的方法仍为感官鉴评。本教材增加了这方面的可操作性内容。 本书重点介绍国家标准分析方法和国外先进分析方法。内容涉及食品营养成分、食品风味成分,限制性成分(如食品添加剂)、有害、有毒成分等的分析与检测,以及实验评价与数据处理等。 本书可供高等学校轻工食品类、食品质量与安全、商品检验、农副产品、粮食贮藏与加工等各专业或专业方向作为教材,也可供食品卫生检验、质量监督、各类食品企业等单位的有关科技人员参考。 本书由张水华任主编,钱和任副主编,参加编写的有：华南理工大学张水华(第一、二、三、十三章)，王启军(第十四章,)陈惠音(第八章,)刘耘(第十一章,)江南大学钱和(第五、十、十五章,)陕西科技大学许牡丹(第九、十二章,)大连轻工业学院云霞(第四章)郑州轻工业学院章银良(第六、七、十六章)。 本书在编写过程中,得到了许多同志的支持和帮助,华南理工大学食品学院的在读研究生任仙娥、聂雪梅、任艳艳为本书的文字图表处理做了大量工作,在此一并致谢。 限于编者的水平及时间关系,书中的不妥及错误之处,殷请读者批评指正。 编者 于广州
第一章 绪论 一、食品分析的性质和作用 近十年来,我国食品工业取得了高速发展,食品工业产值约占国内生产总值的十分之一,2002年已超过一万亿元。现在市场上食品货源充足,品种繁多,因此消费者在购买食品时有了很大的选择余地。他们比任何时候都更加关注食品的质量和安全,他们需要各种高质量、安全、富有营养、美味可口且有益健康的产品。为此,我国各级政府机构,特别是有关质量监督、卫生防疫、工商管理等部门投入了大量人力物力进行监控和管理,食品企业也作为自己最大的责任而进行着不懈的努力。消费者、食品企业、政府有关部门及国内外的法规均要求食品科学家监控食品组成,明确保证食品的质量、安全和品质。食品分析就是专门研究各种食品组成成分的检测方法及有关理论,进而评价食品品质的一门技术性学科。它的作用是不言而喻的。 二、食品分析的任务和内容 食品分析工作是食品质量管理过程中一个重要环节,在确保原材料供应方面起着保障作用,在生产过程中起着“眼睛”的作用,在最终产品检验方面起着监督和标示作用。食品分析贯穿于产品开发、研制、生产和销售的全过程。作为分析检验工作者,应根据待测样品的性质和项目的特殊要求选择合适的分析方法,分析结果的成功与否取决于分析方法的合理选择、样品的制备、分析操作的准确、以及对分析数据的正确处理和合理解释。而要正确地做到这一切,必须有赖于食品分析工作者有坚实的理论基础知识,对分析方法的全面了解,熟悉各种法规、标准和指标,还有熟练的操作技能和高度的责任心。 食品分析常涉及到以下这些内容 1、食品安全性检测 它包括对食品添加剂合理使用的监督,食品中限量或有害元素含量,各种农药、畜药残留,环境污染物,来自包装材料中的有害物,微生物污染,食品加工中形成的有害物质,以及食品材料中固有的某些有毒有害物等。 2、食品中营养组分的检测 它包括常见的六大营养要素,以及为食品营养标签所要求的所有项目。按照食品标签法规要求,所有的食品商品标签上都应注明该食品的主要配料表、营养要素和热量。对于那些保健食品或功能食品,还须有其特殊成分的含量及介绍。营养成分的分析是食品分析的经常性项目和主要内容。 3、食品品质分析或感官检验 食品的理化指标和卫生指标,保证了食品的安全性及提供了消费者根据自己的需求选择合适的营养指标的参考意见,然而,对于广大的普通消费者,他们选择食品的首要标准仍然是是否美味可口。尽管目前已开发出先进的电子鼻、电子舌等先进仪器,但始终代替不了人的感觉器官,最可靠、直接、快速的食品品质分析仍是人的食品感官鉴评技术。食品的感官检验往往是食品检验各项检验内容的第一项,如果食品感官检验不合格,即可判定该产品不合格,不需再进行理化检验。食品质量标准中都制定有相应的感官指标。 三、食品分析的学习方法 现代分析技术的发展带来食品分析检测技术的革命,尤其是计算机、自动化技术的广泛应用,有可能将科学工作者从烦闷的重复性、枯燥性工作中解放出来,让头脑有更多的时间和精力去思考深层的问题。例如,过去用生物法做一个维生素含量检测,费时十几天,现在用计算机控制的高效液相色谱法在几十分钟之内就可报告出分析测试结果。然而发展总是逐步且不平衡的。现代分析仪器的应用是在经典的化学分析的基础上发展起来的。作为教学,学生仍然需要懂得这些现代分析技术的建立基础,以及将来的发展方向和可以改进的地方。 学习本课程必须首先认真掌握分析检验的基础理论、仪器分析的原理,以及相关的物理、化学、生物化学等基础知识,然后根据食品分析的特殊性,把理论与实践相结合,正确掌握实验操作技能和方法,才能成为既懂理论又能熟练进行实际操作的科技工作者。
四、食品分析方法的选择与采用的标准 食品分析方法的选择通常要考虑到样品的分析目的,分析方法本身的特点,如专一性、准确度、精密度、分析速度、设备条件、成本费用、操作要求等,以及方法的有效性和适用性。用于生产过程指导或企业内部的质量评估,可选用分析速度快、操作简单、费用低的快速分析方法,而对于成品质量鉴定或营养标签的产品分析,则应采用法定分析方法。采用标准的分析方法,利用统一的技术手段,对于比较与鉴别产品质量,在各种贸易往来中提供统一的技术依据,提高分析结果的权威性有重要的意义。 我国的法定分析方法有中华人民共和国国家标准BG()、行业标准和地方标准等。其中国家标准为仲裁法。对于国际间的贸易,采用国际标准则具有更有效的普遍性 （一） 国际标准(international standard) 国际标准是指国际标准化组织（ISO）、国际电工委员会（IEC）和国际电信联盟（ITU）所制定的标准，以及经ISO认可并收入《国际标准题内关键词索引（KWIC Index）》之中的标准。国际标准对各国来说可以自愿采用，没有强制的含义，但往往因为国际标准集中了一些先进工业国家的技术经验，加之各国考虑外贸上的原因，从本国利益出发也往往积极采用国际标准。 《国际标准题内关键词索引》收录包括ISO、IEC及其他27个国际组织所制定的且经ISO认可的各类标准，是ISO为促进《关贸总协定(GATT)/贸易技术壁垒协议(TBT)》的贯彻实施而出版的。1989年KWIC索引（第二版）共收录了ISO与IEC制定的800个标准，以及其他27个国际组织的1200多条标准。这些国际组织中与食品质量安全有关的组织主要有国际标准化组织（ISO）、世界卫生组织（WHO）、食品法典委员会（CAC）、国际制酪业联合会（IDF）、国际辐射防护委员会（ICRP）、国际葡萄与葡萄酒局（IWO）。其中CAC所编写的食品法典内容包含：食品产品标准；卫生或技术规范；农药残留限量；污染物准则；农药检测；兽药检测；食品添加剂检测。食品法典已成为全球食品消费者、食品生产者、各国食品管理机构和国际食品贸易最重要的基本参照标准。 其他未列入《国际标准题内关键词索引》的国际组织所制定的某些标准也被国际公认，比如国际电信联盟（ITU）、万国邮政联盟（UPU）、联合国粮农组织（UNFAO）、国际种子检验协会（SEMI）。 （二）国际先进标准 国际先进标准是指国际上有权威的区域标准(regional standard)，世界上主要经济发达国家的国家标准(national standard)和通行的团体标准，包括知名跨国企业标准在内的其他国际上公认先进的标准。 1、国际上有权威的区域标准主要有：欧洲三大标准化组织，即欧洲标准化委员会（CEN）、欧洲电工标准化委员会（CENELEC）、欧洲电信标准化协会（ETSI）；亚洲大洋洲开放系统互联研讨会（AOW）；亚洲电子数据交换理事会（ASEB）等制定的标准。其中欧洲标准化委员会（CEN），始创于1961年，现在由欧盟（EU）15个成员国及欧洲自由贸易协会（EFTA）4个成员国及另外3个中欧及东欧国家等22个国家的国家标准局为主体，另外还有8个欧洲组织和2个顾问机构共同构成。CEN、CENELEC、ETSI所制定或采用的标准通称为欧洲标准（EN），CEN、CENELEC、ETSI也是欧盟标准的源组织。 2、世界经济技术发达国家的国家标准主要指美国（ANS）、德国（DIN）、英国（BS）、法国（NF）、瑞典（SIS）、瑞士（SNV）、意大利（UNI）、俄罗斯（TOCTP）、日本（日本工业标准，JIS）等9个国家的国家标准。随着欧洲联盟的发展和欧洲统一市场的完善，如德、法等欧盟国家标准有逐步被欧洲标准EN取代的趋势。 （三）国际AOAC(AOAC INTERNATIONAL) 国际AOAC不属于标准化组织，但它所记载的分析方法在在国际上有很大的参考价值，故
在此一并简介如下。国际AOAC是世界性的会员组织，其宗旨在于促进分析方法及相关实验室品质保证的发展及规范化。其前身是始创于1885年的美国官方农业化学家协会（Association of Official Agricultural Chemists，AOAC）。美国官方农业化学家协会于1965年更名为美国官方分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists），1991年又更名为AOAC INTERNATIONAL，而此处的AOAC代表的是“分析团体协会”（Association of Analytical Communities）。上海市标准化研究院(SIS)收藏有AOAC INTERNATIONAL全套29种资料，其中与食品分析方法密切相关的包括：《官方分析方法》（Official Methods of Analysis，OMA）、《食品分析方法》（Food Analysis）、《US EPA杀虫剂化学方法手册》（US EPA Manual of Chemical Methods for Pesticides）、《农用抗生素的化学分析方法》（Chemical Analysis for Antibiotics Used in Agriculture）、《农业化学制品免疫测定的新前沿》（New Frontiers in Agrochemical Immunoassay）、《营养成分微生物分析法》（Methods for the Microbiological Analysis of Nutrient）、《无机污染物的分析技术》（Analytical Techniques for Inorganic Contaminants）等。 (四) 国际标准化发展趋势 1. 标准国际化。标准国际化是WTO、ISO、EU等国际组织和美国、日本等发达国家标准发展战略的重中之重。EU标准发展战略强调要进一步扩大欧洲标准化体系的参加国（现有19个国家，预计到2010年发展到25个国家），要统一在国际标准化组织中进行标准化提案，要在国际标准化活动中形成欧洲地位，加强欧洲产业在世界市场上的竞争力。美国和日本等发达国家也均把确保标准的市场适应性、国际标准化战略、标准化政策和研究开发政策的协调、实施，作为标准化战略的重点。目前，EU在国际标准化舞台上具有绝对的优势，美、日和EU相比，尚处于劣势。 2. 突出重点课题和重点领域。美国和加拿大将健康、安全、环境、贸易、产业等方面的标准化作为标准发展的重点领域；日本则将信息技术、环境保护等方面的17个标准化课题放在标准发展的重点领域上。 3. 科技开发与标准化政策统一协调。美国对ANSI举办的国际标准化活动提供财政支持，计量测试领域的专家，参加国内、国际标准化活动，科研人员参加标准化活动和参加标准制订情况均作为业绩考核的一个指标。日本在2000年4月制定的"国家产业技术总体战略"中提出，要最大限度地普及和应用科技成果的观点，把标准化作为连接新技术与市场的工具，强调以标准化为目的的研究开发的重要性，日本也规定科研人员参加标准化活动的水平纳入个人业绩进行具体考核。 4. 积极培养国际标准化人才。发达国家为了有效推进国际标准活动，注重培养不仅熟悉ISO/IEC国际标准审议规则并具有专业知识的人才。通过“技术管理”（MOT）的研究和教育是造就这样人才的途径之一。MOT比MBA增加了很多技术要素。在美国，设MOT硕士课程的院校已超过100所，欧洲和亚洲各国近年也加快了创建这种院校的步伐。我国清华大学的MOT教育处于中国乃至亚洲领先地位，属于世界的前列。 思考题： 1、作为食品分析工作者应具备哪些方面的知识？ 2、要想得到正确的分析结果,需要正确势利哪些步骤？ 3、选用合适的分析方法需要考虑哪些因素？比较国家标准、国际标准和国际先进标准之间 的关系与有效性。 (张水华 )
第二章 食品样品的采集与处理 第一节 样品的采集 一、样品的采集 分析检验的第一步就是样品的采集，从大量的分析对象中抽取有代表性的一部分作为分析材料（分析样品），这项工作称为样品的采集，简称采样。 采样是一个困难而且需要非常谨慎的操作过程。要从一大批被测产品中，采集到能代表整批被测物质质量的小量样品，必须遵守一定的规则，掌握适当的方法，并防止在采样过程中，造成某种成分的损失或外来成分的污染。 被检物品的状态可能有不同形态，如固态的，液态的或固液混合的等等。固态的可能因颗粒大小、堆放位置不同而带来差异；液态的可能因混合不均匀，或分层而导致差异，采样时都应予以注意。 正确采样，必须遵循的原则是：第一，采集的样品必须具有代表性；第二，采样方法必须与分析目的保持一致；第三，采样及样品制备过程中设法保持原有的理化指标，避免预测组分发生化学变化或丢失；第四，要防止和避免预测组分的玷污；第五，样品的处理过程尽可能简单易行，所用样品处理装置尺寸应当与处理的样品量相适应。 采样之前，对样品的环境和现场进行充分的调查是必要的，需要弄清的问题有这些： 1.采样的地点和现场条件如何？ 2.样品中的主要组分是什么，含量范围如何？ 3.采样完成后要做哪些分析测定项目？ 4.样品中可能会存在的物质组成是什么？ 样品采集是食品分析工作中的重要环节，不合适的或非专业的采样会使可靠正确的测定方法得出错误的结果。 二、样品的分类 按照样品采集的过程，依次得到检样、原始样品和平均样品三类。 检样：由组批或货批中所抽取的样品称为检样。检样的多少，按该产品标准中检验规则所规定的抽样方法和数量执行。 原始样品：将许多分检样综合在一起称为原始样品。原始样品的数量是根据受检物品的特点、数量和满足检验的要求而定。 平均样品：将原始样品按照规定方法经混合平均，均匀的分出一部分，称为平均样品。从平均样品中分出三份，一份用于全部项目检验；一份用于在对检验结果有争议或分歧时作复检用，称作复检样品；另一份作为保留样品，需封存保留一段时间（通常一个月），以备有争议时再作验证，但易变质食品不作保留。 三、采样的一般方法 样品的采集一般分为随机抽样和代表性取样两类。随机抽样，即按照随机原则，从大批物料中抽取部分样品。操作时，应使所有物料的各个部分都有被抽到的机会。代表性取样，是用系统抽样法进行采样，根据样品随空间（位置）、时间变化的规律，采集能代表其相应部分的组成和质量的样品，如分层取样、随生产过程流动定时取样、按组批取样、定期抽取货架商品取样等。 随机取样可以避免人为倾向，但是，对不均匀样品，仅用随机抽样法是不够的，必须结合代表性取样，从有代表性的各个部分分别取样，才能保证样品的代表性。 具体的取样方法，因分析对象的不同而异。对于粮食、油料类物品，由原始样品充分混合均匀，进而分取平均样品或试样的过程，称为分样。分样常用的方法有“四分法”和自动机械式，见图2-1、2-2。粮食、油料的检验程序和试样用量见图2-3。
图12-四分法取样图解 图2-2 机械式分样器 1－漏斗 2－漏斗开关 3－圆锥体 4－分样格 5、6－接样斗 7－支架 图2-3 粮、油检验程序和试样用量的规定 四、采样要求与注意事项 为保证采样的公正性和严肃性，确保分析数据的可靠，国家标准《食品卫生检验方法理化部分总则》（ /BTG09150.）对采样过程提出了以下要求，对于非商品检验场合，也可供参考。 1.采样必须注意生产日期、批号、代表性和均匀性（掺伪食品和食物中毒样品除外）。采集的数量应能反映该食品的卫生质量和满足检验项目对样品量的需要，一式三份，供检验、复验、备查或仲裁，一般散装样品每份不少于。 2.采样容器根据检验项目，选用硬质玻璃瓶或聚乙烯制品。
3.外埠食品应结合索取卫生许可证、生产许可证及检验合格证或化验单，了解发货日期、来源地点、数量、品质及包装情况。如在食品厂、仓库或商店采样时，应了解食品的生产批号、生产日期、厂方检验记录及现场卫生情况，同时注意食品的运输、保存条件、外观、包装容器等情况。要认真填写采样记录，无采样记录的样品不得接受检验。 4.液体、半流体食品如植物油、鲜乳、酒或其他饮料，如用大桶或大罐盛装者，应先充分混匀后再采样。样品分别盛放在三个干净的容器中。 5.粮食及固体食品应自每批食品上、中、下三层中的不同部位分别采取部分样品，混合后按四分法得到有代表性的样品。 6.肉类、水产等食品应按分析项目要求分别采取不同部位的样品或混合后采样。 7.罐头、瓶装食品或其他小包装食品，应根据批号随机取样，同一批号取样件数，25g0以上的包装不得少于6个，205g以下的包装不得少于01个。 8.掺伪食品和食品中毒的样品采集，要具有典型性。 9.检验后样品的保存，一般样品在检验结束后，应保留一个月以备需要时复检。易变质食品不予保留。检验取样一般皆指取可食部分，以所检验的样品计算。 10.感官不合格产品不必进行理化检验，直接判为不合格产品。 第二节 样品的预处理 一、样品预处理的目的与要求 在食品分析中，由于食品或食品原料种类繁多，组成复杂，而且组分之间往往又以复杂的结合形式存在，常对直接分析带来干扰。这就需要在正式测定之前，对样品进行适当处理，使被测组分同其他组分分离，或者使干扰物质除去。有些被测组分由于浓度太低或含量太少，直接测定有困难，这就需要将被测组分进行浓缩，这些过程称作样品的预处理。而且，食品样品中有些预测组分常有较大的不稳定性（例如微生物的作用、酶的作用或化学活性等），需要经过样品的预处理才能获得可靠的测定结果。样品预处理的原则是：①消除干扰因素；②完整保留被测组分；③使被测组分浓缩。 二、样品预处理的方法 样品预处理的方法，应根据项目测定的需要和样品的组成及性质而定。在各项目的分析检验方法标准中都有相应的规定和介绍。常用的方法有以下几种。 （一）有机物破坏法 在测定食品或食品原料中金属元素和某些非金属元素如砷、硫、氮、磷等的含量时常用这种方法。这些元素有的是构成食物中蛋白质等高分子有机化合物本身的成分，有的则是因受污染而引入的，并常常与蛋白质等有机物紧密结合在一起。在进行检验时，必须对样品进行处理，使有机物在高温或强氧化条件下破坏，被测元素以简单的无机化合物形式出现，从而易被分析测定。 有机物破坏的方法，可分为干法灰化法和湿法消化法两大类，各类方法又因原料的组成及被测元素的性质不同可有许多不同的操作条件，选择的原则应是： （1） 方法简便，使用试剂越少越好。 （2） 方法耗时间越短，有机物破坏越彻底越好。 （3） 被测元素不受损失，破坏后的溶液容易处理，不影响以后的测定步骤。 1.干法灰化法 样品在坩埚中，先小心炭化，然后再高温灼烧（05~060℃），有机物被灼烧分解，最后只剩下无机物（无机灰分）的方法。 为了缩短灰化时间，促进灰化完全，防止有些元素的挥发损失，常常向样品中加入硝酸、过氧化氢等灰化助剂，这些物质在灼烧后完全消失，不增加残灰的质量，可起到加速灰化的
作用。有时可添加氧化镁、碳酸盐、硝酸盐等助剂，它们与灰分混杂在一起，使碳粒不被覆盖，但应做空白试验。 干法灰化法的优点是有机物破坏彻底，操作简便，使用试剂少，适用于除砷、汞、铅等以外的金属元素的测定，因为由于灼烧温度较高，这几种金属容易在高温下挥发损失。 2.湿法消化法 在强酸、强氧化并加热的条件下，有机物被分解，其中的C、H、O等元素以CO、HO22等形式挥发逸出，无机盐和金属离子则留在溶液中。湿法消化所用的试剂有：硫酸、硫酸——硝酸、高氯酸——硝酸——硫酸、高氯酸——硫酸、硝酸——高氯酸等。在整个消化过程中，都在液体状态下加热进行，故称为湿法消化。 湿法消化的特点是加热温度较干法低，减少了金属挥发逸散的损失。但在消化过程中，产生大量有毒气体，操作需在通风柜中进行，此外，在消化初期，产生大量泡沫易冲出瓶颈，造成损失，故需操作人员随时照管，操作中还应控制火力注意防爆。 湿法消化耗用试剂较多，在做样品消化的同时，必须做空白试验。 近年来，高压消解罐消化法得到广泛应用。此法是在聚四氟乙烯内罐中加入样品和消化剂，放入密封罐内并在011~052℃烘箱中保温数小时。此法克服了常压湿法消化的一些缺点，但要求密封程度高，高压消解罐的使用寿命有限。 3.紫外光分解法 也是一种消解样品中的有机物从而测定其中的无机离子的氧化分解法。紫外光由高压汞灯提供，在（85±5）℃的温度下进行光解。为了加速有机物的降解，在光解过程中通常加入双氧水。光解时间可根据样品的类型和有机物的量而改变。Bnduil PL等报导了测定植物--2-3-+22++22+样品中的Cl、Br、OS、OP、dC、Cu、Zn、Co等离子时，称取g53000m~磨碎44或匀化的样品置于石英管中，加入L1~2m双氧水（30%）后，用紫外光光解i6n01~2m即可将其完全光解。 4.微波消解法 微波消解法（icrowavem—deiosgtni）是一种利用微波为能量对样品进行消解的新技术，包括溶解、干燥、灰化、浸取等，该法适于处理大批量样品及萃取极性与热不稳定的化合物。微波消解法以其快速、溶解用量少、节省能源、易于实现自动化等优点而广泛应用。已用于消解废水、废渣、淤泥、生物组织、流体、医药等多种试样，被认为是“理化分析实验室的一次技术革命”。美国公共卫生组织已将该法作为测定金属离子时消解植物样品的标准方法。 日立公司、美国的CEM公司等已有多种型号的微波消解仪生产。amneY等人报导了用微波消解法测定大米粉样品中的bP、Cd、nM时，用硝酸及盐酸的混合液为消化液，其做法是：称取g300m样品于AFoenPflT消解容器内，加入ON2HLm及 （二）蒸馏法 此法是利用被测物质中各组分挥发性的不同来进行分离的方法。可以用于除去干扰组分，也可用于被测组分的抽提。例如测定样品中挥发性酸含量时，可用水蒸气蒸馏样品，将馏出的蒸汽冷凝，测定冷凝液中酸的含量即为样品中挥发性酸含量。根据样品中待测定成分性质的不同，可采用常压蒸馏、减压蒸馏、水蒸气蒸馏等蒸馏方式。近年来已有带微处理器的自动控制蒸馏系统，使分析人员能够控制加热速度、蒸馏容器和蒸馏头的温度及系统中的冷凝器和回流阀门等，使蒸馏法的安全性和效率得到很大提高。
（三）溶剂抽提法 此法是使用无机溶剂如水、稀酸、稀碱溶液，或有机溶剂如乙醇、乙醚、石油醚、氯仿、丙酮等，从样品中抽提被测物质或除去干扰物质，是常用的处理食品样品的方法。 被提取的样品，可以是固体或液体。用溶剂浸泡固体样品，抽提其中的溶质，习惯上称为浸提，例如用水浸提固体原料中的糖分，用石油醚浸提肉制品中的油脂等。用溶剂提取与它互不相溶或部分相溶的液体样品中的溶质，称为萃取。例如，饮料中糖精钠、苯甲酸的含量测定时，用乙醚（酸性条件下）萃取出饮料中的糖精钠或苯甲酸后，再挥发除去溶剂，最后用层析法或比色法测定。 经典的抽提方法有振荡浸提法、索氏抽提法和连续液-液萃取法等。加速溶剂提取（ESA）是一种全新的处理固体和半固体样品的方法，该法是在较高的温度（00025~℃）和压力（M12p360a~.）下用有机溶剂萃取样品。它的突出优点是有机溶剂用量少（1g样品仅需溶剂）、快速（约in15m）和回收率高，已成为样品前处理最佳方式之一，广泛用于环境、药物、食品和高聚物等样品的前处理，特别是农残的分析。市面已有加速溶剂萃取仪商品供应。 超临界流体萃取（EFS）是02世纪07年代开始用于工业生产中有机化合物萃取的，它是用超临界流体（最常用的是CO）作为萃取剂，从各组分复杂的样品中，把所需要的组分2分离提取出来的一种分离提取技术。已有人将其用于色谱分析样品处理中，也可以与色谱仪器实现在线联用，如CG-EFS、-CELFPSH和SM-EFS等。 微波萃取（MAE）是一种萃取速度快、试剂用量少、回收率高、灵敏以及易于自动控制的新的样品制备技术，可用于色谱分析的样品制备。特别是从一些固态样品，如蔬菜、粮食、水果、茶叶、土壤以及生物样品中萃取六六六、TDD等残留农药。 (四)色层分离法 色层分离法又称色谱分离法，是一种在载体上进行物质分离的一系列方法的总称。根据分离原理的不同，可分为吸附色谱分离、分配色谱分离和离子交换色谱分离等。 1.吸附色谱分离 利用聚酰胺、硅胶、硅藻土、氧化铝等吸附剂经活化处理后所具有的适当的吸附能力，对被测成分或干扰组分进行选择性吸附而进行的分离称吸附色谱分离。例如：聚酰胺对色素有强大的吸附力，而其他组分则难于被其吸附，在测定食品中色素含量时，常用聚酰胺吸附色素，经过过滤洗涤，再用适当溶剂解吸。可以得到较纯净的色素溶液，供测试用。 2.分配色谱分离 此法是以分配作用为主的色谱分离法。是根据不同物质在两相间的分配比不同所进行的分离。两相中的一相是流动的（称流动相），另一相是固定的（称固定相）。被分离的组分在流动相中沿着固定相移动的过程中，由于不同物质在两相中具有不同的分配比，当溶剂渗透在固定相中并向上渗展时，这些物质在两相中的分配作用反复进行，从而达到分离的目的。例如，多糖类样品的纸上层析。 3.离子交换色谱分离 离子交换色谱分离法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的方法。分为阳离子交换和阴离子交换两种。交换作用可用下列反应式表示： +- 阳离子交换：M+H-RX XH+M-R=+- 阴离子交换：M+HO-RX HOM+X-R= 式中：R―离子交换剂的母体 MX―溶液中被交换的物质 当将被测离子溶液与离子交换剂一起混合振荡，或将样液缓慢通过离子交换剂时被测+-离子或干扰离子留在离子交换剂上，被交换出的H或OH，以及不发生交换反应的其他
物质留在溶液内，从而达到分离的目的。在食品分析中，可应用离子交换剂分离法制备无氨水、无铅水。离子交换剂分离法还常用于较为复杂的样品。 （五）化学分离法 1.磺化法和皂化法 磺化法和皂化法是除去油脂的一种方法，常用于农药分析中样品的净化。 (1)硫酸磺化法 本法是用浓硫酸处理样品提取液，能有效地除去脂肪、色素等干扰杂质。其原理是浓硫酸能使脂肪磺化，并与脂肪和色素中的不饱和键起加成作用，形成可溶于硫酸和水的强极性化合物，不再被弱极性的有机溶剂所溶解，从而达到分离净化的目的。此法简单、快速、净化效果好，但仅适用于对强酸稳定的被测组分的分离。如用于农药分析时，仅限于在强酸介质中稳定的农药（如有机氯农药中六六六、DDT）提取液的净化，其回收率在80％以上。 (2)皂化法 本法是用热碱溶液处理样品提取液，以除去脂肪等干扰杂质。其原理是利用氢氧化钾－乙醇溶液将脂肪等杂质皂化除去，以达到净化目的。此法仅试用于对碱稳定的组分，如维生素A、D等提取液的净化。 2.沉淀分离法 沉淀分离法是利用沉淀反应进行分离的方法。在试样中加入适当的沉淀剂，使被测组分沉淀下来，或将干扰组分沉淀下来，经过过滤或离心将沉淀于母液分开，从而达到分离目的。例如：测定冷饮中糖精钠含量时，可在试剂中加入碱性硫酸铜，将蛋白质等干扰杂质沉淀下来，而糖精钠仍留在试液中，经过滤除去沉淀后，取滤液进行分析。 3.掩蔽法 此法是利用掩蔽剂与样液中干扰成分作用，使干扰成分转变为不干扰测定状态，即被掩蔽起来。运用这种方法可以不经过分离干扰成分的操作而消除其干扰作用，简化分析步骤，因而在食品分析中应用十分广泛，常用于金属元素的测定。如双硫腙比色法测定铅时，在测2+2+定条件（pH＝9）下，CuCd/等离子对测定有干扰。可加入氰化钾和柠檬酸铵掩蔽，消除它们的干扰。 （六）浓缩法 食品样品经提取、净化后，有时净化液的体积较大，在测定前需进行浓缩，以提高被测成分的浓度。常用的浓缩方法有常压浓缩法和减压浓缩法两种。 1.常压浓缩法 此法主要用于待测组分为非挥发性的样品净化液的浓缩，通常采用蒸发皿直接挥发；若要回收溶剂，则可用一般蒸馏装置或旋转蒸发器。该法简便、快速，是常用的方法。 2.减压浓缩法 此法主要用于待测组分为热不稳定性或易挥发的样品净化液的浓缩，通常采用D-K浓缩器。浓缩时，水浴加热并抽气减压。此法浓缩温度低、速度快、被测组分损失少，特别适用于农药残留量分析中样品净化液的浓缩。 思考题： 1、 采样之前应做那些准备？如何才能做到正确采样？ 2、 了解样品的分类及采样时应注意的问题。 3、 为什么要对样品进行预处理？选择预处理方法的原则是什么？ 4、 常用的样品预处理方法有哪些？各有什么优缺点？ （张水华）
第三章 食品的感官检验法 第一节 概述 一、感官检验的特点 食品的感官检验是通过人的感觉——味觉、嗅觉、视觉、触觉，对食品的质量状况作出客观的评价。也就是通过眼观、鼻嗅、口尝、耳听以及手触等方式，对食品的色、香、味、体进行综合性鉴别分析，最后以文字、符号或数据的形式作出判评。 食品质量的优劣最直接地表现在它的感官性状上，通过感官指标来鉴定食品的优劣和真伪，不仅简单易行，而且灵敏度高，直观准确，可以克服化学分析和仪器分析方法的许多不足。人的感官是十分有效而敏感的综合检验器，也是一种择食本能和自我保护的最原始方法，消费者常凭感官鉴别来作出对某种食品是否接受的最终判断。如果人体的感官器官正常，又熟悉有关食品质量的基本知识，掌握了各类食品质量感官鉴别方法，就能在生活和工作中，正确选购食品或食品原料，并辨别出其质量的优劣。 感官检验是一种科学的方法。包括组织、测量、分析和评价等过程。它是基于建立一套合理的程序，例如应在一定的控制条件下制备和处理样品，以随机数编号，并以不同的顺序提供给鉴评员，通过鉴评员按照产品质量的不同用定量的数据予以测量和记录，然后用统计的方法来分析所得数据，最后作出合理的评判的过程。 食品质量感观检验可在专门的感观分析实验室进行，也可在评比、鉴定会现场、甚至购物现场进行。由于它的简单易行，可靠性高，实用性强，目前已被国际上普遍承认和采用，并已日益广泛地应用于食品质量检查、原材料选购、工艺条件改变、食品的贮藏和保鲜、新产品开发、市场调查等许多方面。 感官检验方法主要来自于行为研究的方法，是通过观察和测量人的反应的方式的一种心理过程。感官由感觉细胞或一组对外界刺激有反应的细胞组成，这些细胞获得刺激后，能将这些刺激信号通过神经传导到大脑。感官的主要特征，是对周围环境和机体内部的化学和物理变化非常敏感。除此之外，感官还具有下面几个特征：(1)一种感官只能接受和识别一种刺激；（2）只有刺激量在一定范围内才会对感官产生作用；（3）某种刺激连续施加到感官上一段时间后，感官会产生疲劳（适应）现象，感官灵敏度随之明显下降；（4）心理作用对感官识别刺激有影响；（5）不同感官在接受信息时，会相互影响。 人类具有多种感觉，其中视觉、听觉、触觉、嗅觉和味觉是五种基本感觉。此外能够辨认的还有温觉、痛觉、疲劳等多种。 二、检验的种类 按检验时所利用的感官器官，感官检验可分为视觉检验、嗅觉检验、味觉检验和触觉检验。 （一） 视觉检验 食品的色泽是人们评价食品品质的一个重要因素。不同的食品显现着各不相同的颜色，并常与该食物的成熟程度或煮熟程度相联系，与香气和风味的变化有关。食物的颜色对人的心理影响是显而易见的。有人发现，在给糖浆甜度打分时，即使深色蔗糖溶液
的蔗糖含量比浅色蔗糖溶液的含量低1％，但前者的甜度打分可能会高出后者20%%-1。Maag（1794）发现黄色溶液的甜味阈值要明显高于无色溶液，而绿色溶液的甜味阈值却又明显低于无色溶液。绿色和黄色溶液比无色溶液相比，有较高的苦味阈值。可能认为，绿色和黄色容易与“未成熟的水果”联系起来，并因此认为该溶液甜味较低，从而需要更多的甜味来达到甜味阈值。 视觉检验包括观看产品的外观形态和颜色特征。产生视觉的刺激物质是光波，只有波长在308－708nm范围内的光波才能被人眼所接受。当可见光聚焦于人眼视网膜时，感光细胞接受光刺激，产生讯号。感光细胞中最重要的有锥体细胞和杆体细胞，它们分别执行着不同的视觉功能，前者是明视觉器官，在光亮条件下，能够分辨颜色和物体的细节，后者是暗视觉器官，只能在较暗条件下起作用，适用于微光视觉，但不能分辨颜色与细节。 颜色有三个属性：明度、色调和饱和度。人眼也只能观察物体颜色的这三个属性。正常的锥体细胞中含有三种感光色素，每一种分别对红、绿或蓝光最为敏感，如果缺乏这些色素中的任何一种，人就会患有各种色盲症。食品感官检验员不应有色盲病症。 （二）嗅觉检验 食品的正常气味是人们是否能够接受该食品的一个决定因素。食品的气味常与该食物的新鲜程度、加工方式、调制水平有很大关联。 人的嗅觉非常灵敏，用仪器分析的方法不一定能检查出来极轻微的变化，用嗅觉鉴别却能够发现。如鱼、肉等食品或食品材料发生轻微的腐败变质时，其理化指标变化不大，但灵敏的嗅觉可以察觉到异味的产生。 食品的气味是一些具有挥发性的物质形成的，它对温度的变化常很敏感，因此在进行嗅觉检验时，可把样品稍加热，但最好是在51ε ～25ε 的常温下进行，因为食品中的气味挥发物质常随温度的高低而增减。在鉴别食品的异味时，液态食品可滴在清洁的手掌上摩擦，以增加气味的挥发；识别畜肉等大块食品时，可将一把尖刀稍微加热刺入深部，拔出后立即嗅闻气味。 感觉器官长时间接触浓气味物质的刺激会疲劳，因此检验时先识别气味淡的，后鉴别气味浓的，检验一段时间后，应休息一会。在鉴别前禁止吸烟。 由于气味没有确定定义，而且很难定量测定，所以气味分类比较混乱，目前尚未有一个公认的分类方法。气味的表达，在语言上也同样存在很大的困难。 现在发现人类具有某些嗅盲，即所谓嗅觉缺失症。食品感官检验员不应有嗅觉缺失症。 （三）味觉检验 通过被检验物作用于味觉器官所引起的反映评价食品的方法称为味觉检验。 味觉是可溶性呈味物质溶解在口腔中对味感受体进行刺激后产生的反应。基本味觉有酸、甜、苦、咸四种，其余味觉都是由基本味觉组成的混合味觉。从试验角度讲，纯粹的味感应是堵塞鼻腔后，将接近体温的试样送入口腔内而获得的感觉。通常，味感往
往是味觉、嗅觉、温度觉和痛觉等几种感觉在嘴内的综合反应。 口腔内舌头上隆起的部分－乳头是味觉感受器，在乳头上分布有味蕾，味蕾是味的受体，呈纺锤状，其中间含有味细胞。由于舌表面的味蕾乳头分布不均匀，而且对不同味道所引起刺激的乳头数目不相同，因此造成舌头各个部分感觉味道的灵敏度有差别。例如，在舌前部容易感觉甜味和咸味，苦味在舌后部较为灵敏，而酸味则在舌两侧感觉较易。 味觉与温度有关，一般在10℃～45℃范围内较适宜，以30℃时最为敏锐。影响味觉的因素还与呈味物质所处介质有关联，介质的粘度会影响味感物质的扩散，粘度增加味道辨别能力降低。味道与呈味物质的组合以及人的心理也有微妙的相互组合，谷氨酸钠（味精）只有在食盐存在时才呈现出鲜味；食盐和砂糖以相当的浓度混合，砂糖的甜味会明显减弱等等。由于味之间的相互作用受多种因素的影响，呈味物质相混合并不是味道的简单叠加，需要鉴评员经过训练，并在实践中认真感觉才能获得比较可靠的结果。 味觉同样会有疲劳现象，并受身体疾病、饥饿状态、年龄等个人因素影响。味觉的灵敏度存在着广泛的个体差异，特别是对苦味物质。这种对某种味觉的感觉迟钝，也被称作“味盲”，苯硫脲（CTP）是最典型的苦味盲物质。 在作味觉检验时，也应按照刺激性由弱到强的顺序，最后鉴别味道强烈的食品。每鉴别一种食品之后必须用温开水漱口，并注意适当的中间休息。 (四)触觉检验 通过被检验物作用于触觉感受器官所引起的反应，评价食品的方法称为触觉检验。 触觉检验主要借助手、皮肤等器官的触觉神经来检验食品的弹性、韧性、紧密程度、稠度等。例如，根据鱼体肌肉的硬度和弹性，可以判断鱼是否新鲜或腐败；对谷物，可以用手抓起一把，凭手感评价其水分；对饴糖和蜂蜜，用掌心或指头揉搓时的润滑感可鉴定其稠度。此外，在品尝食品时，除了味觉、嗅觉外，还可评价其脆性、粘度、松化、弹性、硬度、冷热、油腻性和接触压力等触感。 进行感官检验时，通常先进行视觉检验，再依次进行嗅觉、味觉及触觉检验。 三、感官检验的基本要求 食品感官鉴评是以人的感觉为基础，通过感官评价食品的各种属性后，再经统计分析获得客观结果的试验方法。因此，在鉴评过程中，其结果往往受到许多条件的影响。这些条件包括评价前的准备工作、感官实验室的外部环境、鉴评人员的基本条件和素质等。表3-1列出了在进行感官鉴评时所需考虑的问题及必备条件。仔细做好这些工作，有助于你将得到有效的数据和正确的结果。 （一）感官检验实验室要求 感官检验实验室应建立在环境清净交通便利的地区，应尽量创造有利于感官检验的顺利进行和评价员正常评价的良好环境，尽量减少评价员的精力分散以及可能引起的身体不适或心理因素的变化使得判断上产生错觉。
表3-1 感官检验前需作的准备 检验对象 说明 检验类型 标度类型 评价员： 品质用语 招聘 固定用语 联系方式 编码 管理层批准 随机化/均衡化 筛选 品评间细则 接收通知 铅笔 动机 餐巾 培训 痰盂 样品： 清扫 大小和形状 布置安排 体积 承接 装载工具 评价员的任务报告 准备温度 检验区域： 最大保持时间 评价员的隔离 检验计划： 温度 评价员报到 湿度 味觉清除 光照条件 指令 噪音（听觉） 对于技术人员 背景气味/空气清洁处理/ 对于评价员 正压 打分表 可接近性 安全性 食品感官检验室由两个基本部分组成：检验区和样品制备区。若条件允许，也可设置一些附属部分，如办公室、休息室、更衣室、盥洗室等。 检验区是感官鉴评人员进行感官检验的场所，通常设有单独检验区和集体工作区。其中单独检验区是供感官鉴评人员在内独立进行检验的若干个小间构成，小间的面积很小（×），内设工作台和座椅，并配备漱口用的清水和吐液用的容器，最好配备固定的水龙头和漱口池。集体工作区是用于检验员之间的讨论，也用于检验员的培训、授课等。集体工作区应设一张大型桌子及150~把舒适椅子，桌子应配有可拆卸的隔板。推荐的感官检验实验室见图3-1。 食品感官实验室应具备一定的环境条件，应配备空气调节装置，可调节温度和湿度；具有良好的换气装置，换气速度以半分钟左右为宜；有充足的光线和照明，推荐灯的色温为60k50。 制备区内应配备有用于制备样品的必要设备，如炊具、冰箱、容器、盘子、天平等。 （二） 检验人员的选择与培训 食品感官检验种类繁多，各种检验对参加人员的要求不完全相同。按检验类型可分为实验室内感官分析的评价员与消费者偏爱检验的评价员两个大类。前者需要专门的选择与培训，后者只要求具有代表性。分析型评价员的任务是评价食品的质量，这类人员必须具备一定的条件并经培训和测试方可胜任。 1.初选 排选食品感官检验员一般经报名、初选、筛选、培训、考核等过程。国家标准
感官分析实验室平面图示例1 感官分析实验室平面图示例2 图3-1 感官分析实验室平面图示例 B/GT5194详细规定了选拔与培训感官分析优选评价员的准则与程序。对评价员的基本条件和要求是： （1）身体健康，不能有任何感觉方面的缺陷； （2）各评价员之间及评价员本人要有一致的和正常的敏感性； （3）具有从事感官分析的兴趣； （4）个人卫生条件较好，无明显个人气味； （5）具有所检验产品的专业知识并对所检验的产品无偏见； （6）保证有80%以上的出勤率。 对初选入围的评价员在经过面试、询问后，可进入测试阶段进行筛选。 2.测试 测试的目的是通过一系列筛选检验，进一步淘汰那些不适于感官分析工作的候选者，以便进入下一步的培训。 筛选检验的内容有：感官功能检验、感官灵敏度的检验和描述和表达感官反应能力
的检验三个方面的内容。1B22G13规定了味觉敏感度测定的方法：以酒石酸（g03/.l0）、柠檬酸（50lg1./0）、盐酸奎宁（g0/）、咖啡因（ 3.培训 培训的目的是向候选评价员提供感官分析基本技术与基本方法及有关产品的基本知识，提高他们觉察、识别和描述感官刺激的能力，使最终能达到胜任的目的，内容包括有认识感官特性、接受感官刺激、使用感官检验设备、学习感官分析方法、学习使用评价标度、设计和使用描述词语以及了解产品有关特性知识等。 4.考核 在培训的基础上进行考核以确定优选评价员的资格。考核主要是检验候选评价员操作的正确性、稳定性和一致性。正确性，即考察每个评价员是否能正常的评价样品，例如正确区别、正确分类、正确排序、正确评分等。稳定性，即考察每个评价对同一组样品先后评价的再现程度。一致性，即考察各评价员之间是否掌握同一标准作出一致评价。 不同类型、适合不同检验目的候选评价员考核的方法和要求各不相同。 考核合格的评价员可正式录用。优选评价员的评价水平可能会下降，因此，对其操作水平应定期检查和考核，达不到规定要求的应重新培训。 （三）样品的制备和分发 1.样品数量 每种样品应有适当的数量，一般应以3～5次品尝数量为宜。例如液体L30m，固体2g8左右。嗜好性试样应多一些。 2.样品温度 在检验程序中，必须规定产品的呈送温度，适于热吃的食品，一般应在60～70℃左右，液体牛奶、啤酒则在15℃，冰淇淋在品尝之前应在－51℃～－31℃下至少保持1h2。 3.呈送器皿 盛载样品的器皿应清洁无异味，器皿的颜色、大小应一致。如使用一次性容器，则可避免洗净的麻烦。 4.样品的编号和呈送 所有检测样品均应编码，通常由工作人员以随机的三位数编号。检验样品的顺序也应随机化。例如有A、B、C、D、E五个样号，对它们进行编号和决定检验顺序的方法如下： 首先从随机数表（见附表1）中任意选择一个位置，例如选从第5行第01例开始以多位数（例如3位数）来编号是34，往下移（或往其它方向）依次是774，072，289，781。检验顺序也可查此表确定，先在表中任选一个位置，例如从第01行第10列开始往右取5个数（由于只有5个样品，数字大于5的不选），得先后顺序为5，1，4，2，3。 当由多个检验人员检验时，提供给每位检验人员的样品编号和检验顺序彼此都应有所不同，表3－2为8位检验员对4个样品进行感观检验时的样品编号和检验顺序(括号内数字)。
5.对于不宜直接感官分析的样品，例如香料、调味品、糖浆、奶油等，可将样品以一定比例添加到中性的食品载体中（如牛奶、面条、米饭、馒头、菜泥、面包、乳化剂等），然后再品尝，详见1B42G13的规定。 表3－2 8位评价员对4中样品的编号和评价顺序 样品和品尝顺序 评价员 A BC D 1 81)(9 115)(7 393)(4 41)(4 22 49)(7 296)(0 184)(2 414)(4 3 3 25)(5 286)(8 397)(6 470)(3 1 4 76)(8 430)(3 202)(9 356)(3 15 3)(0 396)(2 278)(9 109)(9 4 6 47)(3 331)(8 160)(2 279)(9 47 20)(4 27)(4 476)(1 163)(4 3 8 67)(0 453)(7 330)(5 173)(6 2 第二节 感官检验常用方法 一、检验方法的选择和分类 在选择适宜的检验方法之前，首先要明确检验目的。一般有两类不同的目的，一类为区分两种或多种产品之间差别，另一类为对产品进行感官描述。 常用的检验方法有三类。（1）差别检验，用于确定两种产品之间是否存在感官差别。（2）标度和类别检验，用于估计差别的顺序和大小，或者样品应归属的类别或等级。（3）分析或描述性检验，用于识别存在于某样品中的特殊感官指标，该指标也可以是定量的。 感官检验结果的判断，常用统计学的方法，这里介绍几个统计学术语。 原假设：在样品进行感官检验之前所设定的一种假设，即两种样品之间在特性强度上设有差别（或对其中之一没有偏爱），P=P 0备择假设：当原假设被拒绝时而接受的一种假设。如果原假设是P=P，那么备择假0设可以是双边的（P≠0P），也可以是单边的（例如P＞P）。 0显著水平：检验结果可能出现两种情况，接受原假设或拒绝原假设而接受备择假设。显著水平是指当原假设是真而被拒绝的概率（或这种概率的最大值），也可看作为得出这一结论所犯错误的可能性。在感官分析中，通常选定5%的显著水平可认为是足够的。应当注意：原假设可能在“%5的水平”上被拒绝，而在“%1的水平”上不被拒绝。因此，对5%的水平用“显著”一词表示，而对1%的水平用“非常显著”一词表示。 二、常用的几种感官检验方法 （一）差别检验 属于差别检验法的有：成对比较检验，三点检验，“A”-“非A”检验，五中取二检验法等。 1.成对比较检验 本法适用于确定两种样品之间是否存在某种差别，差别的方向，是否偏爱其中的一种等。也可用于评价员的选择和培训。 做法：向评价员提供A、B两个样品，感官检验后，评价员描述自我感觉，填表说
明检验结果。 结果分析：根据A、B两个样品的特性强度的差异大小，确定检验是双边的还是单边的。如果样品A的特性强度明显优于B，或评价员做出样品A比样品B的特性强度大（或被偏爱）的判断概率高，则该检验是单边的；如果这两种样品有显著差别，但没有理由认为A或B的特性强度大于对方或被偏爱，则该检验是双边的。 （1）对于单边检验，统计有效回答表中的选择数，与表23-中相应的某显著性水平的数相比较，若大小或等于表中的数，则说明在此显著水平上拒绝原假设，接受备择假设，即样品间有显著性差异，或此产品更受偏爱。 （2）对于双边检验，对照表3-3中的相应数字，做出判断。 例如，在一个有30个评价员参加的检验中，20个人偏爱A（或认为某一特性强度较高）10个人偏爱B，并且没有理由认为A或B应被偏爱（即检验是双边的），查表3-3，答案数目03n=栏中，由于统计数（20）小于表中的值，所以原假设在5%显著水平上不被拒绝，即两个样品没有显著性差异。 另一方面，如果有先验知识，A应被偏爱（或某一特性强度明显偏大），则该检验是单边的，上例中的统计数应对照表2-3中的03=n栏，等于5%显著水平栏的数字（20），所以原假设在5%显著水平上被拒绝而被接受备样假设，得出两个样品有显著性差异，或A产品被明显偏爱的结论。 表3-2 成对比较检验法检验表（单边） 答案显著水平 答案显著水平 答案显著水平 数目数目数 目5% 1% 01.% 5% 1% 01.%5% 1% 01.% （n）（n）（n）7 7 7 - 24 17 19 20 41 27 29 31 8 7 8 - 25 18 19 21 42 27 29 32 9 8 9 - 26 18 20 22 43 28 30 32 10 9 10 10 27 19 20 22 44 28 31 33 1 19 10 1 128 19 21 23 45 29 31 34 12 10 1 1 12 29 20 22 24 46 30 32 34 13 10 12 13 30 20 22 24 47 30 32 35 14 1 1 12 13 31 21 23 25 48 31 33 35 15 12 13 14 32 22 24 26 49 31 34 36 16 12 14 15 33 22 24 26 50 32 34 37 17 13 14 16 34 23 25 27 60 37 40 43 18 13 15 16 35 23 25 27 70 43 46 49 19 14 15 17 36 24 26 28 80 48 51 55 20 15 16 18 37 24 27 29 90 54 57 61 21 15 17 18 38 25 27 29 100 59 63 66 22 16 17 19 39 26 28 30 23 16 18 20 40 26 28 31 2.三点检验 同时提供三个已编码的样品，其中有两个是相同的，要求评价员挑选出其中不同于其他两样品的检查方法称为三点试验法，也称三角试验法。样品的组合可有六种形式。此法适用于鉴别两个样品之间的细微差异，也可用于挑选和培训评价员或者检查评价员的能力。此法的猜测率为31/，如作数次重复试验，则猜测率更低。
统计结果查表3-4，如果回答正确的统计数大于或者等于表中相应栏的数字，则拒绝原假设而接受备择假设。 3.“A”-“非A”检验法 在让评价员熟悉样品“A”以后，再将一系列样品提供给评价员，其中有“A”，也有“非A”。要求评价员指出哪些是“A”，哪些是“非A”的检验方法称为“A”-“非A”检验法。 此法适用于确定由于原料、加工、处理、包装和贮藏等各环节的不同所造成的感官特性的差异，特别适用于检验具有不同外观或后味样品的差异检验，也适用于确定评价员对一种特殊刺激的敏感性。 表3-3 成对比较法检验表（双边） 答案答案答案显著水平 显著水平 显著水平 数目数目数目（n） （n）（n）5% 1% 01.% 5% 1% 01.% 5% 1% 01.% 7 7 - - 24 18 19 21 41 28 30 32 8 8 8 - 25 18 20 21 42 28 30 32 9 8 9 - 26 19 20 22 43 29 31 33 10 9 10 - 27 20 21 23 44 29 31 34 1 110 1 128 20 22 23 45 30 32 34 12 10 1 1 12 29 21 22 24 46 31 33 35 13 1 1 12 13 30 21 23 25 47 31 33 36 14 12 13 14 31 22 24 25 48 32 34 36 15 12 13 14 32 23 24 26 49 32 34 37 16 13 14 15 33 23 25 27 50 33 35 37 17 13 15 16 34 24 25 27 60 39 41 44 18 14 15 17 35 24 26 28 70 44 47 50 19 15 16 17 36 25 27 29 80 50 52 56 20 15 17 18 37 25 27 29 90 55 58 61 21 16 17 19 38 26 28 30 100 61 64 67 22 17 18 19 39 27 28 31 23 17 19 20 40 27 29 31 表3-4 三点检验法检验表 答案 显著水平 答案显著水平 答案显著水平 数目 数目数目5% 1% 01.% 5% 1% 01.% 5% 1% 01.% （n） (n) (n) 4 4 - - 33 17 18 21 62 28 31 33 5 4 5 - 34 17 19 21 63 29 31 34 6 5 6 - 35 17 19 22 64 29 32 34 7 5 6 7 36 18 20 22 65 30 32 35 8 6 7 8 37 18 20 22 66 30 32 35 9 6 7 8 38 19 21 23 67 30 33 36 10 7 8 9 39 19 21 23 68 31 33 36 1 17 8 10 40 19 21 24 69 31 34 36 12 8 9 10 41 20 22 24 70 32 34 37 13 8 9 142 20 22 25 71 32 34 37 14 9 10 1 143 21 23 25 72 32 35 38 15 9 10 12 44 21 23 25 73 33 35 38 16 9 1 12 45 22 24 26 74 33 36 39 17 10 1 1 13 46 22 24 26 75 34 36 39 18 10 12 13 47 23 24 27 76 34 36 39 19 1 1 12 14 48 23 25 27 77 34 37 40
20 1 1 13 14 49 23 25 28 78 35 37 40 21 12 13 15 50 24 26 28 79 35 38 41 22 12 14 15 51 24 26 29 80 35 38 41 23 12 14 16 52 24 27 29 82 36 39 42 24 13 15 16 53 25 27 29 84 37 40 43 25 13 15 17 54 25 27 30 86 38 40 44 26 14 15 17 55 26 28 30 88 38 41 44 27 14 16 18 56 26 28 31 90 39 42 45 28 15 16 18 57 26 29 31 92 40 43 46 29 15 17 19 58 27 29 32 94 41 44 47 30 15 17 19 59 27 29 32 96 42 44 48 31 16 18 20 60 28 30 33 98 42 45 49 32 16 18 20 61 28 30 33 100 43 46 49 2整理统计结果，列成表5-3，用x检验来进行解释。 表中n、n为样品本身是“A”或“非A”，评价员也判断为“A”或“非A”的11 22回答数。n、n为样品本身是“非A”或“A”，而评价员判断为“A”或“非A”的回2121答数。n，n为第1、2行回答数之和，n，n为第1、2列回答数之和，.n.为所有回答1...数。 表3-5 “A”-“非A”检验结果统计表 样品数 “A”和“非A”样品数 判别数 累计 “A” “非A” 判为“A”或“非“A” nnn ”的回答数 “非A” n 21222.累计nn ...2当n..＜04或n（1i=，2；j=1，2）≤5时，用下式计算x值： ij22x={︱n×nn-×n∣-n../2}×.n/.n×n×n× .当n..＞04和n＞5时，则用： ij22x=（n×nn-×n）×n../n×n×n× .22将计算出的x值与附表2 x分布表中自由度f=1时相应显著水平下的临界值相比较，若大于或等于表中值，则为拒绝原假设而接受备择假设。 此法还可将“非A”拓展为“非A”“非A”等。 12（二）标度和类别检验 属于标度和类别检验的有：排序法，分类法，评估法，评分法和分等法等。 1.排序法 比较数个样品，按指定特性由强度或嗜好程度排出系列的方法称为排序检验法。该法只排出样品的次序，不要求评价样品间差异的大小。 此检验法可用于消费者的可接受性调查，也可用于因不同原料、加工、处理、包装和贮藏等各环节而造成的产品感官特性差异。在对样品作更精细的感官分析之前，可首先采用这种方法，也可用于评价员的选择和培训。 在评价员充分了解了被评价的指标、准则、排列的顺序等要求后，把经编码的一组样品提供给评价员，要求评价员按感官特性排出顺序，下例为6位评价员对A、B、C、
D四种样品的排序结果和统计分析。 （1）制定问答表。例如： 姓名——日期——产品—— 品尝样品后，请根据您所感受的甜度，把样品号码填入适当的空格中（每格中必须填一个号码）。 甜味最强→甜味最弱 □□□□ （2）统计评价员的排序结果。如下表。 表3-6 评价员的排序结果 样品 秩次 评价员 1 2 3 4 1 A B C D 2 B = C A D3 A B = C = D 4 A B D C 5 A B C D6 A C B D （3）统计样品秩次与秩和 将表3-6的排序结果转变为样品的秩次与秩和，如有相同秩次,则取平均值，见表3-7： 表3-7 样品的秩次与秩和 秩次 样品 评价员 A B C D秩 和 1 1 2 3 4 10 2 3 15. 4 10 3 1 3 3 3 10 4 1 2 4 3 10 5 1 2 3 4 10 6 1 3 2 4 10 每种样品的 8 135. 165. 22 60 秩 和 （4）统计解释 使用Frainendm检验和Page检验对被检样品之间是否有显著性差异作出判定。 ① anFriendm检验 计算统计量F值： 222F=12（R+R+……+R）/JP（1+P）－3J（1+P） 12p式中J——评价员数；P——样品数；R、R……R——每种样品的秩和。 12p当评价员实在分不出某两种样品之间的差距时，可以允许将这两种样品排定同一秩次（如表3-6，3-7），这时用’F进行校正： 2F’=F/[1－PE/J（P－1） ]33式中E值由如下得出：令n、n……n为出现相同秩次的样品数，则E=（n－n）+（n12k1123－n）+……+（n－n）若没有相同秩次，则n1=。 2kkk33在本例中，根据表3-6，n2=，n3=，所以E=（2－2）+（3－3）03=，故 232222F=12（+.156+22+）/6×4（14+）－3×6（1+4）120=5.
2F’=F/[1－360/×4×4(－7 )]==2用F或’F值与表3-8或附表2（x分布表，f=p－1）中的临界值比较，从而得出统计结论。 本例中，=’F，大于表3-8中相应P、J、a（4，6，）的临界值，所以可以判定在%1显著水平下，样品之间有显著性差异。 ② egaP检验 有时样品有自然的顺序，例如样品成分的比例、温度、不同的贮藏时间等可测因素造成的自然顺序。为了检验该因素的效应，可以用Page检验。该检验也是一种秩和检验，在样品有自然顺序的情况下，Page检验比andneirFm检验更有效。 如果r、r……r是以确定的顺序排列的P种样品的理论上的平均秩次，如果样品12p之间没有差别，则应r=r=……=r。否则应为r≤r≤……≤r，其中至少有一个不等式12p12p是成立的，也就是原假设不能成立。检验原假设能否成立，用下式计算统计量来确定： L=R+2R+……RP+12p 若计算出的L值大于或等于表3-9中相应的临界值，则拒绝原假设而判定样品间有显著性差异。 如若评价员人数J或样品数P超出表3-9中的范围，可用统计量’L作检验，见下式： 2=[P+’1)12L-3JP(L]/P(P+1)√ )1-P(J当’L≥015=)6(.a，’L≥(1a.)=0时，可判断样品间有显著性差异。 (5)统计分组 当用aFnriedm检验或egaP检验确定了样品之间存在显著性差别之后，需要进一步确定那些样品之间有显著性差别。 表3-8 ienFdrman秩和检验近似临界值表 评价员 样品（或产品）的数目P 数 目 3 4 5 3 4 5 J 显著水平00=.5a 显著水平00=.1a 2 - - - 3 - 1301 . 4 1 5 16 1002 .1832 . 7 1703 .1832 .8 1503 .1832 . 9 11832 . 10 11832 .1 11832 . 12 11832 . 13 11832 .14 11832 . 15 11832 . ①多重比较和分组 根据各样品的秩和，从小到大将样品初步排序，上例的排序为（见表3－7）：
R R R R AB C D 8 53 .1 6 .15 2 计算临界值r（I，a）： 式中q（I，a）值可查表3－10，I＝2，3，…….P 0本例中，根据表3－6，临界值r（I，a）为： 表3-9 gPea检验临界值表 评价员数样品（或产品）数P 目 3 4 5 6 7 8 3 4 5 6 7 8 J 显著水平00=.5a 显著水平00=.1a 2 28 58 130 166 25 326 - 60 160 137 216 367 3 41 84 105 244 307 523 42 87 155 25 328 594 4 54 1 11179 312 478 710 55 14 1240 313 510 722 5 66 173 244 379 630 896 68 14 215 490 602 839 6 79 136 219 47 791 1307 81 176 299 468 73 1603 7 91 198 383 505 853 1024 93 139 364 536 855 132 8 140 241 348 652 905 1731 160 202 39 604 927 1041 9 16 1204 413 710 1605 1357 19 1264 414 71 1808 1659 10 182 266 477 77 108 11073 13 27 478 739 1025 1376 1 114 29 532 825 1925 168 144 289 543 896 1231 1095 12 135 371 507 982 140 2305 165 342 548 964 1347 2702 13 156 34 651 1003 125 2021 196 305 682 1202 1553 2420 14 187 386 616 1708 1369 2637 18 367 647 1908 1668 2047 15 109 349 70 135 11574 2352 149 420 712 147 11874 2754 16 20 402 745 1228 168 2967 260 472 76 1429 1989 2470 17 251 454 800 103 1892 2682 281 435 841 1235 2104 2097 18 272 417 864 1738 2907 3208 213 497 806 1041 2310 3703 19 293 469 819 1543 2127 3913 234 50 960 1746 2425 3420 20 215 522 973 1258 235 3538 265 513 935 1552 2630 3046 比较与分组： 以下列的顺序检验这些秩和的差数：最大减最小，最大减次小，………..，最大减次大，然后次大减最小，次大减次小，………依次下去，一直到次小减最小。 R－R 与r（P，a） 比较 PA1AR－R 与r（1-P，a） 比较 PA2A : : : : R－R与r（2，a） 比较 PA1-PAR－R与r（1-P，a） 比较 1-PA1A
R－R与r（2-P，a） 比较 1-PA2A : : : : RR- 与r（2，a） 比较 2A1A若相互比较的两个样品A与A的秩和之差R－R（ij>）小于相应的r值，则表jijAiA示这两个样品以及秩和位于这两个样品之间的所有样品无显著性差别，在这些样品之下用一横线表示，即： A A……..A，横线内的样品不必再作比较。 i i+1j若相互比较的两个样品A与A的秩和之差R－R大于或等于相应的r值，则表jijAiA示这两个样品有显著性差别，其下面不划横线。 不同横线上面的样品表示不同的组，若有样品处于横线重叠处，应单独列为一组。 本例中，根据表3－7，查表3－01可得： r（4，005.）＝q（4，）×＝×＝.417 1r（3，005.）＝q（4，）×＝×＝ r（2，005.）＝q（2，）×＝×＝75. 8由于： RR-421>=-r28=（4，）＝，不可划线。 41RR-5=22-=<r（3，）＝，可划线。 42RR-55=-6<8=（3，）＝，可划线。 31结果如下： A B C D 最后分为三组： A B C D 结论：在5％显著水平上，D样品最甜，A样品最不甜，B、C样品在甜度上无显著性差别。 表3－10 q（I，a）值表 a＝ I a＝ a＝ I a＝ 2 1 3 12 4 13 5 14 6 15 7 16 8 17 9 18 10 19 ②利用最小显著差数分组 假若aFnriedm检验或egaP检验确定样品之间存在显著性差异，但用多重比较法又
无法确定样品之间的差别，也可用下面方法确定那两种样品有差别，并进而分组。 计算最小显著差数 DSL 计算两两样品的秩和之差RR-（j>I），并与最小显著差数DSL比较。分组的方法JAIA与①相同，只是将临界值r（I，a）换成最小显著差数DSL。 2．评分检验法 要求评价员把样品的品质特性以数字标度形式来品评的一种检验称为评分法。在评分法中，所使用的数字标度为等距标度或比率标度。它不同于其它方法的是所谓的绝对性判断，即根据评价员各自的鉴定标准进行判断。它出现的粗糙评分现象可由增加评价员人数来克服。 本法可以同时鉴评一种或多种产品的一个或多个指标的强度及其差异，所以应用较为广泛，尤其用于鉴评新产品，评比评优等。 检验前，首先确定所使用的标度类型，使评价员对每一个评分点阶代表的意义有共同的认识。检验时，由评价员评价样品指标，由组织者按事先规定的规则转换成分数值，也可由评价员直接给出样品的分数值。 例如，某一产品的标度类型及其转换分数值可表示如下： 非常不喜欢 很不喜欢 不喜欢 不太喜欢 一般 稍喜欢 喜欢 很喜欢 非常喜欢 1 2 3 4 5 6 7 8 9 －4 －3 － 2 －1 0 1 2 3 4还可有02分制、100分制，然后通过复合比较，来分析各个样品的各个特性间的差异情况。但当样品数只有两个时，可用较简单的t检验法。 例3－1，01位评价员鉴评两种样品，以9分制评分，求两样品间是否有差异： 表3－1 1 评价结果 评价员 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 合计 平均值 8 7 7 8 6 7 7 8 6 7 71 71. 样 A6 7 6 7 6 6 7 7 7 7 66 66. 品 B评 d 2 0 1 1 0 1 0 1 -1 0 5 05. 分 2d 4 0 1 1 0 1 0 1 1 0 9 差 用t检验进行分析
所以 以评价员自由度为9查t分布表（附表 ），在5％显著水平相应的临界值为t（）9＝，因<2，可判断接受原假设，即两个样品间没有显著性差异。 例3－2，为了调查人造奶油与天然奶油的嗜好情况，制备了三种样品，①用人造奶油制作的调味汁；②用天然和人造奶油各50％制作的调味汁；③用天然奶油制作的调味汁。由61位优选评价员进行评分检验，评分标准为：风味很好（＋2），风味好（＋1），风味一般（0），风味不佳（－1），风味很差（－2）。结果见表3－21 表3－12 三种调味汁结果 评价 评分标准 员数 ＋2 ＋1 0 －1 －2 总分数 平均分样品号 数 1 1 9 2 4 0 7 2 0 6 6 4 0 2 3 0 5 9 2 0 3 用方差分析法进行计算： )1(总和 T1T+32=2= +22 )2(校正误差 CT=n/＝1248/＝ 3 )5(误差平方和=总平方和—样品平方和=31—= .0 )6(总自由度74 =81- )7(样品自由度＝3-21 =
)8(误差自由度=254=7 4- )9(方差＝变因平方和/变因自由度 样品方差＝800284..=/4 误差方差＝0 =60列出方差分析表如下： 差异原因 自由度 平方和 方差 F值 0样品 2 8 0. 误差 4 5 总计 47 13 判断：查F分布表（附表 ）中，自由度为2和45，5％显著水平时，有 2F05()0 .≈3>.F2 450故可得出“这三种调味品之间的风味没有显著性差异”的结论。 3．多项特性评析法 由评价员在一个或多个指标基础上，对一个或多个样品进行排序，评分或分类方法称为多项特性评析法。 检验前先让评价员明确被检样品应检验的指标、强度标度，描述特性的词汇术语和检验方法，规定各项指标的加权系数。评价完成后统计各样品的各个特性数值平均值，并与规定的权数相乘，最后得出综合结果。 例如，有五个样品，希望通过对其外观、组织结构、风味的鉴评进行综合评价，采用9分评分法，并且规定样品的外观、组织特性和风味的权数分别为、、，那么每个样品的综合结果就是： +30x.＋。 123指标强度的标示，可用表格、图示、数字、语言等多种形式表达。统计分析方法可用排序、评分、分类等方法。 此外，还有分类检验法、成对比较法等，这里不再一一介绍。 （三）分析或描述性检验 分析或描述性检验要求评价员对产品的一个或多个感观指标进行 定性、定量的分析或描述评价。如外观、颜色、风味（气味、味觉）、组织（硬度、粘度、脆度、弹性、附着度）及几何特性等各个感观特性方面进行分析或描述。通常分为简单描述检验及定量描述和感观剖面检验两个类别。 1.简单描述检验 要求评价员对构成产品特性的各个指标进行定性描述，尽量完整地描述出样品的品质。 此方法可用于识别或描述某一特殊样品或许多样品的特殊指标，或将感觉到的特性指标建立一个系列。常用于质量控制，产品在贮存期间的变化或描述已经确定的差异检
测，也可用于培训评价员。 在进行检验评价前，首先提供一张适合于样品的描述性词汇表，使鉴评员能根据指标检查表进行评价，最后根据每一个描述性词汇的使用频数得出评价结果。最好对评价结论作公开讨论。 比如，用于外观的词汇有：一般、深、苍白、暗状、油斑、白斑、褪色、斑纹、有杂色等。用于组织形态的词汇有：一般、粘度、油腻、厚度、薄弱、易碎、断裂、粗糙、裂缝等。描述分析要求使用精确的、特定的概念，并采用仔细筛选过的科学语言，清楚地把这种概念表达出来。不同的行业，通常都有他们的特定“行话”，感观评价人员要使用精确的风味描述词语，必须经过一定的训练和前期实践。 2.定量描述和感观剖面检验 要求评价员尽量完整地对形成样品感观特征地各个指标强度进行鉴评的检验方法称为定量描述试验。这种鉴评是使用由简单描述试验所确定的词汇中选择的词汇，描述样品整个感观印象的定量分析。 感观剖面检验员是基于产品的风味是由可识别的味觉和嗅觉特性，以及不能单独识别特性的复合体所组成。本法用一可再现的方式描述和评估产品风味，鉴别形成产品综合印象的各个风味特性，并评估其强度，强度的表示，可用数字（如0＝不存在，1＝刚好可识别，2＝弱……….5＝很强），也可用一直线，以在直线中的位置或距端点的距离表示（图示法）。 这两种检验方法对质量控制、质量分析、鉴定产品之间的差异，新产品研制、提供产品特征的永久记录、监测产品在贮存期间的变化，以及提供与仪器检验数据对比的感观数据等方面最为有效。也可用于优选评价员的培训。 国标B31G-129109规定了风味剖面检验的一套描述和评估食品产品风味的方法。下例为某评价员对沙司酱的风味剖面分析实例。 产品：沙司酱 日期：.188985. 评价员：刘力 特性特征： 7 6 5 4 3 2 1 0 鸡蛋 胡椒 柠檬 风味 盐 黄油 余味 滞留度 综合印象： 3
思考题： 1、 说明感官检验的特点，感官检验有哪些类型？ 2、 简述感官检验实验室应有哪些功能和要求？ 3、 如何选择、培训和考核感官检验评价员？感官检验评价员应具备哪些基本条件？ 4、 常用的感官检验方法有哪几大类？各类方法的特点和适用范围是什么？ 5、 举例说明各类感官检验方法的应用和数据处理方法。 （张水华）
第四章 食品的物理检测法 根据食品的相对密度、折射率、旋光度等物理常数与食品的组分含量之间的关系进行检测的方法称为食品的物理检测法。物理检测法是食品分析及食品工业生产中常用的检测方法之一。 第一节 概述 一 物理检测的意义 相对密度、折射率和比旋光度与物质的熔点和沸点一样，也是物理特性。由于这些物理特性的测定比较便捷，故它们是食品生产中常用的工艺控制指标，也是防止假冒伪劣食品进入市场的监控手段。通过测定液态食品的这些特性，可以指导生产过程、保证产品质量以及鉴别食品组成、确定食品浓度、判断食品的纯净程度及品质，是生产管理和市场管理不可缺少的方便而快捷的监测手段。 二 物理检验的内容与方法 1 相对密度 蔗糖溶液的相对密度随糖液浓度的增加而增大，原麦汁的相对密度随浸出物浓度的增加而增大，而酒中酒精的相对密度却随酒精度的提高而减小，这些规律已通过实验制定出了它们的对照表，只要测得了它们的相对密度就可以从附表中查出其对应的浓度（参看《制糖分析》附表1和《工业发酵分析》附表4-3，4-4）。 对于果汁、番茄汁等这样的液态食品，测定了相对密度便可通过换算或查专用的经验表确定其可溶性固形物或总固形物的含量。 正常的液态食品的相对密度都在一定的范围之内，例如：全脂牛乳为—（0/220℃）；芝麻油为~989017（/402℃）。当由于掺杂、变质等原因引起其组织成分发生异常变化时，均可导致其相对密度发生变化。不可忽视的是，即使液态食品的相对密度在正常范围以内，也不能确保食品无质量问题，必须配合其它理化分析，才能保证食品的质量。 2 折射率 蔗糖溶液的折射率随蔗糖浓度的增大而升高，所以所有含糖饮料、糖水罐头、果汁和蜂蜜等食品都可利用此关系测定糖度或可溶性固形物含量。还可通过测定生长期果蔬的折射率，判断果蔬的成熟度，以进行田间管理。 每种脂肪酸均有其特定的折射率。含碳原子数目相同时，不饱和脂肪酸的折射率比饱和脂肪酸的折射率大得多；不饱和脂肪酸相对分子质量越大，折射率越大；油脂酸度越高，折射率越小。因此，测定折射率可以用来鉴别油脂的组成和品质。 正常情况下，某些液态食品的折射率有一定的范围，如芝麻油的折射率在9412671.~49（20℃）之间，蜂蜡的折射率在~.（75℃）之间。当这些液态食品由于搀杂或品种改变等原因引起食品的品质发生改变时，折射率常常会发生变化，故测定折射率可以初步对食品进行定性，以判断食品是否正常。 番茄酱、果酱等食品可通过折光法测定其可溶性固形物含量后，再查特制的经验表得到总固形物含量。 3 旋光度 20某些食品的比旋光度值在一定的范围内，如谷氨酸钠的比旋光度[α]在+2+.~3°之间，通过D测定它的比旋光度，可以控制产品质量。蔗糖的糖度、味精的纯度、淀粉和某些氨基酸的含量与其旋光度成正比，故测定了它们的旋光度便可知道它们的结果。 第二节 物理检验的几种方法 一 相对密度法 测定液态食品相对密度的方法有密度瓶法、密度计法和密度天平（即韦氏天平estaplh Wcbaeanl）法等，前两种方法较常用。其中密度瓶法测定结果准确，但耗时；密度计法则简易迅速，但测定结果准确 1
度较差。 1 密度瓶法 （1） 仪器 密度瓶是测定液体相对密度的专用精密仪器，其种类和规格有多种，常用的有带温度计的精密密度瓶和带毛细管的普通密度瓶，见图1-4。常用的密度瓶规格是52和l50m两种。 1— 带毛细管的普通密度瓶 2— 带温度计的精密密度瓶 图4-1 （2） 测定原理 由于密度瓶的容积一定，故在一定温度下，用同一密度瓶分别称量样品溶液和蒸馏水的质量，两者之比即为该样品溶液的相对密度。 （3） 测定方法 将带有温度计的精密密度瓶依次用洗液、自来水、蒸馏水、乙醇洗涤后，烘干并冷却，精密称重。装满温度小于20℃的样液，插入温度计后，置入20℃的恒温水浴中，待样液温度达到20℃时保持in2m0，用滤纸条吸去毛细管溢出的多余样液，盖上毛细管上的小帽后取出。用滤纸把瓶外液体擦干，置感量10g/10分析天平上称重，即可测出20℃时一定容积样液的质量。将样液倾出，洗净密度瓶后，装入煮沸in30m并冷却至20℃以下的蒸馏水，按测定样液的方法同样操作，测出同体积02℃蒸馏水的质量。 （4） 计算 m−m2020 d=20m−m10式中：m——密度瓶的质量，g； 0m——密度瓶和蒸馏水的质量，g； 1m——密度瓶和样液的质量，g。 2（5）说明 ①本法适用于测定各种液体食品的相对密度，测定结果准确，但操作较烦琐。 ②测定挥发性的样液时，宜使用带温度计的精密密度瓶；测定较粘稠的样液时，宜使用带毛细管的普通密度瓶。 ③液体必须装满密度瓶，并使液体充满毛细管，瓶内不得有气泡。 2
④拿取恒温后带毛细管的普通密度瓶时，不得用手直接接触其球部，应带隔热手套或用工具拿取；天平室温度不得高于20℃，避免液体受热膨胀流出。 ⑤水浴中的水必须清洁无油污，防止污染瓶外壁。 2 密度计法 （1）仪器 密度计法是最便捷适用的测定液体相对密度的方法，但准确度不如密度瓶法。密度计是根据阿基米德原理制成的，其种类很多，结构形式也基本相同：一个封口的玻璃管，中间部分略粗，内有空气，故能浮在液体中；下部有小铅球重垂，使密度计能直立于液体中；上部是一细长有刻度的玻璃管，如图24-所示。刻度是利用各种不同密度的液体标度的。食品工业中常用的密度计按其标度的方法不同，分为普通密度计、锤度计、乳稠计、波美计和酒精计等。 ① 普通密度计 普通密度计是直接以20℃时的密度值为刻度，由几支刻度范围不同的密度计组成一套。密度值小于1的（~00.）称为轻表，用于测定比水轻的液体；密度值大于1的（~0）称为重表，用于测定比水重的液体。 图4-2 普通密度计 ② 锤度计 锤度计是专用于测定糖液浓度的密度计，是以蔗糖溶液的重量百分含量为刻度，以°Bx表示。标度方法：20℃时，1%纯蔗糖溶液为1°Bx，2%纯蔗糖溶液为2°Bx，以此类推。对于不纯糖液来说，其读数则是溶液中视固形物的重量百分含量。若实测温度不是20℃，则应进行温度校正，见附表4-1。 ③ 乳稠计 乳稠计是专用于测定牛乳相对密度的密度计，测量相对密度的范围为10510541.~.。刻度是将相对密度值减去001.后再乘以100，以度来表示，符号为°，刻度范围即为5~145°。若实测温度不是20℃，则应进行温度校正，见附表4-2。 ④ 波美计 ○波美计是以波美度(Bé)来表示液体浓度大小的。按标度方法的不同分为多种类型，常用的波美计○○刻度刻制的方法是以20℃为标准，以在蒸馏水中为0Bé，在1c5l%aN溶液中为15Bé，在纯HOS（相24○对密度为）中为66Bé，其余刻度等距离划分。波美计亦有轻表和重表之分，分别用于测定相对密度小于1和大于1的液体。波美度与相对密度之间存在着下列关系： 145145○○轻表：Bé=−145 ， 重表：Bé=145− 2020dd2020（2）测定方法 将混合均匀的被测样液沿壁徐徐倒入适当容积的清洁量筒中，避免起泡沫。将密度计洗净擦干，缓缓放入样液中，待其静止后，再轻轻按下少许，然后待其自然上升，静止并无气泡冒出后，从水平位置读取与液面相交处的刻度值。同时测量样液的温度，如不是20℃，应加以校正。 （3）说明 ① 该法操作简便迅速，但准确性较差，需要样液量多，且不适用于极易挥发的样液。 ② 操作时应注意不要将密度计接触量筒的壁及底部，待测液中不得有气泡。 ③ 读数时应以密度计与液体形成的弯月面的下缘为准。若液体颜色较深，不易看清弯月面下缘时，则以弯月面上缘为准。 二 折光法 通过测量物质的折射率来鉴别物质的组成，确定物质的纯度、浓度及判断物质的品质的分析方法称为折光法。 1 折射率与样液浓度的关系 折光仪是利用进光棱晶和折射棱晶夹着薄薄的一层样液，经过光的折射后，测出样液的折射率而得 3
到样液浓度的。 图4-3 光的全反射 图4-3中MM′线的上部为光疏介质，下部为光密介质。根据光的折射定律，当光线从光疏介质进入光密介质（如从样液射入棱晶中）时，因n（样液）＜n（棱晶），折射角恒小于入射角（α＜α），即折射1221线比入射线靠近法线；反之，当光线从光密介质进入光疏介质（如从棱晶射入样液）时，因n（棱晶）＞n12（样液），折射角恒大于入射角（α＞α），即折射线比入射线偏离法线。在后一种情况下，如逐渐增大入12射角α，折射线会进一步偏离法线，当入射角增大到某一角度时，其折射线会沿两介质的交界面平行射2出（4′线），不再进入光疏介质，这种现象称为光的全反射，此时的入射角称为临界角，以α临表示，入射线为临界线。发生全反射时，若光线从光疏介质射向光密介质，则所有的入射光（1′2′3′线）全部折射在临界角以内（1、2、3线），临界角以外无光线，结果临界线（4线）左边明亮，右边完全黑暗，形成明显的黑白分界。利用这一原理，通过实验可测出临界角α临。因为发生全反射时折射角等于90°，所以： n棱晶sin90= ，即 n样液n=棱晶 nisα临 n样液sinα临式中的n棱晶是折光仪棱晶的折射率，是已知的，而临界角α临则随样液浓度的大小而改变，可从棱晶的旋转角度读出，因此，只要测得了α临，就可求出n样液。 溶液的折射率与相对密度一样，随着浓度的增大而递增。折射率的大小取决于物质的性质，即不同的物质有不同的折射率；对于同一种物质，其折射率的大小取决于该物质溶液的浓度的大小。 2折光仪的结构及原理 折光仪是利用光的全反射原理测出临界角而得到物质折射率的仪器。比较先进的是数字折光仪和自动温度补偿型手提折光仪。数字折光仪是采用光传感器进行自动浓度测量，并通过内置的微信息处理器对温度误差进行自动校正，测量准确度高达±20%.；自动温度补偿型手提折光仪则是通过内置的机构进行温度补偿。我国食品工业中最常用的是阿贝折光仪和手提式折光计，测定结果须进行温度校正。 阿贝折光仪的结构如图4-4所示。其光学系统由观测系统和读数系统两部分组成，见图4-5。 4
1—底座 2—棱晶调节旋钮 3—圆盘组(内有刻度板) 1—反光镜 2—进光棱晶 3—折射棱晶 4—色散补偿器4—小反光镜 5—支架 6—读数镜筒 7—目镜 5，10—物镜 6，9—分划板 7，8—目镜 11—转向棱晶 8—观测镜筒 9—分界线调节旋钮 10—消色调节旋钮 12—刻度盘 13—毛玻璃 14—小反光镜 11—色散刻度尺 12—棱晶锁紧扳手 13—棱晶组 图4-5 阿贝折光仪的光学系统 14—温度计插座 15—恒温器接头 16—金属保护罩 17—主轴 18—反光镜 图4-4 阿贝折光仪 观测系统：光线由反光镜（1）反射，经进光棱晶（2）、折射棱晶（3）及其间的被测样液薄层折射后射出。再经色散补偿器（4）消除由折射棱晶及被测样液所产生的色散，然后由物镜（5）将明暗分界线成像于分划板（6）上，经目镜（7）、（8）放大后成像于观测者眼中。 读数系统：光线由小反光镜（14）反射，经毛玻璃（13）射到刻度盘（12）上，经转向棱晶（11）及物镜（10）将刻度成像于分划板（9）上，通过目镜（7）、（8）放大后成像于观测者眼中。 光线在阿贝折光仪内进行的情况如图4-6所示。CBA和DFE是进光棱晶和折射棱晶的纵刨面图，∠C、∠D为90°，∠B、∠E为60°，其间是厚约的样液薄层。当光线L由进光棱晶I点射入到达BA液面时，由于被测样液的折射率不同，将有一部分光反射或全反射。若旋转棱晶使NOI′等于临界角α临，即产生全反射，则所有入射角小于临界角的光线（即图4-6中临界线OI临界线左方的光线及与它们平行的光线）可折射进入样液层，然后通过折光棱晶投影到物镜K上，物镜把一组组平行光束（S，S′，S〞及U，U′，U〞等）汇集于视野 YX，呈现光亮；所有入射角大于临界角的光线（即图4-6中临界线OI右方的光线及与它们平行的光线）发生全反射不能进入样液层，因而也不能达到视野YX，故呈现黑暗。由此在视野中便出现了明暗两部分。 图4-6 阿贝折光仪的光路图 5
由于样液的浓度不同，折射率不同，故临界角的大小也不同。又因折射率与临界角成正比，故在刻度尺上直接刻上折射率或锤度（°Bx）值。当旋动棱晶调节旋钮，图4-4中（2）使视野内明暗分界线恰好通过十字线交点时，表示光线从棱晶射入样液的入射角达到了临界角，此时即可从读数镜筒中读取样液的折射率或锤度值。 阿贝折光仪也可在反射光中使用。使用时调整反光镜，图44-中（81），不让光线进入进光棱晶，同时揭开折射棱晶的旁盖，图4-4中（61），使光线从折射棱晶的侧孔进入，此时只用折射棱晶，进光棱晶只作盖用，其光学原理如图4-7所示。当棱晶旋至光线入射角OIN达到临界角时，OI成为临界线，所有入射角大于NOI的光线（即图4-7中OI线上方的光线及与它们平行的光线）发生全反射，产生明亮视野；所有入射角小于NOI的光线（即图4-7中OI线下方的光线及与它们平行的光线）折射进入样液层，只有一小部分反射，故视野比较暗。这样，在视野中便产生明暗分界。此方法适用于深色样液的测定，可以减少色散程度，使视野分界清晰。 图4-7 阿贝折光仪在反射光中使用时的光路图 3 影响折射率测定的因素 （1） 光波波长的影响 物质的折射率因光波波长而异。波长较长时物质的折射率较小，波长较短时物质的折射率较大。测定时光源通常为白光。当白光经过棱晶和样液发生折射时，因各色光的波长不同，折射程度也不同，折射后分解成为多种色光，这种现象称为色散。光的色散会使视野明暗分界线不清，产生测定误差。 为了消除色散，在阿贝折光仪观测筒的下端安装了色散补偿器。它是由两块相同的阿米西棱晶组成。每个阿米西棱晶又由两块冕玻璃棱晶及其中间的一块成直角的燧石玻璃棱晶组成，其截面如图8-4所示。当调节消色旋钮，图4-4中（01）时，两个阿米西棱晶可同时反向转动。当两者处于图4-8（a）的位置时，补偿色散的能力最大，从L′方向进入的色散光可复合成白光。当处于图4-8（b）的位置时，两棱晶的作用相互抵消，整个补偿器不起作用。测定时根据白光通过折光棱晶和液层时产生的色散程度，调节消色旋钮，使两个阿米西棱晶处于图4-8（a）、（b）之间的适当位置，即可消除色散。 图4-8 色散补偿器 （2） 温度的影响 溶液的折射率随温度的变化而变化。温度升高折射率减小；温度降低折射率增大。折光仪上的刻度是在标准温度20℃时刻制的。若测定温度不是02℃，则应将测定结果进行温度校正（见附表4-3）。 4 阿贝折光仪的使用方法 6
（1） 分开两棱晶，以脱脂棉球蘸取乙醇擦净，挥干乙醇。滴21~滴样液于下面棱晶的平面中央，迅速闭合两棱晶，调节反光镜，使两镜筒内视野最亮。 （2） 由目镜观察，转动棱晶旋钮，使视野出现明暗两部分。 （3） 转动色散补偿器旋钮，使视野中只有黑白两色。 （4） 转动棱晶旋钮，使明暗分界线在十字线交叉点上。 （5） 从读数镜筒中读取折射率或锤度值。 （6） 测定样液的温度。 （7） 打开棱晶，用蒸馏水、乙醇或乙醚擦净棱晶表面及其它各机件。 三 旋光法 应用旋光仪测量旋光性物质的旋光度以确定其浓度、含量及纯度的分析方法称为旋光法。 1 旋光法的基本原理 （1） 自然光与偏振光 光是一种电磁波，是横波，即光波的振动方向与其前进方向互相垂直。自然光有无数个与光线前进方向互相垂直的光波振动面。若光线前进的方向指向我们，则与之互相垂直的光波振动平面可表示为图4-9中的（a），图中箭头表示光波振动方向。若使自然光通过尼克尔棱晶，由于尼克尔棱晶只能让振动面与尼克尔棱晶光轴平行的光波通过，所以通过尼克尔棱晶的光只有一个与光线前进方向垂直的光波振动面，如图9-4中的（b）。这种只在一个平面上振动的光叫偏振光。 图4-9 自然光与偏振光 （2） 偏振光的产生 产生偏振光的方法很多，通常是用尼克尔棱晶或偏振片。 把一块方解石的菱形六面体末端的表面磨光，使镜角等于86°，然后将其对角切成两半，把切面磨成光学平面后，再用加拿大树胶粘在一起，便成为一个尼科尔棱晶（见图4-10）。由于方解石的光学特性，当自然光通过尼科尔棱晶时，发生双折射，产生两道振动面互相垂直的平面偏振光。其中O称为寻常光线，E称为非常光线。方解石对它们的折射率不同，对寻常光线的折射率是5681.；对非常光线的折射率是。加拿大树胶对两种光线的折射率都是。寻常光线O由方解石到加拿大树胶是由光密介质到光疏介质，因其入射角（76°25′）大于临界角（96°21′）而被加拿大树胶层全反射，并被涂黑的侧面吸收。非常光线E由方解石到加拿大树胶是由光疏介质到光密介质，必将发生折射而通过加拿大树胶，由棱晶的另一端射出，从而产生了平面偏振光。 图 4-10 尼科尔棱晶 7
用偏振片产生偏振光的原理是利用某些双折射晶体（如电气石）的二色性，即可选择性吸收寻常光线，而让非常光线通过的特性，把自然光变成偏振光。 （3） 光学活性物质、旋光度与比旋光度 分子结构中凡有不对称碳原子，能把偏振光的偏振面旋转一定角度的物质称为光学活性物质。许多食品成分都具有光学活性，如单糖、低聚糖、淀粉以及大多数氨基酸等。其中能把偏振光的振动面向右旋转的，称为“具有右旋性”，以（+）号表示；反之，称为“具有左旋性”，以（-）号表示。 偏振光通过光学活性物质的溶液时，其振动平面所旋转的角度叫做该物质溶液的旋光度，以 α°表示。旋光度的大小与光源的波长、测定温度、光学活性物质的种类、溶液的浓度及液层的厚度有关。对于特定的光学活性物质，在光波长和测定温度一定的情况下，其旋光度α与溶液的浓度c和液层的L成正比。即： α=KcL t当光学活性物质的浓度为l/011g0m，液层厚度为1dm时所测得的旋光度称为比旋光度，以[α]表λ示。由上式可知： t[α]tλ[α]=K×100×1，即 =K λ100cLt故 α[=α] λ100t式中：[α]——比旋光度，°； λt——测定温度，℃； λ——光源波长，nm； α——旋光度，°； L——液层厚度或旋光管长度，dm； c——样液浓度，lg/m。 比旋光度与光波波长及测定温度有关。通常规定用钠光D线（λn=）在 20℃时测定，此20时，比旋光度用[α]表示。主要糖类的比旋光度见表4-1。 D表4-1 糖类的比旋光度 糖类 糖类 2020[α] [α] DD葡萄糖 + 乳糖 + 果糖 麦芽糖 + 转化糖 糊精 + 蔗糖 + 淀粉 + t因在一定条件下比旋光度[α]是已知的，L为一定，故测得了旋光度α就可以计算出旋光质溶液λ的浓度c。 （4） 变旋光作用 具有光学活性的还原糖类（如葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等）溶解后，其旋光度起初迅速变化，然后渐渐变化缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋光作用。这是由于这些还原性糖类存在两种异构体，即α型和β型，它们的比旋光度不同。因此，在用旋光法测定蜂蜜或商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，宜将配成溶液后的样品放置过夜再测定。 （5） 2-ZZW型自动旋光仪的结构及原理 8
2-ZZW型自动旋光仪采用光电检测自动平衡原理进行自动测量，测量结果由数字显示。它既保持了1-ZZW型自动指示旋光仪稳定可靠的优点，又弥补了它读数不方便的缺点，具有体积小，灵敏度高，没有人为误差，测定迅速及读数方便等特点。目前在食品分析中应用十分广泛。 1—光源 2—小孔光栏 3—物镜 4—滤色片 5—起偏镜 6—磁旋线圈 7—试样 8—检偏镜 9—光电倍增管 图1 4-1 ZZW-2型自动旋光仪工作原理 仪器采用2W0钠光灯作光源，由小孔光栅和物镜组成一个简单的点光源平行光束（图14-1）。平行光源经起偏镜变为平面偏振光，其振动平面为OO（图4-a12），当偏振光经过有法拉弟效应的磁旋线圈时，其振动平面产生z5H0的β角往复摆动（图4-12b），光线经过检偏镜投射到光电倍增管上，产生交变的电讯号。 图4-12 光电自动旋光仪中光的变化 以两偏振镜光轴正交时（OO⊥PP）作为仪器零点，此时，α=0°。偏振光的振动平面因磁旋光效应产生的β角摆动，经过检偏镜后，光波振幅不等于零，因而在光电倍增管上产生微弱的光电流。在此情况下，若在光路中放入光学活性物质，它能将偏振光的振动平面旋转α°，经检偏镜后的光波振幅较大，在光电倍增管上产生的光电讯号也较强（图4-c12），光电讯号经前置选频功率放大器放大后，使工作频率为z5H0的伺服马达转动，通过蜗轮蜗杆把起偏镜反向转动α°，使仪器又回到零点状态，见（图4-d12）。起偏镜旋转的角度即为光学活性物质的旋光度，可在计数器中直接显示出来。 第三节 食品的物性测定 一 色度测定 1 饮料用水色度的测定 纯洁的水是无色透明的。但一般的天然水中存在有各种溶解物质或不溶于水的粘土类细小悬浮物，使水呈现各种颜色。如含腐殖质或高铁较多的水，常呈黄色；含低铁化合物较高的水呈淡绿蓝色；硫化氢被氧化所析出的硫，能使水呈浅蓝色。水的颜色深浅反映了水质的好坏。有色的水，往往是受污染的水，测定结果是以色度来表示的。色度是指被测水样与特别制备的一组有色标准溶液的颜色比较值。洁 9
净的天然水的色度一般在5~125°之间，自来水的色度多在1~50°左右。 水的色度有“真色”与“表色”之分。“真色”是指用澄清或离心等法出去悬浮物后的色度；“表色”是指溶于水样中物质的颜色和悬浮物颜色的总称。在分析报告中必须注明测定的是水样的真色还是表色。 测定水的色度有铂钴比色法和铬钴比色法。两种方法的精密度和准确度相同。前者为测定水的色度的标准方法，此法操作简便，色度稳定，标准比色系列保存适宜，可长时间使用，但其中所用的氯铂酸钾太贵，大量使用时不经济。后者是以重铬酸钾代替氯铂酸钾，便宜而且宜保存，只是标准比色系列保存时间较短。 （1） 铂钴比色法 ① 原理 将水样与已知浓度的标准比色系列进行目视比色以确定水的色度。标准比色系列是用氯铂酸钾和氯2-化钴试剂配制而成，规定每升水中含g1m铂 [以（PtCl）形式存在 ]时所具有的颜色作为一个色度单6位，以1°表示。 ② 仪器 感量g010/分析天平，比色管架，l05m具塞无色比色管，l5m吸管。 ③ 试剂 ⅰ 浓盐酸（密度119.）。 ⅱ 铂—钴标准贮备液：准确称取4625g1 .KPtCl，再用具盖称量瓶称取.0g10干燥的 CoCl·H6O，2622溶于含l100m浓盐酸的蒸馏水中，用蒸馏水定容至l010m。此标准溶液的色度为500°（Hasen值）。 ⅲ 铂—钴标准比色系列：精确吸取000.、500.、010.、、、、、、、和m0l05.铂—钴标准贮备液于11支l50m具塞比色管中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，则各管色度依次为0°、5°、01°、15°、02°、52°、30°、35°、40°、45°和50°。此标准系列的有效期为6个月。 ④ 操作 取l50m透明的水样于比色管中，在白色背景下沿轴线方向用目视比色法与标准系列进行比较。如水样色度过高，可取少量水样，用蒸馏水稀释后再比色，然后将测定结果乘以稀释倍数。如水样与标准系列的色调不一致，即为异色，可用文字描述。 ⑤ 计算 MC=×500 V式中：C——水样的色度，°； M——铂—钴标准溶液的用量，lm； V——水样的体积，lm。 （2） 铬钴比色法 ① 原理 重铬酸钾和硫酸钴配制成与天然水黄色色调相同的标准比色系列，用目视比色法测定，单位与铂钴比色法相同。 ② 仪器 同（1）法。 ③ 试剂 ⅰ 浓硫酸（密度814.）。 ⅱ 铬—钴标准液：准确称取0 及10 .0goOCS·7HO溶于少量蒸馏水中，加入浓，然后定容至l500m，摇匀。此溶液色度为500°。 24ⅲ 稀盐酸溶液：吸取l1m浓盐酸用蒸馏水定容至l010m。 ⅳ 铬—钴标准比色系列：准确吸取000.、500.、010.、、、、、、、和m0l05.铬—钴标准液于11支lm05具塞比色管中，用稀盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，则各管色度依次为0 10
°、5°、01°、15°、02°、52°、30°、35°、40°、45°和50°。 ④ 操作 同（1）法，只是水样管与铬—钴标准比色系列进行比色。 ⑤ 计算 同（1）法。 （3）说明 ① 铂钴和铬钴比色法适用于测定生活饮用水及其水源水的色度测定。浑浊的水样需先离心，然后取上清液测定。 ② 水样要用清洁的玻璃瓶采集，并尽快进行测定。避免水样在贮存过程中发生生物变化或物理 变化而影响水样的颜色。 ③ 水样的颜色通常随pH值的升高而增加，因此，在测定水样色度的同时测定水样的pH值，并在分析报告中注明。 ④ 液态物质色度的测定也可以采用分光光度法。该方法保留了原标准以“铂—钴标准溶液”nesaH值为色度计量单位的基本原则，参照国际照明委员会关于色觉三激值的科学观念，对原色度测定方法做了新的定量化的改进。 2 啤酒色度的测定 （1） 原理 将除气后的啤酒注入CBE比色计的比色皿中，与标准EBC色盘比较，目视读数或自动数字显示出啤酒的色度，以EBC色度单位表示。 )2(仪器 EBC比色计（或使用同等分析效果的仪器）：具有07E2~单位的目视色度盘或自动数据处理与显示装置。 )3(试剂 哈同（ogtrnaH）基准溶液：称取重铬酸钾（KCrO）1000g.和亚硝酰铁氰化钠227（aN)[eCF(N]ON·2HO），用蒸馏水溶解并定容至L0100m，贮于棕色瓶中，于暗处放置24h252后再使用。 )4(操作 ① 仪器校正：将哈同溶液注入m40m比色皿中，用EBC比色计测定。其标准色度应为单位；若使用25mm比色皿，其标准色度应为。仪器应每个月校正一次。 ② 样品测定：将除气啤酒注入m25m比色皿中，再放入EBC比色计的比色盒中，与标准色盘进行比较，当两者色调一致时，直接读数；或使用自动数字显示色度计，自动显示结果。 )5(计算 S=X×25× H/n式中：X——啤酒的色度，EBC； S——实测色度，EBC； H——所使用比色皿的厚度，mm； 25——换算成标准比色皿的厚度，mm； n——稀释倍数。 )6(说明 ① 同一样品的两次测定值之差，色度为21E0BECB~C时，不得大于；色度大于10EBC时，稀释样品的平行测定值之差不得大于。 ②测定浓色或黑色啤酒时，需要将啤酒稀释至合适的色度范围（即720C~.范围内），然后将实验结果乘以稀释倍数。 ③一般淡色啤酒的色度在0E5~.范围内；浓色啤酒的色度在.04C10CE5E~范围内。 11
二 粘度测定 粘度，即液体的粘稠程度，它是液体在外力作用下发生流动时，分子间所产生的内摩擦力。粘度的大小是判断液态食品品质的一项重要物理常数。 粘度有绝对粘度、运动粘度、条件粘度和相对粘度之分。绝对粘度，也叫动力粘度，它是液体以/s1cm2的流速流动时，在每cm液面上所需切向力的大小，单位为“aP·s（帕·秒）”。 1Pa·0m/1cg=s· s2运动粘度，也叫动态粘度，它是在相同温度下液体的绝对粘度与其密度的比值，单位为“m/s”。 242-3333 1m/s=10mc/s =10aP·s×m/g=1 0aP·s×cm/g 条件粘度是在规定温度下，在指定的粘度计中，一定量液体流出的时间（s）或将此时间与规定温度下同体积水流出时间之比。相对粘度是在t℃时液体的绝对粘度与另一液体的绝对粘度之比，用以比较的液体通常是水或适当的液体。 3-粘度的大小随温度的变化而变化。温度愈高，粘度愈小。纯水在20℃时的绝对粘度为10aP·s。 测定液体粘度可以了解样品的稳定性，亦可揭示干物质的量与其相应的浓度。粘度的数值有助于解释生产、科研的结果。 粘度的测定方法按测试手段分为毛细管粘度计法、旋转粘度计法和滑球粘度计法等。毛细管粘度计法设备简单、操作方便、精度高。后两种需要贵重的特殊仪器，适用于研究部门。 1 毛细管粘度计法 （1） 原理 毛细管粘度计测定的是运动粘度。由样液通过一定规格的毛细管所需的时间求得样液的粘度。 （2） 仪器 ① 毛细管粘度计：如图34-1所示。常用的毛细管粘度计的毛细管内径有、、21.和四种。不同的毛细管粘度计有其不同的粘度常数，可根据被测样液的粘度情况选用。若无粘度常数时，可用已知粘度的纯净的02号或03号机器润滑油标定。 ② 水银温度计：分度10.℃。 ③ 秒表。 （3） 试剂 1—毛细管 2，2，5—扩张部分 石油醚（6900~°）或汽油，乙醚、铬酸洗液。 4，7—管身 6—支架a，b—标线 （4） 操作 图4-13 毛细管粘度计 ① 将选用的粘度计用石油醚或汽油洗净。若粘度计沾有污垢，就用铬酸洗液、自来水、蒸馏水和乙醇依次洗涤，然后放入烘箱中烘干，或用通过棉花滤过的热空气吹干，备用。 ② 在毛细管粘度计支管（6）上套上橡皮管，并用手指堵住管身（7）的管口，同时倒置粘度计，将管身插入样液中，用吸耳球从支管的橡皮管中将样液吸到标线a处，注意不要使管身扩张部分（3）中的样液出现气泡或裂隙（如出现气泡或裂隙需重新吸入样液），迅速提起粘度计并使其恢复至正常状态，同时擦掉管身的管端外壁所粘附的多余样液，并丛支管（6）上取下橡皮管套在管身（4）的管端上。 ③ 把盛有样液的粘度计浸入预先准备好的20±℃恒温水浴中，使其扩张部分（2）和（3）完全浸没在水浴中，将其垂直固定在支架上。 ④ 恒温in0m1后，用吸耳球从管身（4）的橡皮管中将样液吸起吹下搅拌样液，然后吸起样液使充满扩张部分（3），使下液面梢高于标线a。 ⑤ 取下吸耳球，观察样液的流动情况。当液面正好到达上标线a时，立即按下秒表计时，待样液继续流下至下标线b时，再按下秒表停止计时。 ⑥ 重复操作64~次，记录每次样液流经上、下标线所需的时间（s）。 12
（5） 计算 ν=Kτ 20022式中：ν——20℃时样液的运动粘度，cm/s； 2022K——粘度计常数，cm/s； τ——样液平均流出时间，s。 20 （6）粮食粘度的测定也多采用毛细管粘度计法。方法是将粉碎的试样在微沸状态下充分糊化，过滤后在50℃条件下测定糊化液的粘度。 2旋转粘度计法 )1(原理 旋转粘度计（图44-1）上的同步电机（1）以一定的速度带动刻度圆盘（2）旋转，又通过游丝（3）和转轴带动转子（4）旋转。若转子未受到阻力，则游丝与刻度圆盘同速旋转；当样液存在时，转子受到粘滞阻力的作用使游丝产生力矩。当两力达到平衡时，与游丝相连的指针（5）在刻度圆盘上指示出一数值，根据这一数值，结合转子号数及转速即可算出被测样液的绝对粘度。 （2）仪器 1—同步电机 2—刻度圆盘 旋转粘度计：测量范围0.~010P1a·s。 3—游丝 4—转子 5—指针 （3）操作 图4—4 1旋转粘度计作用原理图 ① 将旋转粘度计安装于固定支架上，校准水平。 ② 用直径不小于m70m的直筒式烧杯盛装样液，并保持样液恒温。 ③ 根据估计的被测样液的最大粘度值按表4-2选择适当的转子及转子转速，装好转子，调整仪器高度，使转子浸入样液直至液面标志为止。 ④ 接通电源，使转子在样液中旋转。 ⑤ 经多次旋转后指针趋于稳定时或按规定的旋转时间指针达到恒定值时，压下操纵杆，同时中断电源，读取指针所指示的数值。如读数值过高或过低，应改变转速或转子，务使读数在092~之间。 （4）计算 η=ks 式中：η——绝对粘度，aP·s； k——换算系数，见表4-3： s——刻度圆盘指针读数。 表4-2 不同转子在不同的转速下可测的最大粘度值（aP·s） 转速（60 r/min） 30 12 6 转子号 0 .2 0 .5 0 .1 01 .2 0 .5 0 12 1 5 2. 5 3 2 4 10 20 4 10 20 50 100 表 4-3 不同转子在不同转速时的换算系数（k） 转速（r/min） 60 30 12 6 转子号 0 .2 0 .0 11 1 2 5 10 13
2 5 10 25 50 3 20 40 100 200 4 100 200 500 1000 3 滑球粘度计法 （1）原理 滑球粘度计（即赫普勒尔粘度计），如图4-15，适于测定粘度较高的样液。它基于落体原理而设计的。测定方法是在一充满样液的玻璃管（有玻璃夹套）中，将一适宜比重的球体从玻璃管上线落至下线，根据落球时间，再结合被测样液的相对密度、球体的相对密度和球体系数，可以计算出样液的粘度。 （2）仪器 滑球粘度计：附有9个不同直径（从1059815m0~）的小玻璃球或钢球，粘度的测定范围为~0·s；超级恒温水浴；秒表。 图4—15 滑球粘度计 （3）操作 ① 将滑球粘度计与超级恒温水浴连接，调节水浴温度，使粘度计玻璃夹套流出的水温准确控制在20±℃。 ② 用吸管将预先调温至20℃的样液从管壁注入玻璃管中，勿使管内有气泡。 ③ 当样液充满玻璃管后，调整仪器在水平位置上。 ④ 将适当的小球放入玻璃管的被测样液中，随即将玻璃管顶端的塞子塞上，旋紧金属盖。 ⑤ in20m后，将玻璃管旋转801°。 ⑥ 待小球落到底部，停留约in10m使管内样液平静下来后，再迅速将玻璃管恢复至原位，此时小球缓缓地沿管壁滑下，用秒表测定小球从上标线下降至下标线的时间。 ⑦ 重复上述操作数次，将相差很小的结果取平均值。 （4）计算 η=K（ρ-ρ）t 12式中：η——粘度，aP·s； K——球体系数（适用于特定的球与特定的管）； ρ——小球的相对密度； 1ρ——被测样液的相对密度； 2t——小球降落时间，s。 （5）说明 ① 小球下降速度以in31~m下降5cm为宜，并具此选择球的大小。 ② 必须准确地测定粘度计所附小球的K值。如将小球用于另一粘度计，则K值要另行测定。测定K值的方法是将已知粘度的纯甘油或0~670°Bx的纯蔗糖溶液装入粘度计的玻璃管中，按测定样液粘度的方法进行测定，然后再计算K值： ηK= (ρ1−ρ2)t三 质构测定 食品除了它的营养价值外，它的物理性能也很重要。在食品生产过程中，存在着大量与物性量化相关的问题。例如，为节省成本厂家需寻找合适且经济的原料及进货来源；为提高市场竞争力须开发出能合乎消费者口味的产品；为确保不同的厂家产品质量的一致性，需要制定企业可行的统一质量与规格标准；对于大型的集团企业，则要避免各个子公司间因执行者主观标准的差异而造成的巨大物流损失和管理缺陷等。物理性能是食品重要的品质因素，主要包括硬度、脆性、胶黏性、回复性、弹性、凝胶强度、 14
耐压性、可延伸性及剪切性等，他们在某种程度上可以反映出食品的感官质量。质构仪（uerxet TyzelrAna）是使这些食品的感官指标定量化的新型仪器。 1 质构仪的结构及工作原理 质构仪包括主机、专用软件、备用探头及附件。测量部分由操作台、转速控制器、横梁、底座、直流电机和探头组成，结构如图64-1所示。横梁（1）固定在立柱（3）上，可以上下移动，用以调节操作台（4）与横梁的初始间距。固定在横梁上的压力传感器可准确测量受力的大小。转速控制器（5）控制操作台的移动速度，正反开关（6）负责改变操作台的上下移动方向。 1—横梁 2—探头 3—立柱 4—操作台 5—转速控制器 6—正反开7—底座 8—支流电机 图4-16 食品质构仪结构简图 食品的物理性能都与力的作用有关，故质构仪提供压力、拉力和剪切力作用于样品，配上不同的样品探头（2），来测试样品的物理性能。根据不同的食品形态和测试要求，选择不同的测样探头。如柱形探头（直径2~m50m）常用于测试果蔬的硬度、脆性、弹性等；锥形探头可对黄油及其它粘性食品的粘度和稠度进行测量；模拟牙齿咀嚼食物动作的检测夹钳可以测量肉制品的韧性和嫩度；利用球形探头则可以测量休闲食品（如薯片）的酥脆性；挂钩形的探头可测面条的拉伸性等。测试原理是操作台表面的待测物随操作台一起等速的进行上升或下降运动，在与支架上的探头接触以后，把力传给压力传感器，压力传感器再把力信号转换成电信号输出，由放大器进一步把这种微弱的电信号放大成±5V范围的标准电压信号，然后输出给A/D板，A/D板再把标准电压信号转换成数字信号，输入计算机进行实时监控，并储存起来用于数据的分析处理。 图4-17 绿熟番茄质地特性曲线 2 测试方法 仪器主要围绕着距离、时间和作用力对试验对象的物性和质构进行测定，并通过对它们相互关系的处理、研究，获得试验对象的物性测试结果。测试前，首先按试验对象的测试要求，选用合适的探头，并根据待测物的形状大小，调整横梁与操作台的间距，然后选择电机转速及操作台的运动方向，当操作台及待测物运动以后，启动计算机程序进行数据采集。以绿熟番茄果实为研究对象，测试的典型物理性 15
能曲线如图1-74所示。标准的AT（xt euerTrneaAzly）参数有mF（突破力）、Lm（形变距离）、/LmFm（硬度）、F21m/·Lm（第一压力能）及/FLmm（柔性）等。图中反映了番茄组织的多个结构特性，组织抗穿透的能力表现为第一个峰值，即突破力；从探头接触试验对象表面开始到与突破点对应的穿透距离称为形变距离；穿透曲线线性部分的斜率从数值上表示的是穿透力积累的速率，但反映了果实组织的硬度特性；面积S表示果实的第一压力能，是果实表皮被穿透时所做的功，反映了果皮的坚韧程度；以及硬度的倒数反映了果实的柔性。其中突破力、形变距离、刚性和压力能都可以作为果蔬的物性指标。 思考题 1． 密度瓶法测定样液相对密度的基本原理？试说明密度瓶上的小帽起什么作用？ 2． 密度计的表面如果有油污会给密度的测定带来怎样的影响？试用液体的表面张力作用原理进行分析。 3． 阿贝折光仪利用反射光测定样液浓度的基本原理，试用其光路图表示之。 4． 简述旋光法测定样液浓度的基本原理。 5． 测定水及样液色度的意义。 6． 粘度的测定方法有几种？各有什么特点？ 7． 食品的物理性能主要包括哪些方面？举例说明食品物性的量化与食品分析的关系。 16
第五章 水分和水分活度的测定 第一节 概 述 人类和动植物体的生存离不开水，对于生命来说水具有十分重要的意义：它不仅是身体中体温的重要调节剂、溶剂、营养成分和废物的载体，还是一种反应剂和反应介质、润滑剂和增塑剂、生物大分子构象的稳定剂。 生命离不开水，我们日常所消费的食品也离不开水。水分是食品的重要组成成分，其含量的多少，影响着食品的感官性状、结构以及对腐败的敏感性。在食品体系内，水不仅以纯水状态存在，而且还常常溶解一些可溶性物质，如糖类和许多盐类；淀粉、亲水性蛋白质等高分子物质也会分散在水中从而形成凝胶，来赋予食品一定的形态；即使不溶于水的物质如脂肪和某些蛋白质，也能在适当的条件下分散于水中成为乳浊液或胶体溶液。 食品体系的组成离不开水，但是，当某些食品的水分增加或减少到一定程度时会对其本身的品质产生影响，如水分含量增加时，脱水蔬菜的非酶褐变会随之增加；水分含量的减少亦可导致蛋白质的变性、糖和盐的结晶；另外，食品的腐败变质与其中的水分含量也有一定的关系。所以，控制食品中的水分含量，对于保持食品良好的感官性状、维持食品中其他组分的平衡关系及保证食品具一定的保存期均起着重要作用。 由于食品中水分的重要作用，在食品分析中，水分的测定是一个很重要的项目，它对于计算生产中的物料平衡、实行工艺监督以及保证产品质量等方面，都具有很重要的意义。 在介绍食品中水分的测定方法之前，我们先来看看食品中水分的存在状态。 一、水分的存在状态 不同食品的水分含量差异很大，如表5-1所示。根据水在食品中所处的状态不同以及与非水组分结合强弱的不同，可把食品中的水划分为以下三类： （1）自由水——自由水是以溶液状态存在的水分，它保持着水本身的物理性质，在被截留的区域内可以自由流动。自由水在低温下容易结冰，可作为胶体的分散剂和盐的溶剂，一些能使食品发生质变的反应及微生物活动可在其中进行。在高水分含量的食品中，自由水含量可以达到总含水量的90%以上。 （2）亲和水——亲和水可存在于细胞壁或原生质中，是强极性基团单分子外的几个水分子层所包含的水，以及与非水组分中的弱极性基团以氢键结合的水。它向外蒸发的能力较弱，与自由水相比，蒸发时需要吸收较多的能量。 （3）结合水——结合水又称束缚水，是食品中与非水组分结合最牢固的水，如葡萄糖、麦芽糖、乳糖的结晶水以及与食品中的蛋白质、淀粉、纤维素、果胶物质中的羧基、氨基、羟基、巯基通过氢键结合的水。结合水的冰点为－40 °C，它与非水组分之间配价键的结合力比亲和水与非水组分间的结合力大得多，很难用蒸发的方法排除出去。结合水在食品内部不能作为溶剂，微生物及其孢子也不能利用它来进行繁殖和发芽。 在食品中，以自由水形态存在的水分在加热时容易蒸发；而以另外两种形态存在的水分，却不如前者来得容易，若对其进行长时间的加热，非但不能将其去除，反而会使食品发生质变，影响分析结果。所以水分测定要在一定的温度、时间和规定的操作条件下进行方能得到满意的结果。
二、水分的测定方法 食品分析中水分测定的方法有多种，可以归为两大类：直接测定法和间接测定法。 利用水分本身的物理性质和化学性质去掉样品中的水分，再对其进行定量的方法称作直接测定法，如烘干法、化学干燥法、蒸馏法和卡尔-费休法；而利用食品的密度、折射率、电导、介电常数等物理性质测定水分的方法称作间接测定法，间接测定法不需要除去样品中的水分。 表 5-1 部分食品的水分含量和水分活度 食品 近似水分含量水分活度 食品 近似水分含量水分活(％) (％) 度 蔬菜 90以上 ～ 蜂蜜 16 水果 89～87 ～ 面包 约35 鱼贝类 85～70 ～ 火腿、香肠65～56 肉类 70以上 ～ 小麦粉 14 蛋 75 干燥谷类 － 果汁 88～86 苏打饼干 5 果酱 － 饼干 4 果干 21～15 ～ 西式糕点 25 果冻 18 ～ 香辛料 － 糖果 － ～ 虾干 23 速溶咖啡 － 绿茶 4 巧克力 1 脱脂奶粉 4 葡萄糖 9～10 奶酪 约40 相比较而言，直接测定法精确度高、重复性好，但花费时间较多，且主要靠人工操作，广泛应用于实验室内。间接测定法所得结果的准确度一般比直接法低，而且往往需要进行较正，但间接法测定速度快，能够自动连续测量，可用于食品工业生产过程中水分含量的自动控制。在实际应用时，水分测定的方法要根据食品性质和测定目的而选定。水分测定的具体方法将在第二节中作详细阐述。 需要注意的是，在测定水分含量时，必须要预防操作过程中所产生的水分得失误差，或尽量将其控制在最低范围内。因此，任何样品都需要尽量缩短其暴露在空气中的时间，并尽可能地减少样品在碾碎过程中产生的摩擦热，否则会影响样品的水分含量，造成不必要的误差。nadewrV以下的实验表明了控制速度在水分测定过程中的重要性，他将32g~粉碎的切达干酪放在直径为的铝盒中，然后放在分析天平上，观察到水分的蒸发呈线形状态，而且其蒸发度与相对湿度有关。在0%5相对湿度时，每5s水分含量就减少了001.%；在70%相对湿度时，蒸发速度减少到原来的一半，即每1s0水分减少001.%，其水分蒸发曲线在inm5间隔后就成了线性。这也说明，在样品干燥前绝对有必要控制取样和称量的方式。 三、水分测定的意义 对于食品分析来说，水分含量的测定是最基本最重要的方法之一。去除水分后剩下的干基称为总固形物，其组分有蛋白质、脂肪、粗纤维、无氮抽出物和灰分等。下面的一些实例充分说明了水分在食品中的重要性：
（1）水分含量是产品的一个质量因素。如在果酱和果冻中，要防止糖结晶必须要控制水分含量；水果硬糖的水分含量一般控制在％以下，但过低会出现返砂甚至返潮现象；新鲜面包的水分含量若低于2%8～03％，则其外形干瘪、没有光泽。 （2）有些产品的水分含量（或固形物含量）通常有专门的规定，如国家标准中硬质干酪的水分含量≤42%（25045-B8G）；麦乳精（含乳固体饮料）的水分含量≤2%.5（B7G116-08）；蛋制品（巴氏消毒冰鸡全蛋）≤7%6（19769-42BG）；加工肉类食品时，水分的百分比通常也有专门的指标，如肉松太仓式（福建式）≤20%（≤%8）（B-2G974）。所以为了能使产品达到相应的标准，有必要通过水分检测来更好地控制水分含量。 （3）水分含量在食品保藏中也是一个关键因素，可以直接影响一些产品质量的稳定性，如脱水蔬菜和水果、奶粉、鸡蛋粉、脱水马铃薯、香料香精等。这就需要通过检测水分来调节控制食品中的水分含量。全脂乳粉的水分含量须控制在%～03%.以内，这种条件不利于微生物的生长，以延长保质期。 （4）食品营养价值的计量值要求列出水分含量。 （5）水分含量数据可用于表示样品在同一计量基础上其他分析的测定结果。 此外，各种生产原料中水分含量的高低，对于它们的品质和保存、成本核算、提高工厂的经济效益等均具有重大意义。因此，食品中水分含量的测定被认为是食品分析的重要项目之一。 第二节 水分的测定 一、干燥法 在一定的温度和压力下，通过加热方式将样品中的水分蒸发完全并根据样品加热前后的质量差来计算水分含量的方法，称为干燥法。它包括直接干燥法和减压干燥法。水分含量测定值的大小与所用烘箱的类型、箱内条件、干燥温度和干燥时间密切相关。这种测定方法虽然费时较长，但操作简便，应用范围较广。 （一）干燥法的注意事项： 1．干燥法的前提条件 应用干燥法测定水分的样品应当符合下述三个条件： （1）水分是样品中惟一的挥发物质。因为食品中挥发组分的损失会造成测量误差，例如醋酸、丙酸、丁酸、醇、酯和醛等。 （2）可以较彻底地去除水分。如果食品中含有较多的胶态物质，就很难通过直接干燥法来排除水分。 （3）在加热过程中，如果样品中其它组分之间发生化学反应，由此而引起的质量变化可以忽略不计。在分析过程中，样品中的水分含量与干燥温度和持续的时间有关，但当干燥时间持续太久、温度太高时，食品中其他的组分就会产生分解。水分检测存在的主要问题仍在于如何蒸发要去除的水，同时又不能因为其他成分分解所释放出的水分而使得结果偏高；同样，食品中有的成分的化学反应（例如蔗糖的水解）却要利用食品中的水分，这会使其测得的水分含量偏低。所以，如果当这些变化产生的影响很小时，可考虑使用烘箱干燥法。 2．操作条件的选择 在使用干燥法进行水分测定时，操作条件的选择显得相当重要，主要包括：称量瓶的选择、称样量、干燥设备和干燥条件等。
（1）称量瓶的选择：用于水分测定的称量瓶有各种不同的形状，从材料看有玻璃称量瓶和铝制称量瓶两种。玻璃称量瓶能够耐酸碱，不受样品性质的限制；而铝制称量瓶质量轻，导热性强，但对酸性食品不大适宜，常用于减压干燥法。称量瓶的盖子对防止样品因逸散而造成的损失有着重要意义，在蒸发水分时，盖子需斜靠在一边，这样可避免加热时样品溢出而造成的损失。如果使用的是一次性的称量皿，可选择使用玻璃纤维做的盖子。这种盖子既可防止液体的飞溅，同时又不阻碍表面的透气，能有效提高水分蒸发的效果。 称量瓶在使用之前需要进行预处理操作，而且在移动称量瓶时应该使用钳子，因为指纹也会对称量的结果产生影响。称量瓶的预处理可用100℃烘箱进行重复干燥，以使其达到恒重。所谓恒重，是指两次烘烤后称量的质量差不超过规定的毫克数，一般不超过gm2。预处理后的称量瓶需要存放在干燥器中。玻璃纤维盖子在使用前不需要干燥。 （2）称样量：样品的称取量一般以其干燥后的残留质量保持在51g~.3为宜。对于水分含量较低的固态、浓稠态样品，称样量应控制在53g~，而对于水分含量较高的果汁、牛乳等液态食品，通常每份样品的称样量在0~1g25为宜。 （3）干燥设备：在进行烘箱干燥时，除了使用特定的温度和时间条件外，还应考虑由于不同类型的烘箱而引起的温差变化。在对流型、强力通风型、真空烘箱中，温差最大的是对流型，这是因为它没有安装风扇，空气循环缓慢，烘箱中的称量瓶会进一步阻碍空气的流动。当烘箱门关闭后，温度上升通常比较慢，其温差最大可达10℃。若要得到较高准确度和精密度的数据，对流烘箱就显得不适用。 强力通风型烘箱的温差是所有烘箱中最小的，通常不超过1℃，其箱内空气由风扇强制在烘箱内作循环运动，这也使其具有了更多的优点，如：在空气沿水平方向通过支架时，无论上面是否装满称量瓶，测得的结果都是一致的。 真空干燥烘箱有两个特点：一、因为装有耐热钢化玻璃窗，通过它可以观察干燥进程；二、空气进入烘箱的方式不同。如果空气进出口安排在烘箱的两侧上，那么空气就会直接穿过整个箱体。部分新型真空烘箱在其底部和顶部开有进口和出口，空气可以先从前面向上运动，再返回至出口排出，其优点是最大程度地减少了“冷点”的存在，从而使内部空气中的水分完全蒸发。 （4）干燥条件：它包含两个因素即温度和时间。温度一般控制在5019~5℃，对热稳定的样品如谷类，可提高到13~210℃范围内进行干燥；而对含糖量高的食品应先用低温（5600~℃）干燥50h.，再用0~915℃进行干燥。干燥时间的确定有两种方式：一是干燥到恒重，另一种是规定一定的干燥时间。前者基本能保证水分完全蒸发；而后者则需根据测定对象的不同而规定不同的干燥时间，准确度不如前者，一般只适用于对水分测定结果的准确度要求不高的样品。 在干燥过程中，一些食品原料可能易形成硬皮或结块，从而造成不稳定或错误的水分测量结果。为了避免这个情况，可以使用清洁干燥的海砂和样品一起搅拌均匀，再将样品加热干燥直至恒重。加入海砂的作用有两个：一是防止表面硬皮的形成；第二可以使样品分散，减少样品水分蒸发的障碍。海砂的用量依样品量而定，一般每g3样品加入0~2g30的海砂就可以使其充分地分散。除了海砂之外，也可使用其它类似海砂的对热稳定的惰性物质，如硅藻土等。 在对干燥法作了一个大致的了解之后，接下来我们将具体介绍直接干燥法和减压干燥法的操作情况： （二） 直接干燥法 1．原理：
在一定的温度（0~915℃）和压力（常压）下，将样品放在烘箱中加热干燥，除去蒸发的水分，干燥前后样品的质量之差即为样品的水分含量。 2．适用范围： 直接干燥法适用于在1509~5℃下，不含或含其他挥发性物质甚微且对热稳定的食品。 3．样品的制备、测定及结果计算： 根据食品种类及存在状态的不同，样品的制备方法也不同。一般情况下，食品以固态（如面包、饼干、乳粉等）、液态（如牛乳、果汁等）和浓稠态（如炼乳、糖浆、果酱等）存在。 固体样品：取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于95～015℃烘箱中，瓶盖斜支在瓶边，加热50.～01h.，取出盖好，置干燥器内冷却50h.，称量，重复干燥直至恒重。称取~.切碎或磨细的样品，放入称量瓶中，样品厚度约为m5m。加盖，精确称量后，置于95℃～001℃烘箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2h~4后，加盖取出并放入干燥器中冷却后称量。然后再放入59℃～001℃干燥箱中再干燥h1左右，取出，放干燥器内冷却并称量，至前后两次称量结果的质量差不超过gm2为恒重。 液体样品：液体样品若直接在高温下加热，会因沸腾而造成样品损失，所以需低温浓缩后再进行高温干燥。 取洁净的蒸发皿，内加g001.海砂及一根小玻棒，放在100℃烘箱中，如上述方法重复干燥直至恒重。然后精确称取1g50~样品放于蒸发皿中，用小玻棒搅匀后放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的水滴，置95～100℃烘箱中干燥4h后盖好取出，并放在干燥器内冷却50h.后称量。然后再放入烘箱中干燥h1左右，冷却h50.并称量，至前后两次称量结果质量差不超过g2m。 经过上述测量，样品中的水分含量为： m−m12X＝× 100m−m13式中：X——样品中的水分含量，0g0g/1； m——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）和样品的质量，g； 1 m——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）和样品干燥后的质量，g； 2 m——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）的质量，g。 3浓稠态样品：这种样品若直接干燥，表面易结壳焦化，使内部水分蒸发受到阻碍，故需要加入精制海砂或无水硫酸钠，搅拌均匀以增大蒸发面积。糖浆、甜炼乳等浓稠液体，一般要加水稀释，如糖浆稀释液的固形物含量应该控制在20％～30％。 测量结果按下式计算： (m+m)−m123=× X100m−m14式中： m——干燥前样品和称量瓶质量，g； 1 m——海砂（或无水硫酸钠）质量，g； 2 m——干燥后样品、海砂及称量瓶的总质量，g； 3 m——称量瓶质量，g。 4二步干燥法：对于水分含量在16%以上的样品，如面包之类的谷类食品，通常采用二步干燥法进行测定。先将样品称出总质量后，切成厚为2～3mm的薄片，在自然条件下风干15～2h0，使其与大气湿度大致平衡，然后再次称量，并将样品粉碎、过筛、混匀，放于洁净干燥的称量瓶中以直接干燥法测定水分，测量时按上述固体样品的程序进行。分析结果
按下式计算： mm−34m1m−2m+2()m3m−5X=×100 m1式中： m——新鲜样品总质量，g； 1m——风干后样品的质量，g； 2m——干燥前样品与称量瓶的质量，g； 3m——干燥后样品与称量瓶的质量，g； 4m——称量瓶重量，g。 5二步干燥法所得分析结果的准确度较直接用一步法来得高，但费时更长。 高温干燥：对于热稳定性较好的食品，如有些谷物，可采用102℃013~℃甚至更高的温度进行干燥，因而大大缩短干燥时间，这样的干燥方法称为高温干燥。 4．方法说明和注意事项： 直接干燥法的设备和操作都比较简单，但是由于直接干燥法不能完全排出食品中的结合水，所以它不可能测定出食品中的真实水分。直接干燥法耗时较长，且不适宜胶态、高脂肪、高糖食品及含有较多的高温易氧化、易挥发物质的食品；用这种方法测得的水分质量中包含了所有在100℃下失去的挥发物的质量，如微量的芳香油、醇、有机酸等挥发性物质的质量；含有较多氨基酸、蛋白质、及羰基化合物的样品，长时间加热则会发生羰氨反应析出水分而导致误差，宜采用其他方法测定水分含量；测定水分之后的样品，可以用来测定脂肪、灰分的含量；经加热干燥的称量瓶要迅速放到干燥器中冷却；干燥器内一般采用硅胶作为干燥剂，当其颜色由蓝色减退或变成红色时，应及时更换，于153℃条件下烘干2～h3后再重新使用；硅胶若吸附油脂后，除湿能力也会大大降低；在使用直接干燥法时，要观察水分是否蒸发干净，没有一个直观的指标，只能依靠是否达到恒重来判断；直接干燥法的最低检出限量为g0200.，当取样量为g2时，方法检出限为.01g0g0/，方法相对误差≤5%。 （三） 减压干燥法 1．原理： 采用较低的温度，在减压条件下蒸发排除样品中的水分，根据干燥前后样品所失去的质量计算样品的水分含量。 2．适用范围： 减压干燥法的操作压力较低，水的沸点也相应降低，因而可以在较低温度下将水分蒸发完全。它适用于在100℃以上加热容易变质及含有不易除去结合水的食品，如淀粉制品、豆制品、罐头食品、糖浆、蜂蜜、蔬菜、水果、味精、油脂等。由于采用较低的蒸发温度，可以防止含脂肪高的样品在高温下的脂肪氧化；可防止含糖高的样品在高温下的脱水炭化；也可防止含高温易分解成分的样品在高温下分解等等。 3．样品的测定及方法： 在真空干燥箱的低压条件下，样品中的水分可以在63h~内完全去除，而其他组分可以保持不分解。真空干燥箱内需要干燥的空气，可通过控制温度和真空度来加以干燥。较早的干燥空气的方法是通过装有一定体积浓硫酸的细颈真空瓶来进行，现在的真空干燥箱则使用空气捕集器，其中填装有硫酸钙，并含有显示水分饱和度的指示剂，在空气捕集器与真空干燥箱之间装有转子流量计以测量进入烘箱内的空气流量（Li/0mn102m~）。 减压干燥法的操作方法如下：样品的称取要求与直接干燥法相同，将样品放入真空干燥箱内，将干燥箱连接水泵，抽出箱内空气至所需压力（一般为ka3P54~0），并同时加热至
所需温度55℃左右，关闭通水泵或真空泵上的活塞，停止抽气，使干燥箱内保持一定的温度和压力，经一定时间后，打开活塞，使空气经干燥装置缓缓通入至干燥箱内，待压力恢复正常后再打开。取出称量瓶，放入干燥器中冷却50h.后称量，并重复以上操作至恒重。 4．水分含量的计算与直接干燥法相同。 5．方法说明及注意事项： 减压干燥法选择的压力一般为3~k45P0a，温度为0~560℃。但实际应用时可根据样品性质及干燥箱耐压能力不同而调整压力和温度，如CAOA法中咖啡的干燥条件为：和91080~℃；奶粉：kP3a13.和100℃；干果：k3Pa13.和70℃；坚果和坚果制品：k1P3a.和0~9015℃；糖和蜂蜜：和06℃。 减压干燥时，自干燥箱内部压力降至规定真空度时起计算干燥时间，一般每次烘干时间为2h，但有的样品需h5；恒重一般以减量不超过时为标准，但对受热后易分解的样品则可以不超过1～gm3的减量值为恒重标准。 不过，在使用真空干燥箱时还需注意：如果被测样品中含有大量的挥发物质，应考虑使用校正因子来弥补挥发量；另外，在真空条件下热量传导不是很好，因此称量瓶应该直接置放在金属架上以确保良好的热传导；蒸发是一个吸热过程，要注意由于多个样品放在同一烘箱中使箱内温度降低的现象，冷却会影响蒸发。但不能通过升温来弥补冷却效应，否则样品在最后干燥阶段可能会产生过热现象；干燥时间取决于样品的总水分含量、样品的性质、单位质量的表面积、是否使用海砂以及是否含有较强持水能力和易分解的糖类和其他化合物等因素。 二、蒸馏法 1．原理： 蒸馏法出现在二十世纪初，它采用与水互不相溶的高沸点有机溶剂与样品中的水分共沸蒸馏，收集馏分于接收管内，从所得的水分的容量求出样品中的水分含量。目前所用的有两种方法：直接蒸馏和回流蒸馏。在直接蒸馏中，使用沸点比水高、与水互不相溶的溶剂，样品用矿物油或沸点比水高的液体在远高于水沸点的温度下加热，而回流蒸馏则可使用沸点仅比水略高的溶剂如甲苯、二甲苯和苯。其中采用甲苯进行的回流蒸馏是应用最广泛的蒸馏方法。 2．适用范围： 蒸馏法采用了一种有效的热交换方式，水分可被迅速移去，食品组分所发生的化学变化如氧化、分解等作用，都较直接干燥法小。这种方法最初是作为水分测定的快速分析法被提出来的，设备简单经济，管理方便，准确度能够满足常规分析的要求。对于谷类、干果、油类、香料等样品，分析结果准确，特别是对于香料，蒸馏法是唯一的、公认的水分测定法。 图5-1蒸馏式水分测定仪 3．仪器及试剂： 蒸馏式水分测定仪（如图5-1）；精制甲苯或二甲苯：取甲苯或二甲苯，先以水饱和后，分去水层，进行蒸馏，收集馏出液备用。 4．操作方法： 称取适量样品（约含水L2~5m），放入l250m锥形瓶中，加入L5705~m新蒸馏的甲苯（或二甲苯）使样品浸没，连接冷凝管与水分接收管，从冷凝管顶端注入甲苯，装满水分接
收管。加热，当蒸馏瓶中甲苯刚开始沸腾时，可看到从蒸馏烧瓶中升起一团雾，这是水在甲苯中的蒸汽，不久就会有冷凝液产生。慢慢蒸馏，使每秒钟得馏出液2滴，待大部分水分蒸出后，加速蒸馏约每秒钟4滴，当水分全部蒸出后，接收管内的水分体积不再增加时，从冷凝管顶端加入甲苯冲洗。如冷凝管壁附有水滴，可用附有小橡皮头的铜丝将其擦下，再蒸馏片刻至接收管上部及冷凝管壁无水滴附着为止，读取接收管水层的体积。 5．水分含量的计算： V=× X100m式中：X——样品中的水分含量，L/10gm；或按水在20℃时密度L/计算质量含量； V——接收管内水的体积，Lm； m——样品的质量，g。 6．方法说明和注意事项： 蒸馏法与干燥法有较大的差别，干燥法是以烘烤干燥后减少的质量为依据，而蒸馏法是以蒸馏收集到的水量为准，避免了挥发性物质减少的质量以及脂肪氧化对水分测定造成的误差。 在使用蒸馏法时，对于有机溶剂的选择（表25-），可考虑如能否完全湿润样品、适当的热传导、化学惰性、可燃性以及样品的性质等因素，但样品的性质是选择溶剂的重要依据。对热不稳定的食品，一般不采用二甲苯，因为它的沸点高；因此常选用低沸点的，如苯、甲苯或甲苯-二甲苯的混合液；对于一些含有糖分、可分解释出水分的样品，如脱水洋葱和脱水大蒜，宜选用苯作为溶剂；可以用正戊醇＋二甲苯（121493~℃）（1＋1）混合液测定奶酪。对于比水重的溶剂，其特点是样品会浮在上面，不易过热及炭化，又安全防火。但是，它也存在一些缺点，如：这种溶剂被馏出冷凝后，会穿过水面进入接收管下方，增加了形成乳浊液的机会。 表5-2 蒸馏法有机溶剂的物理常数 有机溶剂 沸点（℃） 密度（25共沸混合物 水在有机溶剂中溶℃） 沸点（℃）水分（%） 解度（g/100g） 苯 甲苯 二甲苯 140 四氯化碳 四氯（代）乙烯 偏四氯乙烷 蒸馏法测量误差产生的原因的有很多，如：样品中水分没有完全蒸发出来；水分附集在冷凝器和连接管内壁；水分溶解在有机溶剂中；生成了乳浊液；馏出了水溶性的成分，等等。 在加热时一般要使用石棉网，如果样品含糖量高，用油浴加热较好。样品为粉状或半流体时，先将瓶底铺满干净的海砂，再加样品及甲苯。所用甲苯必须无水，也可将甲苯经过氯化钙或无水硫酸钠吸水，过滤蒸馏，弃去最初馏液，收集澄清透明溶液即为无水甲苯。为防止出现乳浊液，可以添加少量戊醇、异丁醇。最后，为了避免接收管和冷凝管附着水珠，使用的仪器必须清洗干净。
三、卡尔-费休（Karl-Fischer）法 卡尔-费休法，简称费休法或F-K法，是一种迅速而有准确的水分测定法，它属于碘量法，被广泛应用于多种化工产品的水分测定。此方法快速准确且不需加热，在很多场合，该法也常被作为水分特别是微量水分的标准分析方法，用于校正其它分析方法。 1．原理： 卡尔-费休法测定水分的原理基于水分存在时碘和二氧化硫的氧化还原反应。 2HO＋OS＋I IH2＋HOS22224 上述反应是可逆的，在体系中加入了吡啶和甲醇则使反应顺利向右进行。 CHN·I＋CHN·OS＋CHN＋HO→2CHN·IH＋CHN·OS55255255255553 CHN·OS＋CHHO→CHOS)H(N·CH55335543 由此反应式可知ol1m的水需要与ol1m碘、ol1m二氧化硫、olm3吡啶和olm1甲醇反应，而产生ol2m吡啶碘和1olm吡啶硫酸。反应完毕后多余的游离碘呈现红棕色，即可确定达到终点。现在所用的卡尔-费休水分测定仪采用“时间滞留”法作为终点判断准则，并有声光报警指示，如1-FKZ型容量滴定卡尔-费休水分测定仪。 2．适用范围： 卡尔-费休法可适用于含有1%或更多水分的样品，如砂糖、可可粉、糖蜜、茶叶、乳粉、炼乳及香料等食品中的水分测定，其测定准确性比直接干燥法要高，它也是测定脂肪和油类物品中微量水分的理想方法。 3．仪器和试剂： (1)仪器可用1-FKZ型容量滴定卡尔-费休水分测定仪或类似装置。卡氏试剂的配制可参阅01/820-BT91G或I51S3-8O8139《淀粉水解产品含水量测定方法》中的试剂配制，或分析手册中的方法。应用实例见本章第三节二之3。 (2)卡尔-费休试剂的标定： 在水分测定仪的反应器中加入L50m的无水甲醇，接通电源，启动电磁搅拌器，先用卡尔-费休试剂滴入甲醇中使其中残存的微量水分与试剂作用达到计量点，保持in1m内不变，此时不记录卡尔-费休试剂的消耗量。然后用10Lu的微量注射器从反应器的加料口缓缓注入1u0L水-甲醇标准溶液（相当于水），用卡尔费-休试剂滴定至原定终点，记录卡尔-费休试剂的消耗量。 卡尔-费休试剂的水当量T（Lg/m）按下式计算： m×0001T= V 式中：m——所用水-甲醇标准溶液中水的质量，g； V—— 滴定消耗卡尔-费休试剂的体积，Lm。 4．样品水分的测定： 对于固体样品，必须要先粉碎均匀。准确称取～5g00.样品置于称样瓶中。 在水分测定仪的反应器内加入L50m无水甲醇，用卡尔-费休试剂滴定其中的微量水分，滴定至终点并保持in1m不变时（不记录试剂用量）。打开加料口迅速将已称好的试剂加入反应器中，立即塞上橡皮塞，开动电磁搅拌器使试样中的水分完全被甲醇所萃取，用卡尔-费休试剂滴定至终点并保持in1m不变，记录所使用试剂的Lm数。 5．结果计算： 样品中水分的含量： T×V X= 01×m式中：X——样品中的水分含量，g/10m；
T——卡尔-费休试剂的水当量，Lg/m； V——滴定所消耗卡尔费休试剂，Lm； m——样品的质量，g。 6．卡尔-费休法说明及注意事项： 在使用卡尔-费休法时，若要水分萃取完全，样品的颗粒大小非常重要。通常样品细度约为40目，宜用粉碎机处理，不要用研磨机以防水分损失，在粉碎样品中还要保证其含水量的均匀性。 卡尔-费休法是测定食品中微量水分的方法，如果食品中含有氧化剂、还原剂、碱性氧化物、氢氧化物、碳酸盐、硼酸等，都会与卡尔-费休试剂所含组分起反应，干扰测定。含有强还原性的物料（如抗坏血酸）会与卡尔-费休试剂产生反应，使水分含量测定值偏高；羰基化合物则与甲醇发生缩醛反应生成水，从而使水分含量测定值偏高，而且这个反应也会使终点消失；不饱和脂肪酸和碘的反应也会使水分含量测定值偏高。 样品溶剂可用甲醇或吡啶，这些无水试剂应该要加入无水硫酸钠保存。此外，也可以使用其他溶剂，如甲酰胺或二甲基甲酰胺。卡尔费休滴定法中所用的玻璃器皿都必须充分干燥，外界的空气也不允许进到反应室中。 在卡尔-费休滴定法中，吡啶会产生强烈异味，现在有研究正在尝试用其它的胺类来代替吡啶来溶解碘和二氧化硫，目前已发现某些脂肪胺和其他的杂环化合物比较适宜。在这些新的胺盐的基础上，分别制备了单组分试剂（溶剂和滴定组分合在一起）和双组分的试剂（溶剂和滴定组分是分开的），单组分使用较方便，而双组分更适合于大量试剂的储存。 四、其他方法 1．介电容量法 介电容量法是根据样品的介电常数与含水率有关，以含水食品作为测量电极间的充填介质，通过电容的变化达到对食品水分含量的测定。用该方法测定水分含量的仪器需要使用已知水分含量的样品（标准方法测定）来进行校准，为了控制分析结果的可靠性和重现性，需要考虑样品的密度、样品的温度等重要因素，其中温度对电容值的影响是很大的，水分仪上都装有一个或两个温度传感器，对测定结果进行温度补偿。 由于水的介点常数（，20℃）比其他大部分溶剂都要高，所以可用介电容量法来进行水分的测定。例如：介电容量法常用于谷物中水分含量的测定，这是根据水的介电常数是，而蛋白质和淀粉的介电常数只有10。在检测样品时，可以根据仪器的读数从预先制作好的标准曲线上得到水分含量的测定值。 介电容量法的测量速度快，对于需要进行质量控制而要连续测定的加工过程非常有效，但该方法不大适用于检测水分含量低于30％%53~的食品。 我国生产的介电容量法水分测定仪有5-SWS型，3-CSL型，3-SLJ型等。 2．电导率法 电导率法的原理是当样品中水分含量变化时，可导致其电流传导性随之变化，因此通过测量样品的电阻，就成为一种具有一定精确度的快速分析方法。根据欧姆定律：电流强度等于电压与电阻之比。例如：含水量为13%的小麦的电阻是含水量为14%的小麦电阻的7倍，是含水量为1%5的小麦电阻的05倍。 在用电导率法测定样品时，必须要保持温度的恒定，而且每个样品的测定时间必须恒定为in1m。 我国生产的电阻式水分测定仪有A4-CKSL型，4-LT型等。
3．红外吸收光谱法 红外线是一种电磁波，一般指波长为~μm的光，红外波段的范围又进一步分为三部分：（1）近红外区，75025.~μm；（2）中红外区，522~.5μm；远红外区，0150~2μm。其中中红外区是研究、应用最多的区域，水分子对三个区域的光波均具有选择吸收作用。 红外吸收光谱法测定的是食品中的分子对（中、近红外）辐射的吸收，即频率不同的红外辐射被食品分子中不同的官能团所吸收，这与紫外可见光谱中的紫外光或可见光的应用相似。根据水分对某一波长的红外光的吸收强度与其在样品中的含量存在一定的关系建立了红外吸收光谱测水分法。 日本、美国和加拿大等国已将近红外吸收光谱法应用于谷物、咖啡、可可、核桃、花生、肉制品、牛乳、马铃薯等样品的水分测定；中红外法需要通过计算机处理才能分析水分和固形物含量，因为测定中红外光谱的仪器不能检出水分的波长。有人将中红外光谱法用于面粉、脱脂乳粉及面包中水分的测定，其结果与卡尔费休法、近红外光谱法及减压干燥法一致；远红外光谱法可测出样品中大约.005%的水分含量。总之，红外吸收光谱法准确、快速、方便，存在深远的研究意义和广阔的应用前景。 4．折光法 通过测量物质的折射率来鉴别物质的组成、确定物质的纯度、浓度及判断物质的品质的分析方法称为折光法。 折射率是物质的一种物理性质。它是食品生产中常用的工艺控制指标，通过测定液体食品的折射率，可以鉴别食品的组成、确定食品的浓度、判断食品的纯净程度和品质。如果操作正确且样品中无明显固体粒子存在时，折光法分析速度最快且准确性也非常高。折光法现已广泛应用于水果及水果类产品中可溶性固定物的测定。测得食品固形物的方法，也就是间接测定水分的方法。 需要指出的是：折光法只能测定可溶性固形物的含量，因为固体粒子不能在折光仪上反应出它的折射率。含有不溶性固形物的样品，不能用折光法直接测出总固形物含量。但对于番茄酱、果酱等个别食品，已通过实验制定了总固形物与可溶性固形物的关系表，先用折光法测定可溶性固形物的含量，即可查出总固形物的含量，也就可以得到样品中的水分含量。 有关折光法的原理与应用，详见第四章。 5．其他干燥法 化学干燥法： 化学干燥法就是将某种对于水蒸气具有强烈吸附的化学药品与含水样品一同装入一个干燥容器，如普通玻璃干燥器或真空干燥器中，通过等温扩散及吸附作用而使样品达到干燥恒重，然后根据干燥前后样品的的质量差计算出其中的水分含量。但此法的缺点是时间比较长，需要数天、数周甚至数月时间。用于干燥（吸收水蒸气）的化学样品叫干燥剂，主要包括五氧化二磷、氧化钡、高氯酸镁、氢氧化钾（熔融）、氧化铝、硅胶、硫酸（%100）、氧化镁、氢氧化钠（熔融）、氧化钙、无水氯化钙、硫酸（9%5）等，它们的干燥效率依次降低。其中数浓硫酸、固体氢氧化钠、硅胶、活性氧化铝、无水氯化钙等最为常用。该法适用于对热不稳定及含有易挥发组分的样品，如茶叶、香料等。 微波烘箱干燥法： 35微波是指频率范围为10～10MHz的电磁波。微波加热是靠电磁波把能量传播到被加热物体的内部，这种加热方法具有很多特点：①加热速度快。它利用被加热物体本身作为发热体而进行内部加热，不靠热传导的作用，可以令物体内部温度迅速升高；②加热均匀性好。因为它是内部加热，往往具有自动平衡的性能，所以与外部加热相比较，容易达到均匀加热
的目的；③加热易于瞬时控制。微波热惯性小，可以立即发热和升温，易于控制；④选择性吸收。某些成分非常容易吸收微波，另一些成分则不易，这种微波加热的吸收性有利于产品质量的提高。如：食品中的水分吸收微波能量要比干物质多得多，温度也高得多，这有利于水分的蒸发。干物质吸收微波能少，温度低，不过热，而且加热时间又短，因此能够保持食品的色、香、味等；⑤加热效率高。由于加热作用来自于物料本身，而且基本上不会辐射热能，所以热效率较高。 在食品工业中，部分食品在被包装之前可利用微波烘箱干燥法快速测定食品在生产过程中的水分含量，并据此加以调整。例如，在加工干酪时，在原料加入容器之前，可利用此法分析成分组成，并在搅拌之前调整成分，在以后的几个月内都应用微波烘箱干燥法来有效地控制水分。 红外线干燥法： 红外线干燥法是一种快速测定水分的方法，它以红外线发热管为热源，通过红外线的辐射热和直接热加热样品，高效迅速地使水分蒸发，根据干燥前后样品的质量差可以得出其水分含量。与采用热传导和对流方式的普通烘箱相比，热渗透至样品中蒸发水分所需的干燥时间能显著缩短至10～in25m。但比较起来，其精密度较差，可作为简易法用于测定2～3份样品的大致水分，或快速检验在一定允许偏差范围内的样品水分含量。 现在有很多型号的红外线测定仪，但基本上都是先规定测定条件后再使用，即要使得测定结果与标准法如直接干燥法测得的结果相同。仪器需要进行校正。在操作时，要控制红外线加热的距离，开始时灯管要低，然后升高；调节电压则开始应较高，后来再降低，这样既可防止样品分解、又能缩短干燥时间。此外还要考虑样品的厚度等因素，如粘性、糊状样品要放在铝箔上摊平；还要注意样品不能有燃烧和出现表面结成硬皮的现象。随着电脑技术的发展，红外线水分测定仪的性能得到了很大的提高，在测定精度、速度、操作简易性、数字显示等方面都表现出优越的性能。 在食品领域应用的水分分析方法还有很多，如气相色谱法、冰点分析法等，这些方法在其它文献上也有阐述，限于篇幅，在这里我们就不加赘述。 第三节 水分活度值的测定 一、水分活度值的测定意义 在前面几节里，我们将食品中的水分按其存在状态为三种，但实际上除了自由水以外，其余水分都是以不同程度的束缚状态存在。同时我们还介绍了许多水分测定的方法，但单纯的水分含量并不是表示食品稳定性的可靠指标。因为食品在存放过程中，经常会有腐败现象发生，其原因固然与食品中的水分含量有关，但腐败程度并不与其成正相关，因为相同含水量的食品却有不同的腐败变质现象。这种现象在一定程度上是由于水分与食品中的其他成分结合强度的不同造成的。 为了更好地定量说明食品中的水分状态，更好地阐明水分含量与食品保藏性能的关系，引入了水分活度（ater WAcittiyv）这个概念。 根据平衡热力学定律，水分活度可定义为：溶液中水的逸度（Fugatcyi）与纯水逸度之比值，即： f A＝ wf0
式中：A——水分活度； wf——溶剂(水)的逸度（逸度是溶剂从溶液中逃脱的趋势）； f——纯溶剂（水）的逸度。 0在低压（如室温）时，f/f与p/之间的差别小于1％。若要求两者相等，前提条件是00体系是理想溶液并且存在热力学平衡，但食品体系一般不符合上述两个条件，因此水分活度可近似地表示为溶液中水蒸汽分压与纯水蒸汽压之比： pHRE A≈＝ wp0010式中：p—溶液或食品中的水分蒸汽分压，一般说来，p随食品中易蒸发的自由水含量的增多而加大； p—为纯水的蒸汽压，可从有关手册中查出； 0ERH是平衡相对湿度（ EbqlruiiumRel avteiiditHyum），它是指食品中水分蒸发达到平衡时，即单位时间内脱离食品的水的摩尔数等于返回食品的水摩尔数的时候，食品上方恒定的水蒸汽分压与在此温度下水的饱和蒸汽压的比值（乘以100用整数表示）。 水分含量、水分活度值、相对湿度是不同的三个概念。水分含量是指食品中水的总含量，即一定量的食品中水的质量分数；水分活度反映了食品中水分的存在状态，即水分与其他非水组分的结合程度或游离程度。结合程度越高，则水分活度值越低；结合程度越低，则水分活度值越高。在同种食品中一般水分含量越高，其水分活度值越大，但不同种食品即使水分含量相同水分活度往往也不同。相对湿度指的却是食品周围的空气状态。 在水分活度的表达式中，p、 p和RHE都是温度的函数，因而水分活度也与温度有关，0luCaiosrluynCae-sp方程的转变形式体现了这两者的关系： nlA−ΔHw= 1RdT式中：T—热力学温度；R—气体常数；ΔH—在T温度下样品的吸湿热。 将上式转变为lnA关于1/T的的方程： w−ΔH nlA=+C wTR当样品的水分含量一定时，该方程在图上表示为一条直线。随着温度的升高，A也升w高，反之则降低；同一个样品在不同的水分含量下，A随温度的变化是水分含量的函数，w水分含量越高，温度的变化造成的A的变化也越大；样品的种类不同，温度变化所造成的w影响也不同，一般温度10℃的变化能导致A产生003.～20.的变化。所以，在测定A时要ww尽量保持温度的恒定，避免其波动带来的对测量值的影响。另外，lnA-1/T图并非总是直线，w当温度范围扩大到样品的冰点以下时，直线在冰点处会出现折断现象。这是因为：冻结前，水分活度是食品组成和温度的函数，并以前者为主；冻结后，冰的存在使水分活度不再受到食品中非水组分种类和数量的影响，而只与温度有关。 测定食品的水分活度往往有着重要的意义，主要从以下两方面来考虑。 第一，水分活度影响着食品的色、香、味和组织结构等品质。食品中的各种化学、生物化学变化对水分活度都有一定的要求。例如：酶促褐变反应对于食品的质量有着重要意义，它是由于酚氧化酶催化酚类物质形成黑色素所引起的。随着水分活度的减少，酚氧化酶的活性逐步降低；同样，食品内的绝大多数酶，如淀粉酶、过氧化物酶等，在水分活度低于805.的环境中，催化活性便明显地减弱，但脂酶除外，它在A为30.甚至10.时还可保留活性；w非酶促褐变反应——daMrlil反应也与水分活度有着密切的关系，当水分活度在～之
间时，反应达到最大值；维生素B的降解在中高水分活度条件下也表现出了最高的反应速1度。另外，水分活度对脂肪的非酶氧化反应也有较复杂的影响。这些例子都说明了水分活度值对食品品质有着重要的影响。 第二，水分活度影响着食品的保藏稳定性。微生物的生长繁殖是导致食品腐败变质的重要因素，而它们的生长繁殖与水分活度有密不可分的关系（表5-3）。在各类微生物中，细菌对水分活度的要求最高，A>时才能生长；其次是酵母菌，A的阈值是807.；再次是WW霉菌，大多数霉菌在A为时就开始繁殖。在食品中，微生物赖以生存的水分主要是自W由水，食品内自由水含量越高，水分活度越大，从而更容易受微生物的污染，保藏稳定性也就越差。 利用食品的水分活度原理，控制其中的水分活度，就可以提高产品质量、延长食品的保藏期。例如：为了保持饼干、爆米花和薯片的脆性，为了避免颗粒蔗糖、乳粉和速溶咖啡的结块，必须使这些产品的水分活度保持在适当低的条件下；水果软糖中的琼脂、主食面包中添加的乳化剂、糕点生产中添加的甘油等不仅调整了食品的水分活度，而且也改善了食品的质构、口感并延长了保质期。所以，在食品检验中水分活度的测定是一个重要的项目。 表5-3 水分活度与食品中微生物的生长 AW 范围 在Aw的低限下不能生长的微生物 ～ 假单胞菌、埃希氏菌、变形菌、贺氏菌、克雷伯氏菌、芽孢杆菌、魏氏杆菌、一部分酵母 ～ 沙门氏菌、副溶血性弧菌、沙雷氏菌、乳杆菌、球菌、赤酵母、红酵母、一些霉菌 ～ 很多酵母、微球菌 ～ 绝大部分霉菌、金黄色葡萄球菌、拜尔酵母、德巴利酵母 ～ 绝大部分嗜盐细菌 ～ 旱生霉菌 ～ 耐高渗酵母、少数霉菌 < 微生物不能生长 二、水分活度测定方法 在食品中工业中对于水分活度的测定方法很多，如蒸汽压力法、电湿度计法、溶剂萃取法、近似计算法和水分活度测定仪等，下面介绍几种常用的测定方法。 1．A测定仪法 w 食品水分活度测定仪分为两大类。一是冷却镜露点法，其特点是精确、快速而且便于操作，测量时间一般在in5m以内；另一类是采用传感器的电阻或电容的变化来测定相对湿度，其特点是便宜，但精确度比前者要低，而且测量时间相对更长。我们在这里介绍的水分活度测定仪的原理属于第二类。 （1）原理： 在一定的温度下，用标准饱和溶液校正A测定仪的A值，在同一条件下测定样品，ww利用测定仪上的传感器，根据食品中的蒸汽压力的变化，从仪器上的表头上读出指示的水分活度。 （2）仪器与试剂： A测定仪、20℃恒温箱、氯化钡饱和溶液等。 w（3）其操作方法如下：
①仪器校正：用小镊子将两张滤纸浸在lBaC饱和溶液中，待滤纸均匀地浸湿后，轻轻2地把它放在仪器的样品盒内，然后将具有传感器装置的表头放在样品盒上，小心拧紧，移至20℃恒温箱中，维持恒温h3后，再将表头上的校正螺丝拧动使A值为090.。重复上述过w程再校正一次。 ②样品测定：取经15～25℃恒温后的适量试样，置于仪器样品盒内，保持表面平整而不高于盒内垫圈底部。然后将具有传感器装置的表头置于样品盒上（切勿使表头沾上样品）轻轻地拧紧，移至20℃恒温箱中，保持恒温放置h2以后，不断从仪器表头上观察仪器指针的变化状况，待指针恒定不变时，所指示数值即为此温度下试样的A值。如果试验条件不w在20℃恒温测定时，可根据表5-4所列的A校正值即可将其校正为20℃时的数值。 w 表5-4 Aw值的温度校正表 温度（℃） 校正值 温度（℃） 校正值 15 － 21 ＋ 16 － 22 ＋ 17 － 23 ＋ 18 － 24 ＋ 19 － 25 ＋ （4）A测定法说明及注意事项： w①取样时，对于果蔬类样品应迅速捣碎或按比例取汤汁与固形物，肉和鱼等样品需适当切细。 ②所用的玻璃器皿应该清洁干燥，否则会影响测量结果。 ③仪器在常规测量时一般校准一次。当要求测量结果准确度较高时，则每次测量前必须进行校正。 ④测量头为贵重的精密器件，在测定时，必须轻拿轻放，切勿使表头直接接触样品和水；若不小心接触了液体，需蒸发干燥进行校准后才能使用。 ⑤温度的校正方法如下：如在15℃时测得某样品的A＝，查表15℃时校正值为w－，故样品在20℃时的A＝＋(－)＝；反之，在25℃某样品A＝，ww查表校正值为＋，故该样品在02℃时的A＝＋(＋)＝。 w 2． 扩散法 （1）扩散法原理： 样品在康威氏（Conawy）微量扩散皿的密封和恒温条件下，分别在A较高和较低的标准饱和溶液中扩散平衡后，根w据样品质量的增加（在A较高的标准溶液中平衡）和减少（在wA较低的标准溶液中平衡），以质量的增减为纵坐标，各个标w准试剂的水分活度为横坐标，计算样品的水分活度值。该法适用于中等及高水分活度（A>）的样品。 w（2）主要试验仪器和试剂： 主要仪器： ①康威氏微量扩散皿，构造如图5-2； 图2 -5 康威氏微量扩散皿 ②小铝皿或玻璃皿：盛放样品用，直径为25～8m2m、深度为m7m的圆形皿； ③分析天平：感量10g00.。
主要试剂：标准水分活度试剂，如表5-4所示。 表5-4 标准水分活度试剂及其在25℃时的AW值 试剂名称 Aw 试剂名称 Aw 重铬酸钾（K2Cr2O7·2H2O） 溴化钠（NaBr·2H2O） 硝酸钾（KNO3） 硝酸镁[Mg(NO3)2·6H2O] 氯化钡（BaCl2·2H2O） 硝酸锂（LiNO3·3H2O） 氯化钾（KCl） 碳酸钾（K2CO3·2H2O） 溴化钾（KBr） 氯化镁（MgCl2·6H2O） 氯化钠（NaCl） 醋酸钾（KAc·H2O） 硝酸钠（NaNO3） 氯化锂（LiCl·H2O） 氯化锶（SrCl2·6H2O） 氢氧化钠（NaOH·H2O） （3）操作方法： 在测定A之前，需要对样品进行预处理。固体、液体或流动的浓稠状样品，可直接取w样进行称量；如果是瓶装固体、液体混合样品可取液体部分；若为质量多样的混合样品，则应取有代表性的混合均匀的样品。 操作方法如下： ①在预先恒重且精确称重的铝皿或玻璃皿中，精确称取00g1.均匀样品，迅速放入康威氏皿内室中。在外室预先放入饱和标准试剂5Lm，或标准的上述各式盐，加入少许蒸馏水湿润。在操作时通常选择2～4种标准饱和试剂，每只皿装一种，其中1～2份的A值w大于或小于试样的A值。 w②接着在扩散皿磨口边缘均匀涂上一层凡士林，样品放入后，迅速加盖密封，并移至25±℃的恒温箱中放置2±（几乎绝大多数样品可在h2后测得A）。 w③然后取出铝皿或玻璃皿，用分析天平迅速称量，分别计算各样品的质量增减数。 ④以各种标准饱和溶液在25℃时的A值为横坐标，样品的质量增减数为纵坐标在坐标w纸上作图，将各点连结成一条直线，这条线与横坐标的交点即为所测样品的水分活度值。 水分活度的计算以下面这个实例来说明。 某食品样品在硝酸钾标准饱和溶液平衡下增重g7m，在氯化钡标准饱和溶液中增重g3m，在氯化钡中减重g9m，在溴化钾中减重g15m。如图5-3，可求得其A＝。 w（4）扩散法说明和注意事项： ①取样时应该迅速，各份样品称量应在同一 条件下进行； ②康威氏皿应该具有良好的密封性； ③试样的大小、形状对测定结果影响不大，取 试样的固体部分或液体部分都可以， 样品平衡后其测定结果没有差异。 ④前面已提到，绝大多数样品在2h后可测得A。但有的样品如米饭类、油脂类、油浸烟熏类w则需4d左右时间才能测定。为此，需加入样品量％的山梨酸作防腐剂，并以其水溶液作空白。 图3 -5 A值测定图解 W 3．溶剂萃取法 （1）原理：
食品中的水可用不混溶的溶剂苯来萃取。在一定的温度下，苯所萃取出的水量与样品中水相的水分活度成正比。用卡尔-费休法分别测定苯从食品和纯水中萃取出的水量并求出两者之比值，即为样品的水分活度值。 （2）主要仪器和试剂： 溶剂萃取法所用的主要仪器与卡尔-费休法相同。 所用试剂： ①卡尔-费休试剂。 甲液：在干燥的棕色玻璃瓶中加入L010m无水甲醇、无水乙酸钠（在102℃干燥4h8以上）、碘化钾，充分摇匀溶解后再通入～干燥的二氧化硫。 乙液： 称取g5763.碘、g287.碘化钾及.4g25无水乙酸钠移入干燥棕色瓶中，加入L500m无水甲醇，充分摇匀溶解后备用。 将上述甲、乙液混合，用聚乙烯膜薄套在瓶外，将瓶放在冰浴中静置一昼夜，取出后放在干燥器中，升至室温后备用。 试剂的标定：取干燥带塞的玻璃瓶称重，准确加入蒸馏水g30m左右，加入无水甲醇L2m，在不断振摇下，用卡尔-费休试剂滴定至呈黄棕色为终点。另取无水甲醇按同法进行空白试验，按下式计算滴定度（T）： W = T V−V0式中：T——卡尔-费休试剂的滴定度（每Lm相当于水的gm数）； W——重蒸馏水的质量，gm； V——滴定水时消耗的卡尔-费休试剂的体积，Lm； V——空白试验时消耗的卡尔费休试剂的体积，Lm。 0②苯：光谱纯，开瓶后可覆盖氢氧化钠保存。 ③无水甲醇；与卡尔-费休法中的相同。 （3）操作方法： 准确称取粉碎均匀的样品置于L205m干燥的磨口三角瓶中，加入苯L100m，盖上瓶塞，然后放在摇瓶机上振摇1h，再静置in1m0，吸取此溶液L50m于卡尔-费休水分测定仪中，并加入无水甲醇L70m（可事先滴定以除去可能残存的水分）。混合，用卡尔-费休试剂滴定至产生稳定的为橙红色不褪为止，或用1-FKZ型容量滴定卡尔-费休水分测定仪滴定至终点并保持in1m不变。整个测定操作需保持在25±1℃下进行。另取L10m重蒸水代替样品，加苯L100m，振摇in2m，静置in5m，然后按上述样品测定步骤进行滴定，至终点后，同样记录消耗卡尔-费休试剂的Lm数。 （4）水分活度的计算： [HO]2n A＝×10 w[HO]20式中：[H]O——从食品中萃取的水量（用卡尔-费休试剂滴定度乘以滴定样品所消耗2n该试剂的Lm数）； [H]O——从纯水中萃取的水量（卡尔-费休试剂滴定度乘以滴定L10m纯水萃20取液时所消耗该试剂的Lm数）。 （5）方法说明和注意事项： 在溶剂萃取法中，除苯（光谱纯）提取样品水分外，其他步骤同水分测定中的卡尔-费休法相同。溶剂萃取法使用的所有玻璃器皿必须干燥，这种方法与A测定仪法所得的结果w
相当。 无论是对于食品生产者还是食品消费者，食品中的水分含量都具有非常的意义，从而对水分的测定也就成了一项十分重要的分析工作。水分含量的分析看起来似乎很简单，但最不容易的是如何通过试验分析途径获得精确可靠的结果。从本章我们可以看出，分析水分含量的方法主要包括两大类：一是从样品中分离出水分，再以质量或体积来定量测定；另一类方法是不通过分离，而是利用水的某些物理或化学性质来测定。这些方法的目的都是要除去或测定样品中所有的水分，但在此过程中由于食品的分解或其他成分的干扰，往往不能获得最佳的结果。所以对于每一种分析方法来说，都必须采取一些有效的措施加以预防和控制，以保证结果的精确可靠。在测定时，样品的采集和处理显得极其重要。而对于分析方法的选择，常常取决于食品中预估计的水分含量的大小、其他组分的特性（如高挥发性、热敏感性）、仪器的性能、对检测速度、精确度和可靠程度的要求以及水分含量的用途（如是产品标准还是工厂的质量控制）等因素。 思考题： 1. 根据你学习本章所掌握的测定水分的知识，指出下列各类食品水分测定的操作方法及要点：乳粉、淀粉、香料、谷类、干酪、肉类、果酱、糖果、笋、南瓜、面包和油脂。 2. 在下列情况下，水分测定的结果是偏高还是偏低？为什么？ 烘箱干燥法：样品粉碎不充分；样品中含较多挥发性成分；脂肪的氧化；样品的吸湿性较强；美拉德反应；样品表面结了硬皮；装有样品的干燥器未密封好；干燥器中硅胶已受潮。 蒸馏法：样品中的水分和溶剂间形成的乳浊液没有分离；冷凝器中残留有水滴；馏出了水溶性成分。 卡尔费休法：玻璃器皿不够干燥；样品颗粒较大；样品中还有还原性物质如维生素C；样品中富含不饱和脂肪酸。 3. 在水分测定过程中，干燥器有什么作用？怎样正确地使用和维护干燥器？ 4. 请阐述水分活度值的概念以及它在食品工业生产中的重要意义。 （钱和）
第六章 灰分及几种重要矿物元素含量的测定 第一节 灰分的测定 一、概述 食品的组成十分复杂，除含有大量有机物质外，还含有丰富的无机成分，这些无机成分包括人体必须的无机盐（或称矿物质），其中含量较多的有Ca、Mg、K、aN、S、P、C1等元素。此外还含有少量的微量元素，如eF、Cu、Zn、nM、I、F、Ca、eS等。当这些组分经高温灼烧时，将发生一系列物理和化学变化，最后有机成分挥发逸散，而无机成分（主要是无机盐和氧化物）则残留下来，这些残留物称为灰分。灰分是标示食品中无机成分总量的一项指标。 食品组成不同，灼烧条件不同，残留物亦各不同。食品的灰分与食品中原来存在的无机成分在数量和组成上并不完全相同，因此严格说应该把灼烧后的残留物称为粗灰分。这是因为食品在灰化时，某些易挥发的元素，如氯、碘、铅等，会挥发散失，磷、硫等也能以含氧酸的形式挥发散失，这部分无机物减少了。另一方面，某些金属氧化物会吸收有机物分解产生的二氧化碳而形成碳酸盐，又使无机成分增多了。 食品的灰分常称为总灰分（粗灰分）。在总灰分中，按其溶解性还可分为水溶性灰分，水不溶性灰分和酸不溶性灰分。其中水溶性灰分反映的是可溶性的钾、钠、钙、镁等氧化物和盐类含量。水不溶性灰分反映的是污染的泥沙和铁铝等氧化物及碱土金属的碱式磷酸盐含量。酸不溶性灰分反映的是环境污染混入产品中的泥沙及样品组织中的 微量氧化硅含量。 测定灰分具有十分重要意义：1、不同食品，因所用原料，加工方法和测定条件不同，各种灰分的组成和含量也不相同。当这些条件确定后，某种食品的灰分常在一定范围内，如果灰分含量超过了正常范围，说明食品生产过程中，使用了不合乎卫生标准的原料，或食品添加剂，或食品在生产、加工、贮藏过程中受到了污染。因此测定灰分可以判断食品受污染的程度。2、灰分可以作为评价食品的质量指标。例如在面粉加工中，常以总灰分含量评定面粉等级，富强粉为%.~5；标准粉为%.~9；加工精度越细，总灰分含量越小，这是由于小麦麸皮中灰分的含量比胚乳的高20倍左右。生产果胶、明胶之类的的胶质品质时总灰分是这些胶的胶冻性能的标志。水溶性灰分可以反映果酱果冻等制品中的果汁含量。3、测定植物性原料的灰分可以反映植物生长的成熟度和自然条件对其的影响，测定动物性原料的灰分可以反映动物品种，饲料组分对其的影响。常见食品的灰分含量见表6-1。 表6-1食品的灰分含量 食品名称 含量 )%( 食品名称 含量 )%( 食品名称 含量 )%(牛乳 0 .76- 罐藏甜炼乳 . 鲜肉 2510-. 乳粉 75 -. 鲜果 0 .21- 鲜鱼(可食部分 )- 脱脂乳粉 7 .28- 蔬菜 0 .21- 鸡蛋白 60. 罐藏淡炼乳 1 .76- 小麦胚乳 50 . 鸡蛋黄 61. 精制糖、糖果 痕量1 糖浆、峰蜜 痕量 - 纯油脂 无 二、总灰分的测定 1、原理：将食品经炭化后置于605000-℃高温炉内灼烧，食品中的水分及挥发物质以气态放出，有机物质中的碳、氢、氮等元素与有机物质本身的氧及空气中的氧生成二氧化碳、氮的氧化物及水分而散失；无机物质以硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、氯化物等无机盐和金属氧化
物的形式残留下来，这些残留物即为灰分，称量残留物的质量即可计算出样品中总灰分的含量。 2、灰化条件的选择 ⑴灰化容器： 测定灰分通常以坩埚作为灰化容器。坩埚分素烧瓷坩埚、铂坩埚，石英坩埚等多种。其中最常用的是素烧瓷坩埚。它具有耐高温(1020℃,)内壁光滑，耐稀酸，价格低廉等优点，但耐碱性能较差，当灰化碱性食品时（如水果、蔬菜、豆类时），瓷坩埚内壁的釉层会部分溶解，反复多次使用后，往往难以保持恒重。另外当温度骤变时，易发生破裂，因此要注意使用。铂坩埚具有耐高温（1737℃），能抗碱金属碳酸盐及氟化氢的腐蚀，导热性能好，吸湿性小等优点，但价格昂贵，故使用时应特别注意其性能和使用规则。另外，使用不当时会腐蚀和发脆。 灰化容器的大小要根据试样性状来选 用，需前处理的液态样品，加热膨胀的样品及灰分含量低，取样量大的样品，需选用稍大些的坩埚。 ⑵取样量 测定灰分时，取样量的多少应根据试样种类和性状来决定，同时应考虑到称量误差。一般以灼烧后得到的灰分量为gm10100-来决定取样量。通常情况下，奶粉、麦乳精、大豆粉、调味料、鱼类及海产品等取g1-2；谷物及其制品，肉及其制品，糕点，牛乳等取3-5g；蔬菜及其制品，砂糖及其制品，蜂蜜，奶油等取5-g10；水果及其制品取2g0；油脂取50g。见表6-2。 ⑶灰化温度 灰化温度的高低对灰分测定结果影响很大，由于各种食品中的 无机成分组成性质及含量各不相同，灰化温度也应有所不同，一般为25℃-600℃。其中只有黄油规定在500℃以下，这是因为用溶剂除去脂类后，残渣加以干燥，由灰化减量算出酪蛋白，以残渣作为灰分，还 表6-2 CAOA公定法规定不同食品灰分测定温度与重量 食品名称 测定条件 试样量 谷物及其制品 50℃或070℃ g35 -通心粉、鸡蛋面条及制品 50℃ g35 -淀粉制品、淀粉、甜食粉 52℃ 051g- 大豆粉 60℃ 2g 肉及其制品 52℃ g35 -乳及制品 ≤505℃ g35 -鱼类及海产品 ≤25℃ g2 水果及制品 ≤52℃ 2g5 蔬菜及制品 52℃ 051g- 砂糖及制品 52℃ g35 -糖蜜 52℃ g5 醋 52℃ l 52m啤酒 52℃ l 05m蒸馏酒 52℃ l5 12-0m茶叶 52℃ 51g-0 注： CAOA公定法 （icl afO d sotMhe o f nAaisl y o f het oscAia tn o f ficialOf Anaallytic istsChem）
要在灰化后定量食盐，所以采用抑制氯的挥发温度，其它食品全是52、505、600及700℃。700℃仅适合于添加醋酸镁的快速法。 灰化温度选定在此范围，是因为灰化温度过高，将引起钾、钠、氯等元素的挥发损失，而且磷酸盐、硅酸盐类也会熔融，将碳粒包藏起来，使碳粒无法氧化，灰化温度过低，则灰化速度慢，时间长，不易灰化完全，也不利于除去过剩的碱（碱性食品）吸收的二氧化碳。此外，加热速度也不可太快，以防急剧干馏时灼热物的局部产生大量气体而使微粒飞失----爆燃。 ⑷灰化时间 一般以灼烧至灰分呈白色或浅灰色，无碳粒存在并达到恒重为止。灰化至达到恒重的时间因试样不同而异，一般需h2-5，通常根据经验灰化一定时间后，观察一次残灰的颜色，以确定第一次取出时间，取出后冷却，称重，然后再置入马福炉中灼烧，直至达恒重。应该指出，对有些样品，即使灰化完全，残灰也不一定呈白色或浅灰色。如铁含量高的食品，残灰呈褐色，锰，铜含量高的食品，残灰呈蓝绿色。有时即使 灰的表面呈白色，内部仍残留有碳块，所以应根据样品的组成，性状注意观察残灰的颜色，正确判断灰化程度。 3、加速灰化的方法 对于难以灰化的样品，可用下述方法来加速灰化。 改变操作方法： ⑴样品经初步灼烧后，取出冷却，从灰化容器边缘慢慢加入（不可直接洒在残灰上，以防残灰飞扬）少量无离子水，使水溶性盐类溶解，被包住 的碳粒暴露出来，在水浴上蒸发至干涸，置于1-31002℃烘箱中充分干燥，再灼烧到恒重。 ⑵添加硝酸、乙醇、碳酸铵、双氧水，这些物质经灼烧后完全消失不至于增加残灰的重量。样品经初步灼烧后，加入上述物质如硝酸（1：1）或双氧水，蒸干后再灼烧到恒重，利用他们的氧化作用来加速碳粒灰化，也可加入1%0碳酸铵等疏松剂，在灼烧时分解为气体逸出，使灰分呈现松散状态，促进未灰化的碳粒灰化。 ⑶硫酸灰化法：对于糖类制品如白糖、绵白糖、葡萄糖、饴糖等制品，以钾等为主的阳离子过剩，灰化后的残灰呈碳酸盐，通过添加硫酸使阳离子全部以硫酸盐形式成为一定组分的方法。采用硫酸的强氧化性加速灰化，结果用硫酸灰分来表示。在添加浓硫酸时应注意，如有一部分残灰溶液和二氧化碳气体呈雾状扬起，要边用表面玻璃将灰化容器盖住边加硫酸，不起泡后，用少量去离子水将表面玻璃上的附着物洗入灰化容器中。 ⑷加入醋酸镁，硝酸镁等助灰化剂 谷物及其制品中，磷酸一般过剩于阳离子，随着灰化进行，磷酸将以磷酸二氢钾的形式存在，容易形成在比较低的温度下熔融的无机物，因而包住未灰化的碳造成供氧不足，难以完全灰化。因此采用添加灰化辅助剂，如醋酸镁或硝酸镁等，使灰化容易进行。这些镁盐随着灰化进行而分解，与过剩的磷酸结合，残灰不熔融，成白色松散状态，避免碳粒被包裹，可大大缩短灰化时间。此法应做空白实验，以校正加入的镁盐灼烧后分解产生OMg的量。 4、测定方法 ⑴瓷坩埚的准备：将坩埚用盐酸（1：4）煮h2~1，洗净晾干后，用三氯化铁与蓝墨水的混合液在坩埚外壁及盖上写上编号，置于规定温度的高温炉中灼烧1h，移至炉口冷却到200℃左右后，再移入干燥皿中，冷却至室温后，准确称重，再放入高温炉内灼烧in3m0取出冷却称重，直至恒重(两次称量之差不超过g)。 ⑵样品预处理 a.果汁、牛乳等液体试样:准确称取适量试样于已知重量的瓷坩埚中，置于水溶上蒸发至近干，再进行炭化。这类样品若直接炭化，液体沸腾，易造成溅失。 b.果蔬、动物组织等含水分较多的试样：先制备成均匀的试样，再准确称取适量试样与已知
重量坩埚中，置烘箱中干燥，再进行炭化。也可取测定水分后的干燥试样直接进行炭化。 c.谷物、豆类等水分含量较少的固体试样，先粉碎成均匀的试样，取适量试样于已知重量的坩埚中再进行炭化。 d.富含脂肪的样品：把试样制备均匀，准确称取一定量试样，先提取脂肪，再将残留物移入已知重量的坩埚中，进行炭化。 ⑶炭化 试样经上述预处理后，在放入高温炉灼烧前要先进行炭化处理，防止在灼烧时，因温度高试样中的水分急剧蒸发使试样飞扬，防止糖、蛋白质、淀粉等易发泡膨胀的物质在高温下发泡膨胀而溢出坩埚，不经炭化而直接灰化，碳粒易被包住，灰化不完全。 炭化操作一般在电炉或煤气灯上进行，把坩埚置于电炉和煤气灯上，半盖坩埚盖，小心加热使试样在通气情况下逐渐炭化，直到无黑烟产生。对特别容易膨胀的试样（如含糖多的食品），可先于试样中加数滴辛醇或纯植物油，再进行炭化。 ⑷灰化： 炭化后，把坩埚移入已达规定温度 高温炉炉口处稍停留片刻，再慢慢移入炉膛内，坩埚盖斜倚在坩埚口，关闭炉门，灼烧一定时间（视样品种类、性状而异）至灰中无碳粒存在。打开炉门，将坩埚移至炉口处冷却至200℃左右，移入干燥器中冷却至室温，准确称重，再灼烧，冷却，称重，直至达到恒重。 5、计算结果： m−m31灰分%= ×100 m−m21式中：m－空坩埚质量 ，g； 1 m－样品加空坩埚质量，g； 2m－残灰加空坩埚质量，g。 36、说明 ⑴样品炭化时要注意热源强度，防止产生大量泡沫溢出坩埚。 ⑵把坩锅放入高温炉或从炉中取出时，要在炉口停留片刻，使坩埚预热或冷却，防止因温度剧变而使坩埚破裂。 ⑶灼烧后的坩埚应冷却到200℃以下再移入干燥器中，否则因热的对流作用，易造成残灰飞散，且冷却速度慢，冷却后干燥器内形成较大真空，盖子不易打开。 ⑷从干燥器内取出坩埚时，因内部形成真空，开盖恢复常压时，应注意使空气缓缓流入，以防残灰飞散。 ⑸灰化后得到的残渣，可留作Ca、P、eF等成分的分析。 ⑹用过的坩埚经初步洗刷后，可用粗盐酸或废盐酸浸泡2100-分钟，再用水冲刷洗净。 ⑺粮食、油料；淀粉及微生物，食用菌，茶叶，香辛料和调味品等国家标准中总灰分测定方法都采用此法，国标代号分别是B85055-G，B6019-828G，B1G0320-259，7B880G36-，9B-/、05B4/90GT.。 三、水溶性灰分和水不溶性灰分的测定 向测定总灰分所得残留物中加入L2m5无离子水，加热至沸，用无灰滤纸过滤，用L25m热的无离子水分多次洗涤坩埚，滤纸及残渣，将残渣连同滤纸移回原坩埚中，在水浴上蒸发至干涸，放入干燥箱中干燥，再进行灼烧，冷却，称重，直至恒重。按下式计算水溶性灰分和水不溶性灰分的含量。 m−m41水不溶性灰分（%）= ×100 m−m21
式中：m－不溶性灰分和坩埚的质量，g； 4其他符号同总灰分的计算。 水溶性灰分（%）=总灰分（%）－水不溶性灰分（%） 四、酸不溶性灰分的测定 向总灰分或水不溶性灰分中加入l m25ol/0l. 1m盐酸，以下操作同水不溶性灰分的测定，按下式计算酸不溶性灰分含量。 m−m51酸不溶性灰分（%）= ×010 m−m21式中：m－酸不溶性灰分和坩埚质量，g 5其他符号意义同总灰分计算。 说明：茶叶，香辛料和调味品等产品的水不溶性灰分和酸不溶性灰分的国家标准测定方法如上所述，代号分别是B08G737-8，08837-B8G，/，B./G9T9-719221。 第二节 几种重要矿物元素的测定 一、概述 食品中所含的元素已知有05多种，除去C、H、O、N四种构成水分和有机物质元素以外，其它元素统称为矿物元素。其中含量较多的矿物元素有Ca、gM、K、aN、P、S、Ci等7种，含量都在 0%01.以上，称为常量元素，约占矿物质总量的8%0。此外还含有eF、Co、iN、Zn、Cr、oM、lA、iS、eS、nS、I、F等元素，含量都在 0%01.以下，称为微量元素或痕量元素。其中一些元素是人体所必需的，在维持体液的渗透压，维持机体的酸碱平衡，酶的活化剂，构成人体组织等方面，起着十分重要的作用。由于食物中矿物质含量较丰富，分布也较广泛，一般情况下都能满足人体需要，不易引起缺乏，但对于一些特殊人群或处于特殊生理状况时，如婴幼儿、孕妇、青春期、哺乳期等常易引起缺乏症。测定食品中某些矿物元素含量，对于评价食品的营养价值，开发和生产强化食品，具有十分重要意义。 考察一种食品的营养质量时，不仅要考虑其中营养素的含量，而且还要考虑这些成分被生物机体利用的实际可能性，即生物有效性尤为重要。前者主要用测定含量多少来表示。后者则要考虑矿物元素的存在形式，与其它营养成分的相互作用等等。一般来说，动物性食品中矿物元素的生物有效性高于植物性食品。 本节只介绍其中Ca、eF、I、P等元素的测定方法。食品中有些矿物元素是非人体必需的有毒元素，还有些虽是人体必需元素，但需要量很小，摄入过量将对人体产生危害，因此必须严格限制这类元素在食品中的含量，有关这些元素的测定在第十三章中作介绍。 矿物元素的测定方法很多，常用的有化学分析法，比色法，原子吸收分光光度法。此外极谱法，离子选择性电极法，荧光法等也有一定应用。 二、钙的测定 钙（Calucni）是构成机体骨骼、牙齿的主要成分，长期缺钙会影响骨骼和牙齿的生长发育，严重时产生骨质疏松，发生软骨病，钙还参与凝血过程和维持毛细血管的正常渗透压，并影响神经肌肉的兴奋性，缺钙时可引起手足搐搦。 食品中含钙较多的是豆、豆制品、蛋、酥鱼、排骨、虾皮等。机体对食品中钙的吸收受多种因素的影响，蛋白质、氨基酸、乳糖，维生素有利于钙的吸收，脂肪太多或含镁量过多不利于钙的吸收，草酸、植酸或脂肪酸的阴离子能与钙生成不溶性沉淀，也会影响钙的吸收。菠菜、韭菜、苋菜等蔬菜中含草酸量较高，不但其本身所含钙不能被吸收，而且还影响其他食物中钙的吸收，使有效钙量为负值。
表6-3 部分食品中钙的含量（01gg0/m） 食品名称 钙含量 食品名称 钙含量 食品名称 钙含量 食品名称 钙含量 牛肉 2 1 猪肉 1 羊肉 1 5 鸭蛋 7 1鸡肉 1 鸭肉 1 牛乳 102 鲤鱼 2 5全脂乳粉 310 脱脂乳粉 310 鸡蛋 5 8 对虾 3 5鸡蛋白 9 1 鸡蛋黄 143 全蛋粉 8 16 干虾皮 016 7 有效钙量=（ 钙重/钙分子量— 草酸重/草酸分子量 ）×钙原子量 为此，对含草酸多的蔬菜，有时不仅要测定钙的量，还要同时测定草酸的量， 食品中钙的来源以乳及乳制品为最好，不但含量丰富，而且吸收率高。中国营养学会制定钙每月摄入量为8g00m为标准，但现全国人均不足g500m，所以钙强化制剂具有重要意义。目前钙制剂大约有如下三代产品：第一代，主要以无机盐为主。其来源为A、B两类，前者主要是动物鲜骨 ，珍珠粉，贝壳，主要形式是多羟基磷酸钙和碳酸钙。后者是碳酸钙矿石，化学合成碳酸钙，磷酸氢钙，氯化钙等；第二代，主要以有机盐为主，如乳酸钙，醋酸钙，葡萄糖酸钙，柠檬酸钙等有机钙盐；第三代是具有生物活性结构的有机酸钙如L-苏糖酸钙，L-天门冬氨酸钙及甘氨酸钙。这三代钙营养强化剂各有利弊。 钙测定方法经典的是用草酸铵使钙生成草酸钙沉淀，然后用重量法或容量法测定，例如高锰酸钾滴定法，此法虽有较高的精确度，但需经沉淀，过滤，洗涤等步骤，费时费力，现在较为少用，目前广泛应用的是ATDE络合滴定法和原子吸收分光光度法。 （一）高锰酸钾滴定法 样品经灰化后，用盐酸溶解，在酸性溶液中，钙与草酸生成草酸钙沉淀，沉淀经洗涤后，加入硫酸溶解，把草酸游离出来，用高锰酸钾标准溶液滴定与Ca等量结合的草酸，稍过量一点的高锰酸钾使溶液呈现微红色，即为滴定终点。根据高锰酸钾标准溶液消耗量，可计算出食品中Ca的含量。反应式如下： CaCl＋HN()CO＝aCCO＋2HN Cl24224244CaCO＋HOS＝OSaC＋HCO 242442245HCO＋2MKnO＋3HOS＝KOS＋2MnSO＋C1O0＋8H O22442424422＋2MKnO相当于5HCO相当于5 aCCO相当于aC5 422424钙的摩尔数=25/高锰酸钾的摩尔数 食品中钙的含量（g/10gm） 式中：M－KMnO标准溶液浓度，ol/Lm； 4V－滴定时消耗KMnO的体积，L； 48400.为钙的摩尔质量； S－样品的质量，g。 同时测定蔬菜中钙和草酸的含量时，可采用硝酸浸取法，将蔬菜中的钙和草酸同时浸溶出来，并分别测定其含量。测定草酸以氯化钙作沉淀剂；测定钙用草酸铵为沉淀剂，其余操作原理相同。 （二）ATDE络合滴定法 ATDE（乙二胺四乙酸二钠盐）滴定法测定钙含量，基于ATDE与样品消化液中的钙能形成比钙红指示剂与钙所形成的络合物更加稳定的aC-ATDE络合物。在1p14H3-的含钙溶液中，同时有氰化钾和柠檬酸等掩蔽剂消除干扰离子（铜、铝、铁）影响的情况下，首先是
钙红指示剂与溶液中钙络合成酒红色，随着滴入ATDE，由于形成更稳定的aC-ATDE络合物，钙红指示剂变成蓝色的游离状态，终点时溶液呈纯蓝色，根据滴入的ATDE量和它的滴定度即可算出消化液中钙的含量。 注意事项： ⑴滴定用的样品量随钙含量而定，最适合的范围是05-5 µg。 ⑵加钙红指示剂后，不能放置过久，否则终点发灰，不明显。 ⑶氰化钾是消除锌、铜、铁、铝、镍、铅等金属离子的干扰，而柠檬酸钠是防止钙和磷结合形成磷酸钙沉淀。 ⑷滴定时pH应为1142-，过高过低指示剂变红，滴不出终点。 （三）原子吸收分光光度法 样品经干法灰化，将有机物彻底分解后，加酸使无机元素全部溶解，直接吸入空气和乙炔中原子化。并在光路中直接测定钙原子对其空心阴极灯发射谱线（钙为）的吸收。测定钙时，需加镧作为稀释剂，以消除磷酸等物质的干扰。 三、铁的测定 铁（iron）是人体必需的微量元素，它是人体内血红蛋白和肌红蛋白的组成成分，参与了血液中氧的运输作用，又能促进脂肪氧化，所以人体每日都必须摄入一定量的铁。9818年中国营养学会推荐的eF的供应量:成年男子g m12/天,女子g/81m天，缺乏铁会引起低色素性贫血和血浆水平低下等病症，人体内含铁过量时也会引起血红症等疾病。在肉、蛋、肝脏和果蔬中均含有丰富的铁质（表6-4食品中eF的含量）食品在贮存过程中会常常由于污染了大量铁而使之产生金属味，色泽加深并导致食品中脂肪氧化和维生素D分解，造成食品品质降低，影响食品风味，所以食品铁的测定不但具有卫生意义而且具有营养学意义。 表6-4食品中铁的含量（mg/100g） 品名 含铁量 品名 含铁量 品名 含铁量 品名 含铁量 牛肉 23 . 羊肉 03. 猪肉 2 .4 草鱼 70 .鸡肉 82 . 鸭肉 13. 鸡蛋 4 .3 胡萝卜 5 06.蛋黄粉 4 鸭蛋 23. 牛乳 0 .1 生白菜 9 08.牛肝 猪肝 2 全脂乳粉 1 .9 花生 19.脱脂乳粉 60 . 带鱼 81. 鲤鱼 1 .6 青鱼 90 . 食品中铁含量测定方法有邻菲罗啉比色法（邻二氮菲比色法），硫氰酸盐比色法，磺基水杨酸比色法和原子吸收分光光度法等。 （一）硫氰酸盐比色法 食品样品经消化后，各种铁均以三价eF盐形成存在，在酸性溶液中，三价eF与硫氰酸钾溶液作用，生成红色的硫氰酸铁配合物，在458nm下有最大吸收，其吸光度与铁含量成正比。反应式如下： 为了防止三价eF转变成二价Fe ，应加入少量过硫酸钾（KSO）作氧化剂。 228应注意： ⑴硫氰酸铁的稳定性差，时间稍长，红色会逐渐消退，故应在规定时间内比色。 ⑵当三价eF浓度较低时，可用戊醇萃取富集，以提高吸光度值 （二）磺基水杨酸法
磺基水杨酸在碱性条件下与三价铁离子生成黄色络合物，在456nm下有最大吸收，其吸光度与铁含量成正比，反应式如下：用 代表磺基水杨酸的阴离子 OHSOH3+32-3-2- eF+Sla(eF[)]3Sla=3 COOH 在碱性溶液中二价eF能迅速被空气氧化，故不需另加氧化剂。 注意⑴本法与硫氰酸盐法比较，其稳定性远远大于上法，磺基水杨酸与三价eF离子络合反应完全，方法准确度高，并且干扰离子的影响大大减少，可在F离子和磷酸根离子存在下测定铁。 ⑵ 铝离子与铜离子也能与磺基水杨酸络合而干扰测定，前者生成无色络合物，但要消耗一定量磺基水杨酸，故加入过量的磺基水杨酸溶液可消除其干扰。 （三）邻菲罗啉法（邻二氮菲法） 邻菲罗啉（邻二氮菲，1，10一 二氮杂菲，邻菲绕啉ontrhaonhtenlprheio）在微酸性条件下二价铁离子能与邻菲罗啉生成橙红色的络合物，在501nm波长下有最大吸收，其吸光度与铁的含量成正比，反应式如下： 2+NNFe2+ 3Fe++NN3 食品样品经消化后，铁以三价形式存在，故显色以前应先加盐酸羟胺，将三价eF还原成二价铁，反应式如下： ＋＋－3+24Fe＋2HNHO·ClH 4eF＋NO＋HO＋6H＋l2C 222如果有其他金属离子干扰，可加柠檬酸盐或ATDE作掩蔽剂。 注意： ⑴配制试剂及测定中用水均系以玻璃仪器重蒸的蒸馏水。 ⑵邻菲罗啉比色法测定铁，灵敏度较高，溶液中含铁g/时其颜色也很明显，易于比色。 ⑶邻菲罗啉与二价铁在微酸性条件下形成的红色络合物颜色相当稳定，比硫氰酸盐比色法稳定得多。 ⑷本法选择性高，干扰少，显色稳定，灵敏度和精密度都较高。 （四）原子吸收分光光度法 在原子吸收分光光度汁上点燃铁空心阴极灯（波长为)2m438.，将试样消化液在空气一乙炔火焰中喷雾，使Fe原子化，由于原子化浓度与吸光度成正比，故测其吸光度，用标准工作曲线法即可算出样品中铁的含量。 此法灵敏，快速，但是仪器设备昂贵。 四、碘的测定 碘是人体必需的微量元素之一，是人体内甲状腺球蛋白，甲状腺素的重要组成成分。甲状腺素能够调节体内新陈代谢，促进身体的生长发育，是人体正常健康生长必不可少的激素之一。人体对碘的日需要量约为1-5g1000µ。身体缺碘时，会发生甲状腺肿大，甲状腺素的合成减少甚至缺乏，可使人产生呆小症，人体需要的碘主要来源于饮水和食品，进入人体内的碘主要（8%9左右）到达甲状腺，用来合成甲状腺球蛋白和甲状腺素（T和T）。食品中34
碘含量最丰富的是海产品，部分食品中碘含量见表6-5。 表6-5 部分食品中的碘含量g) (µg/k 品名 碘含量 品名 碘含量 品名 碘含量 海带（干） 024 紫菜(干 ) 80 10 发菜(干) 0 8011黄花鱼(鲜 ) 102 带鱼(鲜 ) 08 鱼肚(干 ) 840 蚶（干） 024 蛤（干） 420 蛏干 109 干贝 012 海参(干 ) 06 海蜇(干 ) 3012 食品中碘的测定方法有氯仿萃取比色法，硫酸铈接触法， 溴氧化碘滴定法，仪器分析法（CLPH法，极谱仪测定法，分光光度法）等，其中最常用的是氯仿萃取比色法。 （一）氯仿萃取比色法 样品在碱性条件下灰化，碘被有机物还原成碘离子，碘离子与碱金属离子结合成碘化物，碘化物在酸性条件下与重铬酸钾作用，定量析出碘。当用氯仿萃取时，碘溶于氯仿中呈现粉红色，当碘含量低时，颜色深浅与碘含量成正比，故可以比色测定，反应式如下： 注意： ⑴灰化样品时，加入氢氧化钾的作用是使碘形成难挥发的碘化钾，防止碘在高温灰化时挥发损失。 ⑵本法操作简便，颜色稳定，重现性好。 （二）硫酸铈接触法 本法是测定微量碘的方法。可测至 当有碘离子存在时，碘首先与铈离子起反应被氧化，接着又重新被三价砷离子还原 碘离子作为反应的媒价起促进作用，同时碘的催化作用与样液中碘离子的浓度成比例，但不呈线性关系，并且此反应受温度与时间的影响很大，故反应要在恒温下进行，且在反应进行至一定时间后，加入亚铁盐以终止砷，铈离子氧化还原反应的进行，使余下的高铈离子与亚铁离子作用，把亚铁离子氧化成铁离子，这个反应是与高铈离子浓度成正比的。生成的铁离子再与加入的硫氰酸钾溶液起络合反应，生成红色的硫氰酸铁，此生成物颜色稳定可进行颜色测定： 同时上述生成物的浓度与溶液中碘离子的浓度成反比，生成红色的硫氰酸铁愈多，则碘离子愈少，与标准曲线比较，求出样品中碘离子的含量。 注意：温度与时间控制要十分严格。
（三）溴水氧化法 样品在碱性条件下灰化，碘被还原，与碱金属结合成碘化物，碘化物在酸性条件下加入过量溴水氧化成碘酸，加入甲酸钠除去过量溴，溶液加热至100℃时除去甲酸，最后加入碘化钾，释放出样品溶液中碘，与标准曲线比较，在507nm下测定碘与淀粉呈兰色的吸光度，其吸光度大小与碘成正比。 （四）催化分光光度法 痕量碘对高碘酸钾氧化孔雀绿退色反应（OIK-孔雀绿反应）有极佳的催化效应，碘在3l10n/0m20g-范围内，孔雀绿吸光度在651nm下的减少符合朗伯一比耳定律。 五、磷的测定 磷（oupshoprh）广泛存在于动植物组织中，与蛋白质或脂肪结合成核蛋白，磷蛋白，磷脂等，还有少量以无机磷化合物的形式存在。除植酸形式的磷不能被机体充分吸收利用外，其他大部分磷的化合物都能被消化吸收。人体内的磷参与各种生理活力和新陈代谢，同时磷是骨骼的重要成分，含磷的食品能补充脑磷脂，特别是对幼儿时期补磷显得尤为重要。因此测定食品中的磷具有重要意义。如果测定食品中总磷后，再减去植酸磷，则可算出可利用磷的量。各种食品中磷的含量见表6-6。 表6-6 食品中磷的含量（mg/100g） 品名 磷含量 品名 磷含量 品名 磷含量 品名 磷含量 牛肉 32 羊肉 86 1 猪肉 17 鸡蛋 84 2鸡肉 891 鸭肉 54 1 鹅肉 2 3 鹌鹑蛋 83 2兔肉 751 猪肝 07 2 牛肝 40 鲤鱼 57 1牛心 851 牛乳 39 炼乳 28 芥鱼 06 1全脂奶粉 838 脱脂奶粉 0 31 鸭蛋 1 20 对虾 105 磷的测定方法很多（B/GT4998-5618.），如果食品中磷的含量较高，可采用喹钼柠酮重量法测定；如果磷含量很低，则采用钼蓝比色法。其它如植酸中磷的测定及血清中无机磷的测定等。 （一）喹钼柠酮重量法（磷钼酸喹啉重量法） 样品经消化或灰化后，在酸性条件下，磷与喹钼柠酮作用生成磷钼酸喹啉沉淀，沉定物经过滤，洗涤，在206±02℃下烘干，称重可计算出磷的含量。反应式 如下： HOP＋a12NoOM＋ONH24＋3CH N （CHN）HOP·1o2OM·HO＋O24aN342439797334323＋1H1 O2 1G：沉淀物与砂芯坩埚的重量（g） G：砂芯坩埚的质量，g； 2V：吸取样品溶液的量，Lm； M：样品的质量，g； 500—样液的总体积，Lm； —磷钼酸喹啉对PO的换算因子。 25注意：⑴洗涤坩埚中的沉淀可先用自来水冲洗剩余部分，用1：1氨水浸泡至黄色消失，再用自来水冲洗，最后用热蒸馏水洗涤数次，烘干备用。 ⑵此法也可改用容量法进行：试样经灰化后制成稀盐酸的溶液，在酸性溶液中，磷酸根离子
与钼酸钠和喹啉反应生成磷钼酸喹啉沉淀，过滤 洗涤后，用过量标准碱溶液溶解沉淀，然后用标准酸溶液回滴，根据标准溶液的用量求得 C(H)NHOP·M1o2O·HO＋ aH2O6N 3CHN＋aNOPH＋12aNMoO＋15H O97334329724242 计算 式中 N－HOaN标准溶液的浓度，ol/Lm； 1 N－lCH标准溶液的浓度，ol/Lm； 2 V－滴定时HOaN标准溶液的用量，Lm； 1 V－滴定时lCH标准溶液的用量，Lm； 2 V－空白试验时HOaN标准溶液的用量，Lm； 3 V－空白试验时lCH-标准溶液的用量，Lm； 4 m－样品的质量，g； 023007.－PO的毫克摩尔质量。 25 （二）钼蓝比色法 食品样品中的磷经灰化或消化后以 磷酸根形式进入样品溶液，在酸性条件下与钼酸铵作用生成淡黄色的磷钼酸铵，其中高价的钼具有氧化性，可被抗坏血酸，氯化亚锡（或者对苯二酚与亚硫酸钠）还原成蓝色化合物---钼蓝在65n0m（或66n0m）下有最大吸收，其吸光度与磷浓度成正比，即可定量分析磷含量，本法最低检出限为2µg，反应式如下： 钼蓝 （三）植酸中磷的测定法 植酸为六磷酸环已酯，分子式为 ，其中含 有丰富的磷，但不易被机体消化吸收，稻谷中的磷主要以植酸的形式存在。故应分别测定并从总磷中减去。 食品样品先用盐酸进行浸取，浸取液加三氯化铁，使植酸生成植酸铁沉淀收集洗涤沉淀，于沉淀中加入氢氧化钠溶液，便生成可溶性植酸钠，加浓酸消化后，按测定总磷方法（钼蓝比色法、喹钼柠酮重量法）测得植酸中磷的含量。 总磷减去植酸中磷的量，便可求得可利用磷的量。 （四）血清中无机磷的测定 用三氯乙酸沉淀血清中蛋白质，溶液中无机磷盐与钼酸铵试剂作用，生成磷钼酸。磷钼酸与氨基萘酚碘酸作用还原成钼蓝，与同样处理的磷标准液比色，求出血清中无机磷的含量。 钼蓝
注意测定的血样应不溶血。 思考题： 1.食品的灰分与食品中原有的无机成分在数量与组成上是否完全相同？ 2.测定食品灰分的意义何在？ 3.加速食品灰化的方法有哪些？ 4.为什么说添加醋酸镁或硝酸镁的醇溶液可以加速灰化？ 5.为什么食品样品在高温灼烧前要进行炭化处理？ 6. 比较一下铁的几种测定方法的特点。 （章银良）
第七章 酸度的测定 第一节 概述 一、酸度的概念 分析和研究食品的酸度，首先应区分如下几种不同概念的酸度。 1、总酸度 总酸度是指食品中所有酸性成分的总量。它包括未离解的酸的浓度和已离解的酸的浓度，其大小可借滴定法来确定，故总酸度又称为“可滴定酸度”。 2、有效酸度 ++ 有效酸度是指被测溶液中H的浓度，准确地说应是溶液中H的活度，所反映的是已离解的那部分酸的浓度，常用Hp值来表示，其大小可借酸度汁（即pH汁）来测定。 3、挥发酸 挥发酸是指食品中易挥发的有机酸，如甲酸，醋酸及丁酸等低碳链的直链脂肪酸，其大小可通过蒸馏法分离，再借标准碱滴定来测定。 4、牛乳酸度 牛乳有如下两种酸度： 外表酸度：又叫固有酸度（潜在酸度），是指刚挤出来的新鲜牛乳本身所具有的酸度，是由磷酸，酪蛋白，白蛋白，柠檬酸和OC等所引起的。外表酸度在新鲜牛乳中约2占1508%.%-10（以乳酸汁）。 真实酸度：（也叫发酵酸度）是指牛乳放置过程中，在乳酸菌作用下乳糖发酵产生了乳酸而升高的那部分酸度。若牛乳中含酸量超过0.%1-500.%2，即表明有乳酸存在，因此习惯上将20%.以下含酸量的牛乳称为新鲜牛乳，若达30%.就有酸味，%就能凝固。 具体表示牛乳酸度的有两种方法： ⑴用Tº表示牛乳的酸度，Tº指滴定L100m牛乳样品消耗o0l0./10Lm氢氧化钠溶液的Lm数。或滴定L01m牛乳所用去的ol0/氢氧化钠的Lm数乘以10，即为牛乳的酸度。 新鲜牛乳的酸度为1186 -Tº。 ⑵以乳酸的百分数来表示，与总酸度计算方法同样，用乳酸表示牛乳酸度。 二、酸度测定的意义 食品中的酸不仅作为酸味成分，而且在食品的加工，贮藏及品质管理等方面被认为是重要的成分，测定食品中的酸度具有十分重要意义： 1、有机酸影响食品的色、香、味及稳定性 果蔬中所含色素的色调，与其酸度密切相关，在一些变色反应中，酸是起很重要作用的成份。如叶绿素在酸性条件下变成黄褐色的脱镁叶绿素，花青素于不同酸度下，颜色亦不相同。果实及其制品的口感取决于糖、酸的种类，含量及比例，酸度降低则甜味增加，同时水果中适量的挥发酸含量也会带给其特定的香气。另外，食品中有机酸含量高，则其pH值低，而pH值的高低，对食品稳定性有一定影响，降低pH值，能减弱微生物的抗热性和抑制其生长，所以pH值是果蔬罐头杀菌条件的主要依据，在水果加工中，控制介质pH值可以抑制水果褐变，有机酸能与eF、nS等金属反应，加快设备和容器的腐蚀作用，影响制品的风味与色泽，有机酸可以提高维生素C的稳定性，防止其氧化。 2、食品中有机酸的种类和含量是判别其质量好坏的一个重要指标。 挥发酸的种类是判别某些制品腐败的标准，如某些发酵制品中有甲酸积累，则说明已发生细菌性腐败，挥发酸的含量也是某些制品质量好坏的指标，如水果发酵制品中含有10%.
以上的醋酸，则说明制品腐败，牛乳及乳制品中乳酸过高时，亦说明已由乳酸菌发酵而产生腐败。新鲜的油脂常常是中性的，不含游离脂肪酸。但油脂在存放过程中，本身含的解脂酶会分解油脂而产生游离脂肪酸，使油脂酸败，故测定油脂酸度（以酸价表示）可判别其新鲜程度。有效酸度也是判别食品质量的指标，如新鲜肉的Hp值为25..7-6，如>H，说明肉已变质。 3、利用有机酸的含量与糖含量之比，可判断某些果蔬的成熟度 有机酸在果蔬中的含量，因其成熟度及生长条件不同而异，一般随着成熟度提高，有机酸含量下降，而糖含量增加，糖酸比增大。故测定酸度可判断某些果蔬的成熟度，对于确定果蔬收获及加工工艺条件很有意义。 三、食品中有机酸种类与分布 1、食品中常见的有机酸 食品中酸的种类很多，可分为有机酸和无机酸两类，但主要是有机酸，而无机酸含量很少。通常有机酸部分呈游离状态，部分呈酸式盐状态存在于食品中，而无机酸呈中性盐化合物存在于食品中。 食品中常见的有机酸有苹果酸，柠檬酸，酒石酸，草酸，琥珀酸，乳酸及醋酸等，这些有机酸有的是食品所固有的，如果蔬及制品中的有机酸，有的是在食品加工中人为加入的，如汽水中的有机酸，有的是在生产，加工，贮藏过程中产生的，如酸奶，食醋中的有机酸。果蔬中所含有酸种类较多，但不同果蔬中所含有机酸种类亦不同，见表7-1、27-，酿造食品（如酱油，果酒，食醋）中也含有多种有机酸。 表7-1 果实中主要有机酸种类 果实 有机酸种类 果实 有机酸种类 苹果 苹果酸，少量柠檬酸 梅 柠檬酸、苹果酸、草酸 桃 苹果酸、柠檬酸、奎宁酸 温州蜜橘 柠檬酸、苹果酸 洋梨 柠檬酸、苹果酸 夏橙 柠檬酸、苹果酸、琥珀酸 梨 苹果酸、果心部分有柠檬酸 柠檬 柠檬酸、苹果酸 葡萄 酒石酸、苹果酸 菠萝 柠檬酸、苹果酸、酒石酸 樱桃 苹果酸 甜瓜 柠檬酸 杏 苹果酸、柠檬酸 番茄 柠檬酸、苹果酸 表7-2 蔬菜中的主要有机酸种类 蔬菜 主要有机酸种类 蔬菜 主要有机酸种类 菠菜 草酸、苹果酸、柠檬酸 甜菜叶 草酸、柠檬酸、苹果酸 甘蓝 柠檬酸、苹果酸、琥珀酸、草酸 莴苣 苹果酸、柠檬酸、草酸 笋 草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸 甘薯 草酸 芦笋 柠檬酸、苹果酸、酒石酸 蓼 甲酸、醋酸、戊酸 2、食品中常见有机酸含量 果蔬中有机酸的含量取决于其品种、成熟度以及产地气候条件等因素，其它食品中有机酸的含量取决于其原料种类，产品配方以及工艺过程等。 一些果蔬中的苹果酸及柠檬酸含量见表7-3，一些果蔬及某些食品中pH值见表7-4、7-5。
表7-3 果蔬中柠檬酸和苹果酸的含量 种类 柠檬酸% 苹果酸% 种类 柠檬酸% 苹果酸% 草莓 荚豌豆 苹果 甘蓝 葡萄5 ※ 胡萝卜 橙08. 9+ 2 洋葱 柠檬34. 8+ 马铃薯 - 香蕉 - 甘薯 菠萝 南瓜 桃 菠菜 梨 花椰菜 杏（干） 番茄 洋梨 黄瓜 甜樱桃 芦笋1 注：*——340.为酒石酸的含量 +——痕量 -——缺乏 表7-4 一些果蔬的Hp值 名称p H 名称p H 名称p H苹果～05 .甜樱桃 ～935. 葡萄～ 梨 ～935. 草莓 ～44 .西瓜～46 .杏～04 .酸樱桃 ～73 .甘蓝 桃 ～93 .柠檬 ～53 .番茄～84 .辣椒（青） 菠菜 橙 ～ 南瓜 胡萝卜 豌豆 表7-5 一些食品的Hp值 名称p H名称p H 名称p H 牛肉～26 .哈肉 鲜蛋 ～48 .羊肉0 ～76 .蟹肉7. 鲜蛋白 ～88 .猪肉～96 .牡蛎肉 ～36 .鲜蛋黄 ～36 .鸡肉～46 .小虾肉 ～07 .面粉 ～56 .鱼肉～86 .牛乳 ～07 .米饭 第二节 酸度的测定 一、总酸度的测定 1、原理：食品中的有机弱酸，酒石酸、苹果酸、柠檬酸、草酸、乙酸等其电离常数均大于8-10，可以用强碱标准溶液直接滴定。用酚酞作指示剂，当滴定至终点（溶液呈浅红色，30s不褪色）时，根据所消耗的标准碱溶液的浓度和体积，可计算出样品中总酸含量。 2、操作方法 ⑴样品制备 ①固体样品，干鲜果蔬，蜜饯及罐头样品，将样品用粉碎机或高速组织捣碎并混合均匀。取适量样品（按其总酸含量而定），用L15m无CO蒸馏水（果蔬干品须加9-8倍无OC蒸馏22
水）将其移入L205m容量瓶中，在587-0℃水浴上加热50h.（果脯类沸水浴加热1h），冷却后定容，用干滤纸过滤，弃去初始滤液L25m，收集滤液备用。 ②含CO的饮料、酒类：将样品置于40℃水浴上加热in30m，以除去CO，冷却后备用。 22③调味品及不含CO的饮料、酒类：将样品混匀后直接取样，必要时加适量水稀释，（若样2品混浊，则需过滤）。 ④咖啡样品：将样品粉碎通过40目筛，取10g粉碎的样品于锥形瓶中，加入L75m，80%乙醇，加塞放置1h6，并不时摇动，过滤。 ⑤固体饮料：称取5-g10样品，置于研钵中，加少量无CO蒸馏水，研磨成糊状，用无CO22蒸馏水将入L520m容量瓶中，充分振摇，过滤。 ⑵测定 准确吸取上法制备滤液L50m，加酚酞指示剂3-4滴，用ol/，HOaN标准溶液滴定至微红色30s不褪，记录消耗 oLl1/标准溶液的Lm数。 3、计算： C×V×K×V0总酸度=×100 m×V1式中：C－标准HOaN溶液的浓度，ol/mL； V－滴定消耗标准HOaN溶液体积，Lm； M－样品质量或体积，g或Lm； V－样品稀释液总体积，Lm； 0V－滴定时吸取的样液体积，Lm； 1K－换算系数，即o l1mmHOaN相当于主要酸的克数。 因食品中含有多种有机酸，总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。（见表7-6） 表7-6 换算系数的选择 分析样品 主要有机酸 换算系数 葡萄及其制品 酒石酸 柑橘类及其制品 柠檬酸 或（带一分子结晶水） 苹果、核果及其制品 苹果酸 乳品、肉类、水产品及其制品 乳酸 酒类、调味品 乙酸 菠菜 草酸 4、讨论 （1）本法适用于各类色浅的食品中总酸的测定。 （2）食品中的酸是多种有机弱酸的混合物，用强碱滴定测其含量时滴定突跃不明显，其滴定终点偏碱，一般在2p8H.左右，故可选用酚酞作终点指示剂。 （3）对于颜色较深的食品，因它使终点颜色变化不明显，遇此情况，可通过加水稀释，用活性炭脱色等 方法处理后再滴定。若样液颜色过深或浑浊，则宜采用电位滴定法。 （4）样品浸渍，稀释用的蒸馏水不能含有CO，因为CO溶于水中成为酸性的HCO形式，2223影响滴定终点时酚酞颜色变化，无CO蒸馏水在使用前煮沸in15m并迅速冷却备用。必要2时须经碱液抽真空处理。 样品中CO对测定亦有干扰，故在测定之前对其除去。 2（5）样品浸渍，稀释之用水量应根据样品中总酸含量来慎重选择，为使误差不超过允许范围，一般要求滴定时消耗 oL/溶液不得少于L5m，最好在L0-115m。
二、pH值的测定 食品的pH值变动很大，这不仅取决于原料的品种和成熟度，而且取决于加工方法，对于肉食品，特别是鲜肉，通过对肉中有效酸度即pH值的测定有助于评定肉的品质（新鲜度）和动物宰前的健康状况。动物在宰前，肌肉的pH值为.，宰后由于肌肉代谢发生变化，使肉的pH值下降，宰后一小时的鲜肉，pH值为6..23-6，42小时后，pH值下降到6-56..0，这种pH值可一直维持到肉发生腐败分解之前，此pH值称为“排酸值”。当肉腐败时，由于肉中蛋白质在细菌酶的作用下，被分解为氨或胺类等碱性化合物，可使肉的pH值显著增高，此外动物在宰前由于过劳患病，肌糖原减少，宰后肌肉中乳酸形成减少，pH值也因此增高。 食品的pH值和总酸度之间没有严格的比例关系，测定pH值往往比测定总酸度具有更大的实际意义，更能说明问题。pH值的大小不仅取决于酸的数量和性质，而且受该食品中缓冲物质的影响。 pH值测定方法有pH试纸法，标准色管比色法和Hp计测定法。 三种方法比较以pH计法准确且简便。 （一）pH计法（电位法） 1、原理：利用电报在不同溶液中所产生的电位变化来测定溶液的pH值。将一个测试电极（玻璃电极）和一个参比电极饱和甘汞电报同浸于一个溶液中组成一个原电池。玻璃电极所显示的电位可因溶液氢离子浓度不同而改变，甘汞电极的电位保持不变，因此电极之间产生电位差（电动势）， 电池电动势大小与溶液HP值有直接关系： 00E=E−(25C) 即在25℃时，每样差一个pH值单位就产生的电池电动势，利用酸度汁测量电池电动势并直接以pH表示，故可从酸度计表头上读出样品溶液的pH值。 2、适用范围 本法适用于各类饮料，果蔬及其制品，以及肉、蛋类等食品中pH值的测定。测定值可准确到0p01H.单位 3、主要仪器 ⑴Sp-H3C型酸度汁（或其它型号） ⑵213型（或212型）玻璃电极及32型（或222型）甘汞电极 ⑶电磁搅拌器 ⑷高速组织捣碎机 4、操作方法 ⑴样品处理 ①一般液体样品（如牛乳、不含CO的果汁、酒等样品）摇匀后可直接取样测定。 2 ②含CO的液体样品（如碳酸饮料、啤酒等）：同“总酸度测定”方法排除CO后再测定。 22③果蔬样品，将果蔬样品榨汁后，取果汁直接进行Hp测定。对果蔬干制品，可取适量样品，加数倍的无CO蒸馏水，于水浴上加热in30m，再捣碎，过滤，取滤液测定。 2④肉类制品：称取1g0已除去油脂并捣碎的样品于L205m锥形瓶中，加入L100m无CO2蒸馏水，浸泡in15m，并随时摇动，过滤后取滤液测定。 ⑤鱼类等水产品，称取0g1切碎样品，加无CO蒸馏水L100m，浸泡i3n0m（随时摇动），2过滤后取滤液测定。 ⑥皮蛋等蛋制品：取皮蛋数个，洗净剥壳，按皮蛋：水为2：1的比例加入无CO蒸馏水，2于组织捣碎机中捣成匀浆。再称取5g1匀桨（相当于1g0样品），加无OC蒸馏水至L105m，2搅匀，纱布过滤后，取滤液测定。
⑦罐头制品（液固混合样品）先将样品沥汁液，取浆汁液测定，或将液固混合捣碎成浆状后，取浆状物测定。若有油脂，则应先分出油脂。 ⑧含油及油浸样品，先分离出油脂，再把固形物经组织捣碎机捣成浆状，必要时加少量无CO蒸馏水（L/1g200m样品）搅匀后，进行pH值测定。 2⑵酸度计的校正 ①开启酸度计电源，预热in30m，连接玻璃电极及甘汞电极，在读数开关放开情况下调零。 ②选择适当Hp值的标准缓冲液（其Hp值与被测样液的pH值应相接近）。 ③测量标准缓冲浸入缓冲液中，按下读数开关，调节定位旋钮使pH值指针指在缓冲溶液的pH值上，放开读数开关，指针回零，如此重复操作两次。 ⑶样液pH值的测定 ①用无CO蒸馏水淋洗电极，并用滤纸吸干，再用待测样液冲洗两电极。 2②根据样液温度调节酸度计温度补偿旋钮，将两电极插入待测样液中，按下读数开关，稳定in1m后，酸度计指针所指pH值即为待测样液pH值。 ③放开读数开关，请洗电极。 5、说明 ⑴新电极或很久未用的干燥电极，必须预先浸在蒸馏水或ol0/.L1m盐酸溶液中24h以上，其目的是使玻璃电极球膜表面形成有良好离子交换能力的水化层。玻璃电极不用时，宜浸在蒸馏水中。 ⑵玻璃电极的玻璃球膜壁薄易碎，使用时应特别小心，安装两电极时玻璃电报应比甘汞电极稍高些。若玻璃膜上有油污，则将玻璃电极依次浸入乙醇，丙酮中清洗，最后用蒸馏水冲洗干净。 ⑶甘汞电极中的氯化钾为饱和溶液，为避免在室温升高时，氯化钾变为不饱和，建设加入少许氯化钾晶体，但应防止晶体堵塞，甘汞电极砂感陶瓷通道。在使用时，应注意排除弯管内的气泡和电极表面或液体接界部位的空气泡，以防溶液被隔断，引起测量电路断路或读数不稳。并检查陶瓷砂芯（毛细管）是否畅通，检查方法是：先将砂芯擦干，然后用滤纸紧贴在砂芯上，如有溶液渗下，则证明陶瓷砂芯未堵塞。 ⑷在使用甘汞电极时，要把电极上部的小橡皮塞拔出，并使甘汞电极内氯化钾溶液的液面高于被测样液的液面，以使陶瓷砂芯处保持足够的液位压差，从而有少量的氯化钾溶液从砂芯中流出，否则，待测样液会回流扩散到甘汞电极中，将使结果不准确。 ⑸使用玻璃电极测试pH值时，由于液体接界电位随试液的HP值及成分的改变而改变，故在校正和测定过程中，公式 E=Eº-中的Eº可能发生变化，为了尽量减少误差，应该选用pH值与待测样液Hp值相近的标准缓冲溶液样正仪器。 ⑹仪器一经标定，定位和斜率二旋钮就不得随意触动，否则必须重新标定。 （二）比色法 比色法是利用不同的酸碱指示剂来显示pH值，由于各种酸碱指示剂，在不同的pH值范围内显示不同的颜色，故可用不同指示剂的混合物显示各种不同的颜色来指示样液的pH值。 根据操作方法的不同，此法又分为试纸法和标准签比色法 1、试纸法（尤其适用于固体和半固体样品HP测定） 将滤纸裁成小片，放在适当的指示剂溶液中，浸渍后取出干燥即可，用一干净的玻璃棒沾上少量样液，滴在经过处理的试纸上（有广泛与精密试纸之分），使其显色，在2-3s后，与标准色相比较，以测出样液的pH值。此法简便、快速、经济、便结果不够准确，仅能粗略估计样液的pH值。 2、标准管比色法 用标准缓冲液配制一不同pH值的标准系列，再各加适当的酸碱指示剂使其干不同pH呈不
同颜色，即形成标准色，在样液中加入与标准缓冲相同的酸碱指示剂，显色后与标准色管之颜色进行比较，与样液颜色相近的标准色管中缓冲溶液的Hp值即为待测样液的pH值。 此法适用于色度和混浊度甚低的样液pH值的测定，因其受样液颜色，浊度，胶体物和各种氧化剂和还原剂的干扰，故测定结果不甚准确，其测定仅能准确到p1H0.单位。 三、挥发酸的测定 挥发酸是食品中含低碳链的直链脂肪酸，主要是醋酸和痕量的甲酸，丁酸等，不包括可用水蒸气蒸馏的乳酸，琥珀酸，山梨酸以及CO和OS等。正常生长的食品中，其挥发22酸的含量较稳定，若在生产中使用了不合格的果蔬原料，或违反正常的工艺操作或在装罐前将果蔬成品放置过久，这些都会由于糖的发酵而使挥发酸增加，降低了食品的品质，因此挥发酸含量是某些食品的一项质量控制指标。 总挥发酸可用直接法或间接法测定。直接法是通过水蒸汽蒸馏或溶剂萃取把挥发酸分离出来，然后用标准碱滴定，间接法是将挥发酸蒸发除去后，滴定不挥发酸，最后从总酸度中减去不挥发酸，即可得出挥发酸含量。前者操作方便，较常用，适合于挥发酸含量较高样品。若蒸馏液有所损失或被污染，或样品中挥发酸含量较少，宜用间接法。 下面介绍水蒸汽蒸馏 1、原理 样品经适当处理后，加适量磷酸使结合态挥发酸游离出，用水蒸汽蒸馏分离出总挥发酸，经冷凝，收集后，以酚酞作指示剂，用标准碱液滴定至微红色30s不褪为终点，根据标准碱消耗量计算出样品中总挥发酚含量。 2、仪器 ⑴水蒸气蒸馏装置（图1-7） ⑵电磁搅拌器 3、样品处理方法 ⑴一般果蔬及饮料可直接取样。 ⑵含CO的饮料，发酵酒类，须排除CO，方法是：取L10800-m（g）样品置三角瓶中，22在用电磁搅拌器连续搅拌 同时，于低真空下抽气in2-4m，以除去CO。 2⑶固体样品（如干鲜果蔬及其制品）及冷冻、粘稠等制品，先取可食部分加入一定量水（冷
冻制品先解冷）用高速组织捣碎机捣成浆状，再称取处理样品1g0,加无CO蒸馏水溶解并2稀释至L25m。 4、测定 ⑴样品蒸馏：取L25m经上述处理的样品移入蒸馏瓶中，加入L25m无CO蒸馏水和2L110%HmOP溶液，如图7-1连接蒸汽蒸馏装量，加热蒸馏至馏出液约L030m为止。于相34同条件下作一空白试验。 ⑵滴定：将馏出液加热至650-6℃（不可超过），加入3滴酚酞指示剂，用ol/标准溶液滴定到溶液呈微红色30s不褪色，即为终点。 5、计算 (V−V)×C12挥发酸（以醋酸计g/100g样品）=××100 m式中m——样品质量或体积，g或lm； V——样液滴定消耗标准HOaN的体积，lm； 1V——空白滴定消耗标准HOaN的体积，lm； 2C——标准HOaN溶液的浓度，ol/Lm； ——换算为醋酸的分数，即o l1mmHOaN相当于醋酸的克数。 6、说明 ⑴样品中挥发酸的蒸馏方式可采用直接蒸馏和水蒸汽蒸馏，但直接蒸馏挥发酸是比较困难的，因为挥发酸与水构成有一定百分比的混溶体，并有固定的沸点。在一定的沸点下，蒸汽中的酸与留在溶液中的酸之间有一平衡关系，在整个平衡时间内，这个平衡关系不变。但用水蒸汽蒸馏，则挥发酸与水蒸汽是和水蒸汽分压成比例地自溶液中一起蒸馏出来，因而加速挥发酸的蒸馏过程。 ⑵蒸馏前应先将水蒸汽发生瓶中的水煮沸in10m，或在其中加2滴酚酞指示剂并滴加HOaN使其呈浅红色，以排除其中的CO。 2⑶溶液中总挥发酸包括游离挥发酸和结合态挥发酸。由于在水蒸汽蒸馏时游离挥发酸易蒸馏出，而结合态挥发酸则不易挥发出，给测定带来误差。故测定样液中总挥发酸含量时，须加少许磷酸使结合态挥发酸游离出，便于蒸馏。 ⑷在整个蒸馏时间内，应注意蒸馏瓶内液面保持恒定，否则会影响测定结果，另要注意蒸馏装置密封良好，发防挥发酸损失。 ⑸滴定前必须将蒸馏液加热到6650-℃，使其终点明显，加速滴定反应，缩短滴定时间，减少溶液与空气接触机会，以提高测定精度。 ⑹样品中含有CO和OS等易挥发性成分，对结果有影响，须排除其干扰。排除CO方法222见前述部分。排除OS方法如下：在已用标准碱液滴定过的蒸馏液中加入L25%HmOS224酸化，以淀粉溶液作指示剂，用 ol2/滴定至蓝色，01s不褪为终点，并从计算结果2中扣除此滴定量（以醋酸汁）。 第三节 食品中有机酸的分离与定量 一、概述 分析食品中的有机酸时可分为两种情况，一是要求了解总酸量，它可使用pH指示剂以规定的碱溶液滴定来求得。另一是要求了解特定的酸的含量，有时要了解全部有机酸的组成，这正是食品科学研究发展所需要的分析项目。有机酸不仅作为酸味成分，而且在食品的加工，贮存，品质管理，质量评价以及生物化学等广泛领域，被认为是重要的成分。因此对于有机
酸的分离与定量具有现实意义。 二、有机酸的分离与定量方法简介 在05年代初期以前，对食品中的有机酸的分离和定量都比较困难，1925年布洛林（nlbeu）研制成了硅胶色谱法，但此法不仅制备柱子要求有高度的技术和小心操作，而且还要用馏分收集器分取洗出液，用碱滴定各分馏液，操作很复杂。1966年，在此法基础上，开发出用稳流泵将指示剂连续不断地与洗 出液混合，测定其吸光度进行检测的有机酸自动分析法。但此法也存在着一些问题，如柱子的制备麻烦，需要有组成复杂的洗 提液，而且分析时间较长等，所以实际应用较困难。纸色谱法及薄层色谱法也可用于食品中有机酸的分析，但这两种色谱法只是定性和半定量分析，且需要冗长的富集，浓缩，皂化等许多预处理步骤，操作十分繁琐，故实际应用亦不多。目前比较常用的方法是气相色谱法，离子交换色谱法和高效液相色谱法。 采用气相色谱法不仅可以分析香气成分之类的挥发性物质，而且糖和氨基酸等不挥发性物质，经过转变为挥发性衍生物后也能分析，在适当则定条件下，许多物质都能准确，迅速，容易地加以分析，因而这方法具有普及性，但在一般气相色谱条件下，许多种类有机酸是不挥发性的，故需其转化成挥发性衍生物，常用方法有甲酯化法和三甲基硅烷 （TMS）衍生法，所以说采用此法仍需对样品进行前处理，以分离出有机酸。 离子交换色谱法最初用于有机酸的分析时与硅胶色谱法相似，亦是采用将分离的各馏分滴定中和的方法。近年来，此法有很大进展，已研究出对有机酸的羧基有特异性的高灵敏度检测方法及带有这种检测器的自动分析仪（即羧酸分析仪）。并研究开发出一种新型的离子交换色谱法即离子色谱法，由于这种新型离子交换色谱法具有简便，快速和高灵敏度等独特优点，使该方法被广泛地用于分析各种食品中有机酸的组成和含量。 近年来，随着高效液相色谱分析法的广泛应用，最近也已用于有机酸的分离与测定，此法只需对样品进行离心或过滤等简单预处理，而不需要太多的分离处理手续，操作十分简单，其他组分的干扰少。高效液相色普法最初用于有机酸分析时，采用强阴，阳离子交换树脂的柱通过离子排斥和分配色谱分离有机酸，以示差折光检测器或紫外分光检测器检测。最近由于键合填料在CLPH上的应用，使得采用C等反相柱分离食品中有机酸，并以紫外分81光检测器或电化学检测器沉淀的方法越来越完善、准确。 三、气相色谱法 1、原理：在硫酸的催化下，使有机酸成为丁酸衍生物，用气相色谱法定量。 2、适用范围： 本法适用于水果，蔬菜、腌制的农产品，清凉饮料、酒精饮料、酱油、蛋黄酱、咖啡等，可分别定量的有机酸有甲酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、乳酸、异戊酸、正戊酸、异己酸、正己酸、乙酰丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、反丙烯酸以及柠檬酸等。分析时需要的酸的最小含量，因酸的种类不同而异：甲酸、乙酸等低相对分子质量酸为g1m，苹果酸、柠檬酸等约g1m0，酒石酸若少于g10m便不能获得高精度分析结果。 3、试剂 离子交换树脂：使用阳离子交换树脂berliAtme（一种人工合成的酚甲醛离子换树脂）C1G20；阴离子交换树脂berliteA mCBG4； berlite Am10IRA4。 4、仪器 气相色谱仪：装有氢火焰离子检测器，程序升温装置。 柱：填充%1S0ieol nic05 6DcdoDlLias（60-8目）的3mm×2m不锈钢柱或玻璃柱。 5、测定 （1）、试样制备：将试样在60℃热水中均质，离心分离得有机酸提取液。取一定量（为了以ol/液中和，约需ol10m）通过离子交换树脂柱（图7-2），使有机酸被阴离子
交换树脂吸附。 取下阳离子变换树脂柱，将L0m5，ol2/Lm氨水通过阴离子交换树脂柱，使酸转变为铵盐洗 脱。洗脱液用旋转式蒸发器浓缩，馏出过剩的氨后，再通过阳离子交换树指柱，使有机酸成为离态。用酸酞作指示剂，用ol1/溶液滴定，求总酸量。同时使有机酸成为钠盐。将相当于滴定值约01毫升的试样浓缩，在具塞试管内干涸。 （2）酯化：在用上述方法制备的有机酸中，加Lm2丁醇，2 g无水硫酸钠，浓硫酸，连接冷凝管，在电热板上平衡沸腾约in30m（加热不断搅伴），使有机酸成了酯。 （3）脂的提取：酯化终了，加水和已烷L5m。使酯转溶于已烷中，每次用约L5m已烷提取3次，用安全移液管移入L02m容量瓶中（容量瓶中事先已袋有50%.十九烷（内标）的已烷溶液L1m），用已烷定容。再中入无水硫酸钠，去除混入的微量硫酸。取5uL进行气相色谱分析。 （4）分析：柱子在60℃下保持in6m后，以每分钟升温5℃速度升至205℃，氮气、氢气、空气的流量分别是60、05、iLn/0m90m气化室和检测器的温度为206℃。 将已知浓度的标准有机酸用上述方法制成丁酯后，用气相色谱仪分析，制作工作曲线，样品与工作曲线相比较，计算出样品含量。 6、说明： 对于含盐食品如酱油等，用离子交换树脂进行前处理很困难，可用乙醚提取，操作如下：取无水硫酸钠和硅藻土各2g0置于烧杯中，加乙醚L200m，边用大型搅拌器搅拌，边滴加，用盐酸调整 pH为 2~1的酱油L10m。搅拌提取in1m0后收集乙醚，再用乙醚（L105m×3次）提取，将收集的乙醚合并于分液漏斗中。加L20o5l0/mmL氨水充分混合，使有机酸转溶于水中，蒸馏出氨，直至氨的气味基本消失。用berliteA mC2G10处理成为游离酸，用ol/溶液中和。所得到的酱油有机酸的钠盐蒸发干涸后，由于硫酸一丁醇作用生成了丁酯，供气相色谱分析用。 阳离子交换树脂Ambertlei 01C2G； 阴离子交换树脂berAlmite CG4B； 或berlite AmA4I1R0。 四、高效液相色谱法 1、原理 样品经过高速离心及适当超滤等处理后，直接注入反相化学键合柱（C填料）的液相18色谱体系，以磷酸二氢铵为流动相，有机酸在两种中进行了分配分离，于紫外检测器 200nm波长下进行液相色谱定量分析。 2、适用范围 本法可适用于果蔬及其制品，各种酒类，调味品及乳和乳制品中主要有机酸分离与测定，本法分析一次试样约in1m4，可同时分离分析柠檬酸、酒石酸、苹果酸等七种有机酸，对有机酸的最小检测量为ol1mm10.（草酸）。
3、试剂 〈1〉高纯水：由超纯水制备装置制备，并经过. 405um滤膜于真空超滤。 〈2〉流动相：%NHOP（05p2H.）,称取分析纯磷酸二氢铵20 5g.，用超纯水溶解并424定容至1L，用浓HOP调节至pH为520.，然后用4u05m.孔径的合成维素酯滤膜进行真空34超滤，再经超声波脱气5分钟后用作流动相。 〈3〉有机酸标准混合液：分别准确取RA的草酸g5m，酒石酸g50m，苹果酸g105m，乳酸200 gm，乙酸200 gm，柠檬酸102 gm和琥珀酸108 gm（准确），以52%溶液溶解并稀释为L100m，使各有机酸浓度分别为50、050、1050、200、200、1020、1080 ppm。 〈4〉08%乙醇溶液 吸取分析纯无水乙醇L80m，用高纯水稀释至L100m。 4、仪器 〈1〉高效液相色谱议（aterW公司）：包括501型高压输液泵，6UK进样器，418型可变波长紫外检测器，以及3M07型数据处理装置或工作站。 〈2〉超纯水制备装置：Mill-Q，porielMl公司 〈3〉高速离心机：SCR20BC型，hcatiiH公司 〈4〉酸度汁：Sp-H3C型 〈5〉恒温水浴锅 5操作方法 （1）样品处理 〈1〉固体样品：称取50~1g样品（视有机酸含量而定）于加有石英砂的研钵中研碎，用 L25m80%乙醇转移到50 Lm锥形瓶中，于75℃水浴中加热浸提in15m，在2万转/分下离心in20m，沉淀用L8100%m乙醇洗涤两次，离心分离后，合并上清液并定容L50m。取L5m上清液于蒸发皿中，在75℃水浴上蒸干，残渣 加L5m流动相溶解，离心，上清液经m4u05.滤膜在真空下超滤后进样。 〈2〉液体样品：吸取L5m样液（视有机酸含量酌情减）于蒸发皿中，在57℃水浴上蒸干，残渣加L850%m乙醇溶解，离心，上清液水浴蒸干，残渣加Lm5流动相溶解，离心，上清液经4u05m.滤膜于真空下超滤后进样。 （2）色谱分析条件： 色谱柱：Morkipnb cdoC柱， m8m 10mX0ImD81固定相：oun-dBapak C 01um81流动相：2%. 5HN HOP （） 424流速：inL/ m2m检测器：紫外可变波长检测器 检测波长： n002m录敏度： 纸速：in/ 柱温：室温 （3）测定 ①标准曲线绘制：分别取有机酸标准混合溶液1，2，4，6，8，01uL进样进行色谱分析，得出有机酸标准色谱图，以各有机酸的峰高或峰面积为纵坐标，以各有机酸含量（ug）为横坐标分别绘制各有机酸的标准曲线，或用最小二乘法原理建立各种有机酸的回归方程。 ②样品测定：取适量样品处理液进行色谱分析，得出样品色谱图。 6、结果计算 将同一色谱条件下得到的样品色谱图和有机酸标准溶液色谱图进行对照，根据色谱峰的
保留时间定性。必要时可在样液中加入一定量的某种有机酸标准液以增加峰高方法来进行定性。根据峰面积或峰高进行定量，再根据样品稀释倍数即可求出样品中各有机酸的含量。 图7-3是上述色谱条件下的桔子提取液色谱图。 图7-3桔子提取液中有机酸的高效液相色谱图 1. 溶剂峰；2.草酸；3.酒石酸；4.苹果酸；5.乳酸； 2. 6.乙酸；.7柠檬酸；8.琥珀酸；（其他为未知峰） 7、说明 （1）在样品溶液测定中，每进三次样液，就应进一次标准溶液进行校正，并重新计算校正系数，以保证测定结果的准确度。 （2）在提取样品中有机酸时，应选择80%乙醇溶液作提取剂，即可使有机酸提取完全，还可避免样品中蛋白质溶出影响色谱柱的使用寿命。若选择水或ol/51L~作提取剂，则可能使有机酸提取不完全或使样液中碳水化合物降解成草酸而影响测定结果。 （3）在反相CLPH分离中，被分离组分的极性越弱，与键合相表面烷基之间色散力越强，K¹就越大，相反，极性越强，即分子所含羟基数和羰基数越多，与流动相溶剂分子形成的氢键就越强，K¹就越小，故根据有机酸的paK值与分子极性成负相关的关系，理论上其)1(K¹顺序为草酸﹤酒石酸﹤柠檬酸﹤苹果酸﹤乳酸﹤琥珀酸﹤乙酸，但只有柠檬酸和琥珀酸都含有两个可与键合相表面烷基产生色散力的亚甲基，且前者的两个亚甲基都被带有部分正电荷的碳原子隔开，故它的烷基色散力小于后者。故实际的K¹是草酸﹤酒石酸﹤苹果酸﹤乳酸﹤乙酸﹤柠檬酸﹤琥珀酸。 （4）本法回收率试验结果表明，除易挥发的乙酸外，其它有机酸的回收率都较为理想，不同有机酸回收率不同，而且，对同一种有机酸，在不同的样品中，回收率略有区别。 五、离子交换色谱法（羧酸分析仪） 1、原理： 羧酸分析议是由有机酸分离部分和检测部分组成，前者是利用强碱性阴离子交换树脂柱进行分离，后者是利用对羧基具有特殊高灵敏度的显色反应。显色原理是：在N，N¹一双环已基碳酰亚胺（CCD）和羧酸反应，生成的酰基异尿素中加入羟基胺，生成氧肟酸，在酸性下使其与三价铁离子反应，生成紫红色的螯合物（其λax=5n3m0）由比色计来检测吸光度，以记录仪记录出色谱图而进行定性容量分析。 反应式如下： CHNHCH611CH N611611HNOH2+ +RCONHOHOCCNRCOOHCRCOOHNCHCHN611CHHN611611
+3+2++RCONHOHFe (RCONHOFe)H+ 紫红色螯合物 2、适用范围 本法适用于水果、蔬菜、食醋、酱油、果酒、啤酒及咖啡等。能够检测的酸的最小量为一般分析一个试样时间为2h。反丁烯二酸和顺丙烯三酸需较长时间方能洗脱，所以多不分析，另外此法不能检测草酸。 3、仪器和试剂 羧酸分析仪（盛进制药公司制） 分离柱为带有保温套管的耐压玻璃管（3mm×10m0m） -柱内装强碱性阴离子交换树脂：ioDani -C0A8S（C1） m4~u11-由三菱化成工业公司生产或--08 SAS（C1）u1m4~1由盛进制药公司生产。 4、操作步骤 （1）试样的制备 用ol2/稀释后即可作为试样溶液，若样品中含有蛋白质需要除去时，加入试样溶液量41/的1%0高氯酸，离心分离，以上清液作为试样。 （2）分析 羧酸分析仪流程图如图4- 7 1.洗脱剂储槽（ ol/）;2.玻璃分离器；3.洗脱剂输液泵（流速 压力表；5.过滤器；6.回路进样器（样品杯体积约133μL）；7.色谱柱（1m×,3mm柱温50℃）；8.混合器；.9反应线路（3m0）；10.桓温水浴槽（50℃）；四通阀；12.流通池（光程m20m）；13.比色计；沉淀过滤器；15.双笔记录仪；16.反压（阻力）线圈；17.废液；18.氢氧化钾管；试剂储槽（o1Ll6/m10.高氯酸羟胺（PAH）和ol/三乙胺（TEA）的乙醇溶液）；20.试剂输液泵Ⅰ（Lin/m60m.）;.21阻力管；.2 2试剂储槽（ ol/溶液）； 试剂输液泵Ⅱ（inL4/）；42 .试剂储槽（ol/的高氯酸亚铁溶液）；2 5.试剂输液泵Ⅲ（inL0/.m3m）。 将ol2/的ICH，以inl/的速度从容器泵3送入阴离子交换树脂柱7中。将133uL
试样溶液加进试样注入口6。容器91中的ol/1mL610.高氯酸羟胺（PAH）和ol/三乙胺（TEA）的乙醇溶液和容器22中的 ol/乙醇溶液，分别由泵2203.进入反应槽01中，然后与从容器42由泵52送来的ol50/的高氯酸亚铁的ol/高氯酸酸性乙醇溶液混合，则比色计31测定503nm的吸光度，由记录仪51记录各有机酸色谱峰。 5、计算 用ol0/.L2m盐酸配制的一系列浓度不同的标准有机酸混合溶液，注入羧酸分析仪中进行分析，以所得色谱峰高或峰面积对标准有机酸含量（ug）绘制标准曲线，由试样的色谱峰保留时间定性，根据峰高或峰面积定量。结果色谱图见图5~7。 图7-5 有机酸的羧酸分析仪色谱图 1. 谷氨酸；2.葡萄糖醛酸；3.焦谷氨酸；4.乳酸；5.乙酸； 6.酒石酸；.7苹果酸；8.柠檬酸；9.琥珀酸；10.α-酮戊二酸 六、酮酸的薄层色谱法 1、原理 使酮酸与42.一二硝基苯肼反应生成腙，用有机溶剂提取，将碳酸钠溶液加入提取液中，通过转溶酸性腙去除中 性物质。恢复成酸性再用有机溶剂提取，并用薄层色谱法分离酮酸腙。 2、适用范围： 本法适用于分析丙酮酸以及α-酮丁酸，乙酰丙酸，α-酮戊二酸等，适合于分析蔬菜与水果。 3、试剂 〈1〉薄层用硅胶 〈2〉展开剂：ol0/.L1m碳酸氢钠饱和乙酸乙酯溶液（＊）与甲醇混合（5﹕1）或用丁醇-乙醇ol/碳酸氢钠:3=0:混合液的上层液。 4、测定 〈1〉薄层板的制备：硅胶与 ol/CLaOHNm溶液1：1均匀混合后，在玻璃板上涂成~m2厚层，风干后在101℃下加热4h，使之活化，置于干燥器中备用。 〈2〉试样制备：将有机酸的水提取液离心分离，取上清液作为试样溶液，需除去蛋白质的试样，加入高氯酸后再离心分离，用氢氧化钠中和，作为试样溶液。 〈3〉酮酸2，4一二硝基苯腙的制备。 l10m试样溶液中加入溶于ol/LClH6m的 %12，4一二硝基苯肼溶液在52℃下保温
1h生成腙，用乙酸乙酯提取（L10m，2次）酮酸2，4一二硝基苯腙。提取液中加和%1 0aNCO23溶液L10m，转溶酸性腙。用碳酸钠转溶2次，收集水层。用L10m乙酸乙酯洗涤后，加浓盐酸调整pH为2。酮酸2，4-二硝基苯腙 再用乙酸乙酯（L10m，3次）提取。用旋转蒸发器减压干涸，溶于L1m乙酸乙酯中，取其一定量供分析用。 〈4〉分析；将点有样品溶液的薄层板，置于被展开剂蒸汽饱和了的展开槽内，用上行法展开，经h2-3，酮酸即可分离。 5、计算 样品中的酮酸与标准物R值对照，可进行定性鉴定。定量时，取下黄色斑点，溶解在f含有1%氨的甲醇中，干涸后溶解在 ol/溶液中，加入等量的 ol/2LmNaOH3溶液，用分光光度法测定产生的红色，与标样作对照，求出样品中的酮酸含量。酮酸R-值f与测定波长见表77~。 表7~7酮酸fR值和测定波长 酮酸 型 Rf 波长（nm） 二羟乙酸 顺 4 03. 460 反 1 07. 丙酮酸 顺 5 09. 461 反 2 0. α-酮丁酸 顺 1 46 反 α-酮戊酸 顺 57 0. 2 4 反 α-酮异戊酸 顺 403 反 α-酮己酸 顺 57 0. 402 反 α-酮已异酸 顺 402 反 α-酮-β-甲基戊酸 8 0. 340 α-酮-β-二甲基丁酸 58 0. 340 注＊乙酸乙酯和等量的 ol/的CaOHN用分液漏斗混合，使用乙酸乙酯层。 3思考题： 1. 食品酸度的测定有何意义？ 2. 牛乳酸度定义是什么？如何表示？ 3. 食品总酸度测定时，应该注意一些什么问题？ 4. 用水蒸汽蒸馏测定挥发酸时，加入01%磷酸的作用是什么？ （章银良）
第八章 脂类的测定 第一节 概 述 一、食品中的脂类物质和脂肪含量 脂类是食品的重要组成分，包括一些具有共同性质和相似组成的物质。食品中的脂类主要包括脂肪 (甘油三酸酯 )和一些类脂质, 如脂肪酸、磷脂、糖脂、甾醇、固醇等, 大多数动物性食品及某些植物性食品 (如种子,果实,果仁 )都含有天然脂肪或类脂化合物。各种食品含脂量各不相同, 其中植物性或动物性油脂中脂肪含量最高, 而水果蔬菜中脂肪含量很低。不同食品的脂肪含量如表8-1。 表 8-1 不同食品中的脂肪含量 二、脂类物质的测定意义 脂肪是食品中重要的营养成分之一, 可为人体提供必需脂肪酸；脂肪是一种富含热能的营养素,是人体热能的主要来源, 每克脂肪在体内可提供 67kJ ( 9klc a)热能, 比碳水化合物和蛋白质高一倍以上; 脂肪还是脂溶性维生素的良好溶剂, 有助于脂溶性维生素的吸收; 脂肪与蛋白质结合生成的脂蛋白, 在调节人体生理机能和完成体内生化反应方面都起着十分重要的作用。但过量摄入脂肪对人体健康也是不利的。 在食品加工生产过程中, 原料、半成品、成品的脂类含量对产品的风味、组织结构、品质、外观、口感等都有直接的影响。蔬菜本身的脂肪含量较低, 在生产蔬菜罐头时, 添加适量的脂肪可以改善产品的风味, 对于面包之类的焙烤食品, 脂肪含量特别是卵磷脂等组分, 对面包心的柔软度、面包的体积及其结构都有影响。因此, 在含脂肪的食品中, 其含量都有一定的规定,是食品质量管理中的一项重要指标。测定食品的脂肪含量, 可以用来评价食品的品质, 衡量食品的营养价值, 而且对实行工艺监督, 生产过程的质量管理, 研究食品的储藏方式是否恰当等方面都有重要的意义。 1
三、脂类的测定 食品中脂肪的存在形式有游离态的, 如动物性脂肪及植物性油脂; 也有结合态的, 如天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白及某些加工食品 (如焙烤食品及麦乳精等 )中的脂肪, 与蛋白质或碳水化合物等成分形成结合态。大多数食品中所含的脂肪为游离脂肪，结合态脂肪含量较少。 脂类不溶于水, 易溶于有机溶剂。测定脂类大多采用低沸点的有机溶剂萃取的方法。常用的溶剂有乙醚，石油醚、氯仿－甲醇混合溶剂等。其中乙醚溶解脂肪的能力强, 应用最多。但它沸点低 (634.℃ ),易燃 ,且可饱和约2％的水分。含水乙醚会同时抽提出糖分等非脂成分, 所以实用时, 必须采用无水乙醚做提取剂, 且要求样品必须预先烘干。石油醚溶解脂肪的能力比乙醚弱些, 但吸收水分比乙醚少, 没有乙醚易燃, 使用时允许样品含有微量水分，这两种溶剂只能直接提取游离的脂肪, 对于结合态脂类, 必须预先用酸或碱破坏脂类和非脂成分的结合后才能提取。因二者各有特点, 故常常混合使用。氯仿一甲醇是另一种有效的溶剂, 它对于脂蛋白、磷脂的提取效率较高, 特别适用于水产品、家禽、蛋制品等食品脂肪的提取。 用溶剂提取食品中的脂类时, 要根据食品种类、性状及所选取的分析方法, 在测定之前对样品进行预处理。有时需将样品粉碎、切碎、碾磨等; 有时需将样品烘干; 有的样品易结块,可加入4～6倍量的海砂; 有的样品含水量较高, 可加入适量无水硫酸钠, 使样品成粒状。以上处理的目的都是为了增加样品的表面积，减少样品含水量, 使有机溶剂更有效地提取出脂类。 食品的种类不同, 其中脂肪的含量及其存在形式就不相同, 测定脂肪的方法也就不同。常用的测定脂类的方法有: 索氏提取法、酸分解法、罗紫－哥特里法、巴布科克氏法、盖勃氏法和氯仿－甲醇提取法等。过去普遍采用的是索氏提取法, 此法至今仍被认为是测定多种食品脂类含量的有代表性的方法, 但对于某些样品测定结果往往偏低。酸水解法能对包括结合态脂类在内的全部脂类进行定量。而罗紫－哥特里法主要用于乳及乳制品中脂类的测定。本章将分别介绍以上各种方法。此外，对于食用植物油脂的几项化学特性，也介绍其测定原理和方法。 第二节 脂类的测定方法 一、索氏提取法 索氏提取法测定脂肪含量是普遍采用的经典方法，是国标的方法之一，也是美国CAOA法39092.、96390.中脂肪含量测定方法 (半连续溶剂萃取法)。随着科学技术的发展，该法也在不断改进和完善，如目前已有改进的直滴式抽提法和脂肪自动测定仪法。 (一) 原 理 将经前处理的样品用无水乙醚或石油醚回流提取, 使样品中的脂肪进入溶剂中, 蒸去溶剂后所得到的残留物, 即为脂肪 (或粗脂肪 )。 本法提取的脂溶性物质为脂肪类物质的混合物，除含有脂肪外还含有磷脂、色素、树脂、固醇、芳香油等醚溶性物质。因此，用索氏提取法测得的脂肪也称为粗脂肪。 (二) 适应范围与特点 此法适用于脂类含量较高, 结合态的脂类含量较少, 能烘干磨细, 不易吸湿结块的样品的测定。食品中的游离脂肪一般都能直接被乙醚、石油醚等有机溶剂抽提, 而结合态脂肪不 2
能直接被乙醚、石油醚提取, 需在一定条件下进行水解等处理, 使之转变为游离脂肪后方能提 取, 故索氏提取法测得的只是游离态脂肪, 而结合态脂肪测不出来。此法是经典方法, 对大多 数样品结果比较可靠, 但费时间, 溶剂用量大, 且需专门的索氏抽提器 (图1-)8。 图8-1 索氏抽提器 (三) 测定方法 1.滤纸筒的制备 将大小8cm×15cm的滤纸，用直径约2cm的试管为模型，将滤纸以试管壁为基础，叠折成底端封口的滤纸筒，筒内底部放一小片脱脂棉。在105℃中烘至恒重，置于干燥器中备用。 2.样品处理 .(1) 固体样品：精密称取干燥并研细的样品2～g5 (可取测定水分后的样品 ,)必要时拌以 海砂, 无损地移入滤纸筒内。 (2)半固体或液体样品: 称取05.～g001.于蒸发皿中, 加入海砂约 2g0,于沸水浴上蒸干后,再于95～150℃烘干、研细, 全部移入滤纸简内, 蒸发皿及粘附有样品的玻璃棒都用沾有乙醚的脱脂棉擦净, 将脱脂棉一同放在滤纸筒上面，再用脱脂棉线封捆滤纸筒口。 3.抽提 将滤纸筒放入索氏抽提器内, 连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶, 由冷凝管上端加入无水乙醚或石油醚, 加量为接受瓶的2 / 3体积, 于水浴上 (夏天56℃, 冬天80℃左右 )加热使乙醚或石油醚不断的回流提取, 一般提取h16,2~ 至抽提完全为止。 4.称重 取下接受瓶, 回收乙醚或石油醚, 待接受瓶内乙醚剩1~2 Lm时, 在水浴上蒸干, 再于01~015℃干燥,2 h取出放干燥器内冷却in, 30m称重, 并重复操作至恒重。 3
(四) 结果计算 m － m 21脂肪 (％ )＝ ×010 m式中： m ─ 接受瓶和脂肪的质量 ，g； 2 m─ 接受瓶的质量 ，g； 1 m─ 样品的质量 (如为测定水分后的样品, 以测定水分前的质量计)，g。 (五) 注意及说明 1.样品应干燥后研细, 样品含水分会影响溶剂提取效果, 而且溶剂会吸收样品中的水分造成非脂成分溶出。装样品的滤纸筒一定要严密, 不能往外漏样品, 但也不要包得太紧影晌溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管, 否则超过弯管样品中的脂肪不能抽提, 造成误差。 2.对含多量糖及糊精的样品, 要先以冷水使糖及糊精溶解 ,经过滤除去, 将残渣连同滤纸一起烘干, 放入抽提管中。 3.抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物, 挥发残渣含量低。 4. 过氧化物的检查方法：取6 Lm乙醚, 加2 L10m％碘化钾溶液, 用力振摇, 放置inlm后,若出现黄色, 则证明有过氧化物存在, 应另选乙醚或处理后再用。 5. 提取时水浴温度不可过高, 以每分钟从冷凝管滴下80滴左右, 每小时回流6～12次为宜, 提取过程应注意防火。 6. 在抽提时,冷凝管上端最好连接一支氯化钙干燥管, 如无此装置可塞一团干燥的脱脂棉球。这样, 可防止空气中水分进入, 也可避免乙醚在空气中挥发。 7. 抽提是否完全可凭经验, 也可用滤纸或毛玻璃检查, 由抽提管下口滴下的乙醚滴在滤纸或毛玻璃上, 挥发后不留下油迹表明已抽提完全, 若留下油迹说明抽提不完全。 8. 在挥发乙醚或石油醚时, 切忌用直接火加热。烘前应驱除全部残余的乙醚, 因乙醚稍有残留, 放入烘箱时, 有发生爆炸的危险。 (六) 改良直滴式抽提法 改进型直滴式抽提法的原理、试剂、结果计算与索氏抽提法一样，只有操作方法上略有不同。主要是使用直滴式抽提器或改进型直滴式抽提器一套, 见图8－2。 直滴式抽提器将索氏抽提器抽提筒旁边的虹吸管和支管除去, 并将筒底打通, 筒底附近加三个支点, 可将盛有试样的滤纸筒放入玻璃漏斗后, 置于抽提筒内的三个玻璃支点上, 抽提时烧瓶中乙醚蒸气通过抽提筒至冷凝器内被冷却, 液化后滴入滤纸筒, 抽提试样中脂肪后 ,滴入烧瓶中, 这样始终不断地有新乙醚来抽提试样中脂肪, 使乙醚与试样之间始终保持最大的浓度差, 处于最佳抽提效率。 测定方法： 将盛有试样滤纸筒置入抽提筒, 用乙醚抽提脂肪, 脂肪抽净后, 取出滤纸筒, 关上玻璃活塞, 继续加热即可回收乙醚, 其他操作同索氏抽提法。 直滴式抽提器虽然比索氏抽提器效率高, 速度快, 但抽提仍需6～ 8h。现在有不少改进型直滴式抽提器在直滴式基础上又进行以下几方面的改进： 4
图8－ 2 改进型直滴式抽提器 ① 加大仪器的容量, 增大滤纸筒内径, 使溶剂与试样接触面积增大; ② 冷凝器液滴口制成锯齿形, 既可增加回滴速度, 又可使液滴均匀分布滴入试样中; ③ 抽提筒置于烧瓶中, 使抽提在较高温度中进行, 提高抽提效率; ④ 烧瓶口口径加大, 可使烘干时间缩短, 使测定时间减少。 (七) oartecT脂肪自动测定仪 1.仪器构造 特卡托脂肪自动测定仪由主机 (抽提单元 )和辅助单元两部分构成。 辅助单元主要是为主机提供热循环介质, 使溶剂气化, 热介质由泵进行强制循环 ,与主机用管子连接。辅机上有一空气泵, 其作用是在分析结束时, 吸走抽提杯中残留的微量溶剂气体。 抽提杯一般为铝制 (也有玻璃制 ,)每套6个 ,可放入抽提杯安放架中, 便于插入主机内。抽提套可固定在抽提套安放架上, 抽提套支撑圈每套为7个, 其中6个插入主机内, 另l个同天平配套使用, 以简化称量程序。 2. 工作原理 将试样先浸泡在沸腾的溶剂中, 提取出大部分脂肪, 再把试样提出至溶剂液面上, 用溶 5
剂淋洗, 提取试样中残余的脂肪, 提取完成后, 蒸去溶剂, 将抽提杯烘干, 称重, 计算试样的粗脂肪 。 3. 测定方法 etcoarT脂肪自动测定仪操作流程如下： ①试样制备 (粉碎均匀)； ②称样 1)(m；③样品干燥；④抽提杯放入主机；⑤在沸腾位置抽提；⑥在淋洗位置抽提；⑦取出抽提杯；⑧干燥；⑨称重 m( )。 3 )l(向辅助单元添加水至离水箱边缘以下几厘米处, 并加入L05m左右润滑油(保护泵)。若使用油作热介质, 应使用油浴 eocra t(Thb otoil), 不可使用硅油, 因为硅油能损坏橡皮部件。 按电源开关 aing), (m将水浴加热到工作温度 (75℃ ,)一般约需in51m。 )2(把抽提筒 (滤纸筒 )与金属接头联结, 并放在支撑圈内 ,向圆筒内装入粉碎试样进行称样。脂肪含量小于10％的, 称样约,3 g大于01％, 称样约2g (m)。 1 )3(用圆筒手柄把抽提筒取出, 置于抽提筒架上, 在95～100℃烘箱中干燥h2。 )4(在装有试样的抽提筒中盖上脱脂棉, 用圆筒手柄将抽提筒插入主机的夹具孔内 (有6个夹孔, 可夹在6个抽提筒座内)。 )5(将抽提单元上球形按钮置淋洗 nign)si(R位置 ,磁铁立即吸住抽提筒接头, 拉下抽提筒座与夹具, 抽提筒恰好在冷凝器隔板下。 )6(将配有干净沸石的巳称重的6个抽提杯 (m ,)各加入L50m乙醚 (无过氧化物 ,)使带2有手柄的杯架, 一起插入抽提单元中, 降低左边把手, 使抽提杯卡紧在加热板上紧贴着冷凝器上的密封垫 (抽提单元放在通风橱内进行或后接排气管到室外)。 )7(打开冷凝水开关 (流速l～2 in)/mL。 )8(把球形开关调至沸腾 (b onlgi)位置, 抽提筒浸人溶剂中, 把冷凝器上的旋钮反时针方向转到较高的位置, 以便使冷凝器的溶剂能全部回到杯中, 打开加热 e(a Hting)阀, 使热水循环, 沸腾浸提。 )9(沸腾抽提10～5 1inm (时间取决于样品和溶剂类型 )把球形按钮转到淋洗 (Rinsing)位置, 抽提残余的脂肪。 (10) 淋洗后, 顺时针转动冷凝器上旋钮到较低位置, 避免冷凝的溶剂回流到抽提瓶内, 使溶剂收集在冷凝管内 (3~4 in), m按下辅助单元上的空气 )riA(按钮, 并打开抽提单元上的蒸发 (pnEo)ivr oat阀 ,最后的残余溶剂也被收集到冷凝管中。 )11(关掉加热 e(a Hting)阀和蒸发 (inE vto)oapr阀, 抬起左边把手, 取出6个抽提杯, 放至95～0l0℃烘箱中干燥3 0in, m取出置于干燥器中冷却, 称取抽提杯和油质量(m)。 3(12) 把抽提筒架上的抽提筒放到电热器上, 压低左边把手 ,拉动球形旋钮到沸腾 (bonlgi)位置 ,使抽提筒进入抽提筒座, 抬高把手, 取出抽提筒。 (13) 放入插有短柄漏斗的矮烧杯或瓶子, 反时针旋转冷凝器上面旋钮, 回收溶剂。如若需接着进行另一组试样测定时, 则按步骤(5)～1)(1进行操作, 并打开冷凝器的阀门。使用乙醚时,回收的乙醚在重用之前要进行过氧化物检验; 通过在冷凝器的顶部添加溶剂, 可调节回收溶液的体积。 (14) 关掉电源开关 (nMga)i, 关紧冷却水龙头, 检查所有冷凝器是否排空溶剂。 4. 结果计算 6
m － m 32粗脂肪 (％ )＝ × 100％ m1 式中： m ─ 样品的质量 ， g； 1 m ─ 抽提杯的质量 ，g； 2 m ─抽提杯和脂肪总质量 ，g。 3说明：试样粒度对测定结果的影响, 为了保证测定结果的准确性,一般要求试样的粒度应在l mm以下。 二、酸水解法 (一) 原 理 将试样与盐酸溶液一同加热进行水解, 使结合或包藏在组织里的脂肪游离出来, 再用乙醚和石油醚提取脂肪, 回收溶剂, 干燥后称量, 提取物的重量即为脂肪含量。 (二) 适用范围与特点 本法适用于各类食品中脂肪的测定, 对固体、半固体、粘稠液体或液体食品, 特别是加工后的混合食品, 容易吸湿、结块, 不易烘干的食品, 不能采用索氏提取法时, 用此法效果较好。此法不适于含糖高的食品, 因糖类遇强酸易碳化而影响测定结果。 酸水解法测定的是食品中的总脂肪, 包括游离脂肪和结合脂肪。 (三) 测定方法 l. 样品处理 (1)固体样品： 精密称取约02 g.,置于5 0Lm大试管中, 加 8Lm水, 混匀后再加 10mL盐酸。 (2)液体样品：称取置于5 0Lm大试管中, 加1 0Lm盐酸。 2. 水解 将试管放入07～08℃水浴中, 每5～in1m0用玻璃棒搅拌一次, 至样品脂肪游离消化完全为止, 约需04～in05m。 3. 提取 取出试管, 加入10 Lm乙醇, 混合 ,冷却后将混合物移入100 Lm具塞量筒中, 用25 Lm乙醚分次洗试管, 一并倒入量简中, 待乙醚全部倒入量简后, 加塞振摇inl, m小心开塞放出气体,再塞好, 静置in, 12m小心开塞, 用石油醚－乙醚等量混合液冲洗塞及筒口附着的脂肪。 静置10～in,m2 0待上部液体清晰, 吸出上清液于已恒重的锥形瓶内, 再加5 Lm乙醚于具塞量简内,振摇, 静置后, .仍将上层乙醚吸出, 放入原锥形瓶内。 4. 称重 将锥形瓶于水浴上蒸干后, 置100～150℃烘箱中干燥2h, 取出放入干燥器内冷却in3m0后称量, 并重复以上操作至恒重。 (四) 结果计算 m － m 21脂肪 (％ )＝ ×100 m 7
式中： m ─ 锥形瓶和脂类质量 ，g； 2m ─ 空锥形瓶的质量 ，g； 1 m─ 试样的质量 ，g。 (五) 说明与讨论 1. 样品经加热、加酸水解，破坏蛋白质及纤维组织，使结合脂肪游离后，再用乙醚提取。 2. 水解时应防止大量水分损失, 使酸浓度升高。 3. 乙醇可使一切能溶于乙醇的物质留在溶液内。 4. 石油醚可使乙醇溶解物残留在水层, 并使分层清晰。 5. 挥干溶剂后, 残留物中若有黑色焦油状杂质, 是分解物与水一同混入所致, 会使测定值增大, 造成误差, 可用等量的乙醚及石油醚溶解后过滤, 再次进行挥干溶剂的操作。 三、罗紫－哥特里法 (一) 原 理 利用氨－乙醇溶液破坏乳的胶体性状及脂肪球膜, 使非脂成分溶解于氨－乙醇溶液中 ,而脂肪游离出来, 再用乙醚－石油醚提取出脂肪, 蒸馏去除溶剂后, 残留物即为乳脂肪。 (二) 适用范围与特点 本法适用于各种液状乳 (生乳、加工乳、部分脱指乳、脱脂乳等 ,)各种炼乳、奶粉、奶油及冰淇淋等能在碱性溶液中溶解的乳制品, 也适用于豆乳或加水呈乳状的食品。本法为国际标准化组织 ,)OSI(联合国粮农组织/世界卫生组织)OHW/OAF(等采用, 为乳及乳制品脂类定量的国际标准法。需采用抽脂瓶 (图8－3)。 (三) 测定方法 取一定量样品 (牛奶吸取 L; m乳粉精密称取约l g, 用10 L60m℃水, 分数次溶解) 于抽脂瓶中, 加入 Lm氨水, 充分混匀, 置06℃水浴中加热in, 5m再振摇in, 2m加入1 0Lm乙醇,. 充分摇匀, 于冷水中冷却后, 加入L25m乙醚, 振摇半分钟, 加入2 5Lm石油醚, 再振摇in,0 .5m静置in, 30m待上层液澄清时, 读取醚层体积, 放出一定体积醚层于一已恒重的烧瓶中, 蒸馏回收乙醚和石油醚, 挥干残余醚后, 放入100～150℃烘箱中干燥1h.,5 取出放入干燥器中冷却至室温后称重, 重复操作直至恒重。 图8－ 3抽 脂 瓶 8
(四) 结果计算 m － m 21脂肪 (％ )＝ ×100 m× V/ V1式中： m ─ 烧瓶和脂肪质量 ，g； 2m─ 空烧瓶的质量 ，g； 1 m─ 样品的质量 ，g或Lm数×相对密度； V─ 读取醚层总体积 ，Lm； V ─ 放出醚层体积 ，Lm。 1(五) 说明与讨论 1. 乳类脂肪虽然也属游离脂肪, 但因脂肪球被乳中酪蛋白钙盐包裹, 又处于高度分散的胶体分散系中, 故不能直接被乙醚、石油醚提取, 需预先用氨水处理, 故此法也称为碱性乙醚提取法。 2. 若无抽脂瓶时, 可用容积100 Lm的具塞量简替用, 待分层后读数, 用移液管吸出一定量醚层。 3. 加氨水后 ,要充分混匀,否则会影响下步醚对脂肪的提取。 4. 操作时加入乙醇的作用是沉淀蛋白质以防止乳化, 并溶解醇溶性物质, 使其留在水中,避兔进入醚层, 影响结果。 5. 加入石油醚的作用是降低乙醚极性, 使乙醚与水不混溶, 只抽提出脂肪, 并可使分层清晰。 6. 对已结块的乳粉, 用本法测定脂肪, 其结果往往偏低。 四、巴布科克法和盖勃氏法 (一) 原 理 用浓硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质, 将牛奶中的酪蛋白钙盐转变成可溶性的重硫酸酪蛋白, 脂肪球膜被破坏, 脂肪游离出来, 再利用加热离心, 使脂肪完全迅速分离, 直接读取脂肪层可知被测乳的含脂率。 (二) 适用范围与特点 这两种方法都是测定乳脂肪的标准方法, 适用于鲜乳及乳制品脂肪的测定。但不适合测定含巧克力、糖的食品, 因为硫酸可使巧克力和糖发生炭化，结果误差较大。 改良巴布科克氏法可用于测定风味提取液中芳香油的含量 CAOA(法1) 1932.及海产品中脂肪 CAOA(法)1 的含量。 巴布科克氏法和盖勃氏法的原理相似，盖勃氏法较巴布科克法简单快速，多用一种试剂异戊醇。使用异戊醇是为了防止糖炭化。该法在欧洲比在美国使用更为广泛。 (三) 测定方法 l.巴布科克法 (1) 精确吸取6 .17Lm牛乳于巴布科克氏乳脂瓶 (图8－4) 中。 )2(加入硫酸 (相对密度.8611 ± 0300,.02℃ ) ,硫酸沿瓶颈壁慢慢倒入, 将瓶颈回旋, 充分混合至无凝块并呈均匀的棕色。 )3(将乳脂瓶离心in 5m(约0100r / in),m 脂肪分离升至瓶颈基部。 )4(加入热水使脂肪上浮到瓶颈基部, 离心in2m。 9
)5(再加入热水使脂肪上浮到2或3刻度处，离心in1m。 )6(置55～06℃水浴in5m后 ,立即读取脂肪层最高与最低点所占的格数, 即为样品含脂肪的百分率。 2.盖勃氏法 (1) 将l0 Lm硫酸倒入盖勃氏乳脂瓶 (图8－ 5)中。 )2(精确吸取1 1Lm牛乳于盖勃氏乳脂瓶中。 (2) 加入l Lm异戊醇 (相对密度1801.± 200,0. 20℃,沸程128～132℃)。 图8－ 4 巴布科克乳脂瓶 )4(盖紧塞子，振摇至呈均匀棕色液体, 静置数分钟。 )5(置于56～70℃水浴中in5m。 )6(取出擦干, 调节脂肪柱在刻度内, 放入离心机(8~0100r / in)m中离心in5m。 )7(将乳脂瓶置0~675℃水浴, in5m后取出, 立即读数, 即为脂肪的含量。 图8－ 5 盖勃氏乳脂瓶 10
(四) 说明与讨论 1. 硫酸的浓度要严格遵守规定的要求, 如过浓会使乳炭化成黑色溶液而影响读数 ;过稀则不能使酪蛋白完全溶解, 会使测定值偏低或使脂肪层浑浊。 2. 硫酸除可破坏脂肪球膜, 使脂肪游离出来外, 还可增加液体相对密度, 使脂肪容易浮出。 3. 盖勃氏法中所用异戊醇的作用是促使脂肪析出, 并能降低脂肪球的表面张力, 以利于形成连续的脂肪层。 4. l Lm异戊醇应能完全溶于酸中, 但由于质量不纯, 可能有部分析出掺入到油层, 而使结果偏高。 5. 加热 705~(6℃水浴中 )和离心的目的是促使脂肪离析。 6. 罗紫一哥特里法、巴布科克法和盖勃法都是测定乳脂肪的标准分析方法。根据对比研究表明, 前者的准确度较后两者高, 后两者中巴布科克法的准确度比盖勃法的稍高些, 两者差异显著。 五、其他方法简介 (一) 氯仿－甲醇提取法 该法简称CM法, 其原理是：将试样分散于氯仿－甲醇混合溶液中, 在水浴中轻微沸腾,氯仿、甲醇和试样中的水分形成三种成分的溶剂, 可把包括结合态脂类在内的全部脂类提取出来。经过滤除去非脂成分, 回收溶剂, 残留的脂类用石油醚提取, 蒸馏除去石油醚后定量。 本法适合于结合态脂类, 特别是磷脂含量高的样品, 如鱼、贝类, 肉、禽、蛋及其制品, 大豆及其制品 (发酵大豆类制品除外 )等。对这类样品, 用索氏提取法测定时, 脂蛋白、磷脂等结合态脂类不能被完全提取出来; 用酸水解法测定时, 又会使磷脂分解而损失。但在有一定水分存在下, 用极性的甲醇和非极性的氯仿混合液 (简称CM混合液 )却能有效地提取出结合态脂类。本法对高水分试样的测定更为有效, 对于干燥试样, 可先在试样中加入一定量的水, 使组织膨润, 再用CM混合液提取。 (二) 牛奶脂肪测定仪 目前, 测定牛奶中脂肪比较先进的方法是自动化仪器分析法。如丹麦福斯电器公司生产的MTM ilko (mteers tir)n om型乳脂快速测定仪。它专用于检测牛奶的脂肪含量。测定范围为0～31％, 测定速度每小时可测001~80个样 ,测定结果数字显示。 这种仪器带有配套的稀释剂, 稀释剂是由 ATDE(乙二胺四乙酸二钠)、氢氧化钠、表面活性剂和消泡剂组成。它是利用比浊分析测定脂肪含量, 其原理如下：用螯合剂破坏牛奶中悬浮的酪蛋白胶束, 使其溶解。悬浮物中只有脂肪球, 用均质机将脂肪球大小调整均匀 2(μm以下 ,)再经稀释达到能够应用朗伯－比尔定律测定的浓度范围, 因而可以和通常的光吸收分析一样测定脂肪的浓度。 另一类是牛乳成分综合分析仪, 它是利用红外线分光分析法, 同时测定牛乳中的脂肪、蛋白质、乳糖及固体成分 (或水分 ,)各种成分的归属波长 (及官能团 )分别是： 脂肪为2735.μ m(脂肪酯键中的羰基)、蛋白质为μ m(蛋白质的肽键)、乳糖为1609.μ m(乳糖中的羟基)。根据与标准重量法的关系 ,经过实验得到的系数 ,加上由红外线法求得的脂肪、蛋白质、乳糖的含量, 即为总固体成分量。 11
从丹麦进口的MS4C10型乳成分综合测定仪, 就是利用红外线分光分析法, 同时测定牛奶中脂肪、蛋白质、乳糖和水分的含量, 自动进样后, 经分析自动打印出测定结果。 另一种MSC133型乳成分综合测定仪, 功能与MSC104型类似, 可测定乳中的脂肪、蛋白质、乳糖、无脂干物质和总干物质, 每小时可测125个样品。这种仪器的最大优点是采用了微型计算机控制, 零点给定及校准等繁琐的工作都由仪器自动完成。仪器带有一个可容纳四行字的显示屏,显示值可打印到记录纸上。仪器还配有八个供测定不同乳制品所用的“频道” ,每个频道可任意地对应于一种乳制品。因此 ,331CSM型测定仪可为使用者提供极大的方便。 第三节 食用油脂几项理化特性的测定 一、酸价的测定 (一) 概 述 酸价是指中和l g油脂中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。酸价是反映油脂酸败的主要指标，测定油脂酸价可以评定油脂品质的好坏和储藏方法是否恰当, 并能为油脂碱炼工艺提供需要的加碱量。我国食用植物油都有国家标准的酸价规定。 (二) 方法原理 用中性乙醇和乙醚混合溶剂溶解油样, 然后用碱标准溶液滴定其中的游离脂肪酸, 根据油样质量和消耗碱液的量计算出油脂酸价。 (三) 测定方法 称取混匀试样53 ~ g注入锥形瓶中, 加入混合溶剂50 L, m摇动使试样溶解, 再加三滴酚酞指示剂, 用0 .lol/Lm碱液滴定至出现微红色, 在30s内不消失, 记下消耗的碱液毫升数)V(。 (四) 结果计算 V× c × 16 .5油脂酸价 ＝ m式中 Ⅴ─ 滴定消耗的氢氧化钾溶液体积 ，Lm； c ─ HOK溶液浓度 ，ol/mL； m─ 试样质量 ，g； 516 .─ HOK的摩尔质量 ，olg/m。 (五) 说 明 l. 当样液颜色较深时, 可减少试样用量, 或适当增加混合溶剂的用量, 仍用酚酞为指示剂,也可以采用碱性蓝6B、麝香草酚酞等指示剂。 2. 测定蓖麻油的酸价时, 只用中性乙醇, 不用混合溶剂, 因为蓖麻油不溶于乙醚。 二、碘价的测定 (一) 概 述 碘价 (亦称碘值 )即是g001油脂所吸收的氯化碘或溴化碘换算为碘的克数。 油脂中含有的不饱和脂肪酸能在双键处与卤素起加成反应。碘价越高，说明油脂中脂肪 12
酸的双键愈多，愈不饱和，不稳定，容易氧化和分解。因此，碘价的大小在一定范围内反映了油脂的不饱和程度。测定碘价, 可以了解油脂脂肪酸的组成是否正常, 有无掺杂等。 测定碘价时, 常不用游离的卤素而是用它的化合物 (氯化碘、溴化碘、次碘酸等 )作为试剂。在一定的反应条件下, 能迅速地定量饱和双键, 而不发生取代反应。最常用的是氯化碘－乙酸溶液法 (韦氏法)。 (二) 测定原理 在溶剂中溶解试样并加入ijsW试剂 (韦氏碘液 ,)氯化碘则与油脂中的不饱和脂肪酸发生加成反应: 3HC……CH＝CH…… HOOC十 ICl ＝3HC……HC－CH…… HOOC I l C再加入过量的碘化钾与剩余的氯化碘作用, 以析出碘: IK十ICl ＝ lCK十I 2析出的碘用硫代硫酸钠标准溶液进行滴定: I十2 aNSO ＝ aNSO十2 aIN 2223246同时做空白试验进行对照, 从而计算试样加成的氯化碘 (以碘计 )的量, 求出碘价。 (三) 测定方法 (参照T53B/52G一5 8)试样的质量根据估计的碘价而异 (碘价高，油样少；碘价低，油样多 ,)一般在左右。将称好的试样放入050 Lm锥形瓶中, 加入02 Lm溶剂 (环己烷和冰乙酸等体积混合液) 溶解试样, 准确加入试剂, 盖好塞子 ,摇匀后放于暗处i3n0m以上 (碘价低于105的样品 ,应放l ; h碘价高于105的样品, 应放2h)。 反应时间结束后, 加入L02m碘化钾溶液和L105m水。用aNSO标准溶液滴定至浅黄223色, 加几滴淀粉指示剂继续滴定至剧烈摇动后蓝色刚好消失。在相同条件下，同时做一空白试验。 (四) 结果计算 (V－V )× c × 16029. 21碘价 ＝ × 010 m式中：V ─ 试样用去的aNSO溶液体积 ，Lm； 1223V ─ 空白试验用去的aNSO溶液体积 ，Lm； 2223C ─ aNSO溶液的浓度 ，ol m/ L； 223 m─ 试样的质量 ，g； 092. 61─ 2 /1I的毫摩质量，g / olmm。 2 (五) 说明及注意 1. 光线和水分对氯化碘起作用, 影响很大，要求所用仪器必须清洁、干燥, 碘液试剂必须用棕色瓶盛装且放于暗处。 2. 加入碘液的速度，放置作用时间和温度要与空白试验相一致。 三、过氧化值的测定 13
(一) 概 述 过氧化物是油脂在氧化过程中的中间产物, 很容易分解产生挥发性和非挥发性脂肪酸、醛、酮等, 具有特殊的臭味和发苦的滋味, 以致影响油脂的感官性质和食用价值。 检测油脂中是否存在过氧化物, 以及含量的大小, 即可判断油脂是否新鲜和酸败的程度。 过氧化值有多种表示方法，一般用滴定１克油脂所需某种规定浓度（通常用／L）aNSO标准溶液的毫升数表示，或象碘价一样，用碘的百分数来表示，也有用每gk油脂中223活性氧的毫摩尔数表示, 或每克油脂中活性氧的微克数表示等。 (二) 测定原理 油脂在氧化过程产生的过氧化物很不稳定, 能氧化碘化钾成为游离碘, 用硫代硫酸钠标准溶液滴定, 根据析出碘量计算过氧化值。其反应为： ― HC― CH― ＋ 2IK K O＋ I＋ ― HC― CH― 22 O － O O 2I＋ aNSO aNSO ＋ 2IaN 223246(三) 测定方法 (参照T53B/58G一95 19)称取一定油样, 加入10 Lm三氯甲烷, 溶解试样 ,再加入15 Lm乙酸和l Lm饱和碘化钾溶液, 迅速盖好, 摇匀l in,m 避光静置反应5 inm。取出加水10 0L, m用／ LaNSO223标准溶液滴定，至淡黄色时加入淀粉指示剂, 继续滴定至蓝色消失为终点。同时做一空白试验。 (四) 结果计算 (V － V ) × c 10过氧化值 ( meq / kg ) ＝ × 001 m 式中： V ─ 试样用去的aNSO溶液体积 ， Lm； 1223V ─ 空白试验用去的aNSO溶液体积 ，Lm； 0223c ─ aNSO溶液的浓度 ， ol/Lm； 223 m─ 试样的质量 ，g。 若以碘的百分数表示为： V(－V ) c × 2916.／001 10过氧化值 (％ )＝ × 100 m 式中：61 .29─ 碘的摩尔质量 ， g／ol m。 (五) 说 明 l. 饱和碘化钾溶液中不可存在游离碘和碘酸盐。 2. 光线会促进空气对试剂的氧化。 3. 三氯甲烷、乙酸的比例, 加入碘化钾后静置时间的长短及加水量多少等, 对测定结果均有影响 。 4. 过氧化值表示方法为eqm／gK、olmm／gK、μg／g时，其换算系数分别为1、、 14
8。 四、皂化价的测定 (一) 概 述 皂化价是指中和lg油脂中所含全部游离脂肪酸和结合脂肪酸 (甘油酯 )所需氢氧化钾的毫克数。 皂化价的大小与油脂中甘油酯的平均相对分子质量有密切关系。甘油酯或脂肪酸的平均相对分子质量越大, 皂化价越小。若油脂内含有不皂化物、一甘油酯和二甘油酯, 将使油脂皂化价降低; 而含有游离脂肪酸将使皂化价增高。 由于各种植物油的脂肪酸组成不同, 故其皂化价也不相同。因此, 测定油脂皂化价结合其他检验项目, 可对油脂的种类和纯度等质量进行鉴定。我国植物油国家标准中皂化价有规定。 (二) 测定原理 利用油脂与过量的碱醇溶液共热皂化, 待皂化完全后, 过量的碱用盐酸标准溶液滴定 ,同时作空白试验。由所消耗碱液量计算出皂化价。皂化反应式如下： CH (OCOR)十 3 HOK＝ CH )HO( 十3 OK RCO353353(三) 测定方法 (参照T53B/54G一95 19) 称取混匀试样于锥形瓶中, 加入 ol m /L氢氧化钾乙醇溶液2050. L, m在水浴上回流加热煮沸,不时摇动 ,维持沸腾l h (难于皂化的需2 h) 后取下，加入酚酞指示剂 L, m趁热用盐酸标准溶液滴定至红色消失。同时进行空白试验。 (四) 结果计算 V(－V )× c × 皂化价＝ m 式中：V ─ 滴定试样用去的盐酸溶液体积，Lm； 1V ─ 滴定空白用去的盐酸溶液体积，Lm； 0C ─ lCH溶液的浓度，ol/mL； m─试样质量，g； 1516.─ HOK的摩尔质量，g / olm。 (五) 说 明 1. 用HOK乙醇溶液不仅能溶解油脂，而且也能防止生成的肥皂水解。 2. 皂化后剩余的碱用盐酸中和，不能用硫酸滴定，因为生成的硫酸钾不溶于酒精，易生成沉定而影响结果。 3. 若油脂颜色较深，可用碱性蓝6B酒精溶液作指示剂，这样容易观察终点。 五、羰基价的测定 (一) 概 述 油脂氧化所生成的过氧化物，进一步分解为含羰基的化合物。一般油脂随贮藏时间的延长和不良条件的影响, 其羰基价的数值都呈不断增高的趋势, 它和油脂的酸败劣变紧密相关。因为多数羰基化合物都具有挥发性，且其气味最接近于油脂自动氧化的酸败臭, 因此, 用羰基价来评价油脂中氧化产物的含量和酸败劣变的程度, 具有较好的灵敏度和准确性。目前, 我国已把羰基价列为油脂的一项食品卫生检测项目。大多数国家都采用羰基价作为评价油脂氧化 15
酸败的一项指标。 羰基价的测定可分为油脂总羰基价和挥发性或游离羰基分离定量两种情况。后者可采用蒸馏法或柱色谱法。下面介绍总羰基价的测定原理和方法。 (二) 总羰基价的测定 1. 测定原理 油脂中的羰基化合物和4,2－二硝基苯肼反应生成腙, 在碱性条件下生成醌离子, 呈葡萄酒红色, 在波长404 nm处具有最大的吸收，可计算出油样中的总羰基值。其反应式如下: 2.测定方法 (参照 /BTG059703.一619 9) 称取约～00. 1g样品, 置于 25Lm具塞试管中, 加入5 Lm三苯膦溶液 (三苯膦还原氢过氧化物为非羰基化合物)溶解样品, 室温暗处放置 30in, m再加 3Lm三氯乙酸溶液及5 Lm2,4－二硝基苯肼溶液, 振摇混匀。 在60℃水浴中加热30 in, m冷却后, 沿试管壁慢慢加入10 Lm氢氧化钾乙醇溶液, 使成为二液层, 塞好, 剧烈振摇混匀, 放置01 inm。以l mc比色杯, 用不含三苯膦的试剂空白 (以5 Lm精制苯代替三苯膦溶液 )调节零点, 用含三苯膦还原剂的试剂空白吸收作校正, 于波长404 nm处测定吸光度。 3. 结果计算 A × V羰基价＝ × 010 48 5× m× V 1式中： 羰基价 ─ 每l gk样品中各种醛的物质的量，ol/mkgm； A─ 测定时样液吸光度； m─ 样品的质量，g； V ─ 测定用样品稀释液的体积，Lm； 1 V─ 样品稀释后的总体积，Lm； 845 ─ 各种醛的毫摩尔数的平均值。 4. 注意事项 )l(所用仪器必须洁净、干燥。 (2) 所用试剂若含有干扰试验的物质时, 必须精制后才能用于试验。 (3) 空白试验的吸收值 (在波长44n0m处, 以水作对照 )超过时, 试验所用试剂的纯 16
度不够理想。 思考题： 1. 脂类测定最常用哪些提取剂？各有什么优缺点？ 2. 理解索氏提取法测定脂肪的原理、方法，测定时应注意的事项。 3. 掌握巴布科克氏法测定牛奶脂肪的原理和方法。为什么乳脂瓶脂肪 所占的格数即表示牛奶含脂率？ 4. 了解罗紫－哥特里法、酸水解法测定脂肪的原理和方法。 5. 理解和掌握食用油脂特性（酸价、碘价、氧化值、过氧化值、皂化值、羰基价）的定义及其测定原理。 （陈惠音） 17
第九章 糖类物质的测定 第一节 概述 一、糖类物质的定义和分类 糖类物质是由碳、氢、氧三种元素组成的—大类化合物。在这一类物质中氢与氧的比例数和水一样，因此常被称为碳水化合物。人体生命活动的热能60%～07％由它供给。它是世界上大部分人从膳食中取得热能最经济和最主要的来源，也是构成机体的重要物质，参与细胞的多种代谢过程。核糖与脱氧核糖是核酸的重要组成部分，一些糖可与蛋白质合成糖蛋白，还可与脂肪形成糖脂等，这些都是重要的生理功能物质，参与机体的代谢，维持生命活动。 糖类物质是食品工业的主要原料和辅助材料，是大多数食品的主要成分之一。它包括单糖，低聚糖和多糖。单糖是糖的最基本组成单位，低聚糖和多糖是由单糖组成的。食品中主要的单糖有葡萄糖、果糖和半乳糖，它们都是含有六个碳原子的多羟基醛或多羟基酮，分别称为己醛糖（葡萄糖、半乳糖）和己酮糖（果糖），此外还有核糖、阿拉伯糖、木糖等戊醛糖。低聚糖（又称为寡糖）是由二到十个分子的单糖通过糖苷键连接形成的直链或支链的一类糖，包括普通低聚糖和功能性低聚糖两大类。蔗糖、乳糖和麦芽低聚糖等属于普通低聚糖。功能性低聚糖包括异麦芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等，它们是保持和增进健康的重要配料。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，按其化学组成不同可分为同多糖和杂多糖。前者是由同一单糖构成的，如淀粉、纤维素等。后者是由不同单糖分子和糖醛酸分子组成，如果胶分子中含有乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等，黄原胶是由葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸构成。在这些糖类物质中，人体能消化利用的是单糖，普通低聚糖和多糖中的淀粉，称为有效碳水化合物；纤维素、半纤维素、果胶等由于不能被人体消化利用，称为无效碳水化合物。这些无效碳水化合物能促进肠道蠕动，改善消化系统机能，对维持人体健康有重要作用，是人们膳食中不可缺少的成分。 二、食品中糖类物质的分布与含量 糖类物质在自然界中分布很广，在各种食品中存在的形式和含量不同。葡萄糖和果糖等单糖主要存在于水果和蔬菜中，一般含量分别为%～28%5.和%～563.%；无子葡萄干和蜂蜜中单糖含量约为70%和75%。蔗糖普遍存在于具有光合作用的植物中，一般含量较低，但甘蔗和甜菜含量较高，分别为1%0～15%和51%～20%，为工业制糖的原料；西瓜、菠萝约为4%和8%。蔗糖是食品工业中最重要的甜味物，被应用于各种加工食品中。乳糖存在于哺乳动物的乳汁中，牛乳中乳糖含量约为%。麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖在自然界并不存在，通常由淀粉水解或转苷产生的。低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖等在自然界含量较少，大多通过酶法合成后，作为功能性成分加入到食品中。淀粉广泛存在于农作物的籽粒（如小麦、玉米、大米、大豆）、根（如甘薯、木薯）和块茎中（马铃薯）；含量高的约达干物质的8%0。纤维素主要存在于谷类的麸糠和果蔬的表皮中；果胶物质存在于果蔬类植物的组织中，尤其在表皮中含量较高。 三、食品中糖类物质测定的意义 食品中糖类物质的测定，在食品工业中具有十分重要的意义。在食品加工工艺中，糖类对改变食品的形态、组织结构、物化性质以及色、香、味等感官指标起着十分重要的作用。如食品加工中常需要控制一定量的糖酸比；糖果中糖的组成及比例直接关系到其风味和质量；糖的焦糖化作用及羰氨反应既可使食品获得诱人的色泽和风味，又能引起食品的褐变，必需根据工艺需要加以控制。食品中糖类含量也在一定程度上标志着营养价值的高低，是某些食品的主要质量指标。糖类的测定历来是食品的主要分析项目之一。 四、食品中糖类物质的测定方法 测定食品中糖类物质的方法很多，可分为直接法和间接法两大类，直接法是根据糖的一些理化性质作为分析原理进行的各种分析方法，包括物理法、化学分析法、酶法、色谱法、电泳法、生物传感器及各种仪器分析法。间接法是根据测定的水分、粗脂肪、粗蛋白质、灰分等含量，利用差减法计算出来，常以总碳水化合物或无氮抽提物来表示。虽然间接法可测定食品中糖类化合物的总量，但采用直接法分别测定食品中各种糖的含量显得十分重要。 物理法包括相对密度法、折光法、旋光法和重量法等。可用于测定糖液浓度，糖品的蔗糖分，谷物中淀粉及粗纤维含量等。化学分析法是应用最广泛的常规分析方法，包括直接滴定法、高锰酸钾法、铁氰化钾法、碘量法、蒽酮法等。食品中还原糖、蔗糖、总糖、淀粉和果胶物质等的测定多采用化学分析法，但
所测得的多是糖类物质的总量，不能确定混合糖的组分及其每种糖的含量。利用纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法和糖离子色谱法等可以对混合糖中各种糖分进行分离和定量，其中薄层色谱法和高效液相色谱法已被确定为异麦芽低聚糖测定的国家标准方法。用酶分析法测定糖类也有一定的应用，如用酶-电极法和酶-比色法测定葡萄糖、半乳糖、乳糖和蔗糖含量，用酶水解法测定淀粉含量等。电泳法可对食品中各种可溶性糖分进行分离和定量，如葡萄糖、果糖、乳糖、棉子糖等常用纸上电泳法和薄层电泳法进行检验。近年来毛细管电泳法在一些低聚糖和活性多糖方面的测定越来越广泛，但尚未作为常规分析方法。生物传感器简单、快速、可实现在线分析，如用葡萄糖生物传感器可在线检测混合样品中葡萄糖的含量，是一种具有很大潜力的检测方法。 本章将分别介绍各种糖类物质的测定方法，重点介绍国内外的标准分析方法，同时适当介绍一些有影响的参考方法。 第二节 可溶性糖类的测定 一、可溶性糖类的提取和澄清 食品中的可溶性糖通常是指葡萄糖、果糖等游离单糖及蔗糖等低聚糖。测定可溶性糖时，—般须选择适当的溶剂提取样品，并对提取液进行纯化，排除干扰物质，然后才能测定。 （一）提取 1.常用的提取剂 糖类可用水作提取剂，温度一般控制在40～50℃，提取效果好。若温度更高时，可提取出相当量的可溶性淀粉和糊精。水提取液中，除了糖类外，还可能含有色素、蛋白质、可溶性果胶、可溶性淀粉、有机酸等干扰物质，特别是乳与乳制品、水果及其制品、大豆及其制品中干扰成分较多。水果及其制品中含有许多有机酸，为防止蔗糖等低聚糖在加热时被部分水解，提取液应调为中性。 乙醇水溶液也是常见的糖类提取剂，糖类在乙醇水溶液中具有一定溶解度，当提取液中的乙醇浓度足够高时，蛋白质、淀粉和糊精等都不能溶解，通常用的是07%～57%的乙醇溶液。若样品含水量较高，混合后乙醇的最终浓度应控制在上述范围内。用乙醇溶液作提取剂时，提取液不用除蛋白质，因为蛋白质不会溶解出来。 2.提取液制备的原则 提取液的制备方法要根据样品的性状而定，但应遵循以下原则： （1）确定合适的取样量和稀释倍数。 确定取样量和稀释倍数，要考虑所采用的分析方法的检测范围。一般提取液经净化和可能的转化后，每毫升含糖量应在～之间，提取1g0含糖2％的样品可在L100m容量瓶中进行；而对于含糖较高的食品，可取5～g01样品于L205m容量瓶中进行提取。 （2）含脂肪的食品需经脱脂后再进行提取。 对于乳酪、巧克力、蛋黄酱及蛋白杏仁糖等含脂肪的食品，一般以石油醚进行脱脂处理一次或几次，每次处理后，倾去石油醚层（如分层不好，可以进行离心分离），然后用水提取。 （3）含有大量淀粉和糊精的食品，宜采用乙醇溶液提取。 对粮谷制品、某些蔬菜及调味品等，用水提取会使部分淀粉、糊精溶出，影响测定，同时过滤也困难，为此，宜采用乙醇溶液提取。提取时可加热回流，然后冷却并离心，倾出上清液，如此提取2～3次，合并提取液，蒸发除去乙醇。 （4）含酒精和二氧化碳等挥发组分的液体样品，应在水浴上加热除去。加热时应保持溶液呈中性，以免造成低聚糖的水解及其单糖的分解。 （二）提取液的澄清 上面得到的提取液中，除含有单糖和低聚糖等可溶性糖类外，还不同程度地含有—些影响测定的杂质，如色素、蛋白质、可溶性果胶、可溶性淀粉、有机酸、氨基酸、单宁等。这些物质的存在常会使提取液带有颜色，或呈现浑浊，影响测定终点的观察；也可能在测定过程中与被测成分或分析试剂发生化学反应，影响分析结果的准确性；胶态杂质的存在还会给过滤操作带来困难，因此必须把这些干扰物质除去。常用的方法是加入澄清剂沉淀这些干扰物质。
1.糖类澄清剂的要求 能作为糖类澄清剂的物质，必须满足以下几个条件： （1）能较完全地除去干扰物质； （2）不吸附或沉淀被测糖分，也不改变被测糖分的理化性质； （3）过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，或易于除掉。 2.常用的澄清剂 澄清剂的种类很多，在糖类分析中较常用的有以下几种： （1）中性醋酸铅[bP（CHOOC）·H3 ]O 这是最常用的一种澄清剂。铅离子能与很多离子结合，322生成难溶沉淀物，同时吸附除去部分杂质。它能除去蛋白质、果胶、有机酸、单宁等杂质。它的作用较可靠，不会沉淀样液中的还原糖，在室温下也不会形成铅糖化合物，因而适用于测定还原糖样液的澄清。但它的脱色能力较差，不能用于深色样液的澄清，适用于浅色的糖及糖浆制品、果蔬制品、焙烤制品等。铅盐有毒，使用时应注意。 （2）乙酸锌和亚铁氰化钾溶液 它是利用乙酸锌n[Z（HCOOC）·2H]O与亚铁氰化钾反应生成的322氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质。这种澄清剂除蛋白质能力强，但脱色能力差，适用于色泽较浅，蛋白质含量较高的样液的澄清，如乳制品、豆制品等。 （3）硫酸铜和氢氧化钠溶液 这种澄清剂是由五份硫酸铜溶液（·5HO溶于1L水中）242和两份ol1m／L氢氧化钠溶液组成。在碱性条件下，铜离子可使蛋白质沉淀，适合于富含蛋白质的样品的澄清。 （4）碱性醋酸铅 能除去蛋白质、有机酸、单宁等杂质，又能凝聚胶体。但它可生成体积较大的沉淀，可带走糖，特别是果糖。过量的碱性醋酸铅可因其碱度及铅糖的形成而改变糖类的旋光度。此澄清剂用以处理深色糖液。 （5）氢氧化铝溶液（铝乳） 氢氧化铝能凝聚胶体，但对非胶态杂质的澄清效果不好。可用作浅色糖溶液的澄清，或作为附加澄清剂。 （6）活性炭 能除去植物样品中的色素，适用于颜色较深的提取液，但能吸附糖类造成糖的损失，特别是蔗糖损失达6%～8%，限制了它在糖类分析上的应用。 除上述澄清剂外，还有硅藻土、六甲基二硅烷等也可作为澄清剂。澄清剂的种类很多，各种澄清剂性质不同，澄清效果也各不一样，使用澄清剂时应根据样液的种类、干扰成分及含量加以选择，同时还必须考虑到所采用的分析方法。如用直接滴定法测定还原糖时，不能用硫酸铜-氢氧化钠溶液澄清样品，以免样2+液中引入Cu；用高锰酸钾滴定法测定还原糖时，不能用醋酸锌-亚铁氰化钾溶液澄清样液，以免样液中2+引入eF。 3.澄清剂的用量 澄清剂的用量必须适当。用量太少，达不到澄清的目的，用量太多则会使分析结果产生误差。甚至中性醋酸铅之类安全的澄清剂，用量也不能过大。因为当样品试液在测定过程中进行加热时，铅将与糖（特别是果糖）结合生成铅糖化合物，使测得的糖含量虚假地降低。因此，要使误差为最小，必须使用最少量的澄清剂。或者加入除铅剂避免铅糖化合物生成。常用的除铅剂有草酸钠、草酸钾、硫酸钠、磷酸氢二钠等。使用时可以以固体状态加入（如固体草酸钠）．也可以以液体状态加入（如10％aNOS或10％aNOPH2424溶液）。但应注意，如用固体除铅剂，应先将样液定量到一定体积后再加入；如用液体除铅剂，应在加入除铅剂后再定容。除铅剂的用量也要适当。在保证使铅完全沉淀的前提下。使用量尽量减少。 不同的样液因干扰物质的种类和含量不同，所需加入澄清剂的量也不同。如用中性醋酸铅作为澄清剂时，一般先向样液中加入1～L3m醋酸铅饱和溶液（约30％），充分混合后静置in1m5，向上层清液中加入几滴中性醋酸铅溶液，上层清液中如无新的沉淀形成，说明杂质已沉淀完全，如有新的沉淀形成，就再加入几滴，混匀并静置几分钟，如此重复直至无沉淀形成为止。也可以用20％或10％中性醋酸铅溶液。用乙酸锌-亚铁氰化钾溶液作澄清剂时，用量一般是50～L75m样液加入乙酸锌溶液（n92(g1CZH)OOC·2HO／L）和亚铁氰化钾溶液（.160％）各L5m。用硫酸铜-氢氧化钠溶液作为澄清222剂时，一般在50～L75m样液中加入L1m0硫酸铜溶液（·5HO/L）和L4m氢氧化钠溶液（ol1m242／L）。 二、还原糖的测定
还原糖是指具有还原性的糖类。在糖类中，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离的半缩醛羟基的双糖都具有还原性。葡萄糖分子中含有游离醛基；果糖分子中含有一个游离酮基；乳糖和麦芽糖分子中含有半缩醛羟基，故它们都是还原糖。其他双糖（如蔗糖）、三糖乃至多糖（如糊精、淀粉等），其本身不具还原性，属于非还原性糖，但都可以通过水解而生成相应的还原性单糖，测定水解液的还原糖含量就可以求得样品中相应糖类的含量。因此，还原糖的测定是糖类定量的基础。 还原糖的测定方法很多，其中最常用的有碱性铜盐法、铁氰化钾法、碘量法、比色法及酶法等。兹分别介绍如下。 （一）碱性铜盐法 碱性酒石酸铜溶液是由碱性酒石酸铜甲、乙液组成。甲液为硫酸铜溶液，乙液为酒石酸钾钠等配成的＋2+溶液。在加热条件下，还原糖能将碱性酒石酸铜溶液中Cu→Cu→CuO↓。根据此反应过程中定量方法2不同，碱性铜盐法分为直接滴定法、高锰酸钾法、萨氏法及兰-爱农法等。 1.直接滴定法 （1）原理 将—定量的碱性酒石酸铜甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀，这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。反应如下： HO OH—CH— aNOOC O—HC—aNOOC Cu + Cu 2H+ O2 HO OH—CH— KOOC O—HC— KOOC酒石酸钾钠铜具有氧化性，在加热条件下，能将还原糖氧化成醛酸，本身还原为氧化亚铜沉淀。 KOOC KOOC OHC OHC HOOC HOHC)HOHC(+6 uC＋6H O )HOHC( +6 C+u3O↓+HCO 4 2 3223CH HO OCH CH HO HOHC22 aNOOC aNOOC反应终点用次甲基蓝指示，次甲基蓝是一种氧化还原指示剂，其氧化型为蓝色，还原型为无色，它的+2氧化能力比Cu弱，待还原糖将二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖则可把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。 HNNHCHHCCHHC3333NNSNNSClClCHCHCHCH3333 （ 蓝色氧化态） （ 无色还原态） ＋2+从上述反应式可知，ol1m葡萄糖可以将ol 6mCu还原为Cu。实际上两者之间的反应并非那么简单。＋2实验结果表明，ol1m葡萄糖只能还原ol 5m多点的Cu，且随反应条件而变化。也就是说，还原糖在碱性溶液中与硫酸铜的反应并不符合等摩尔关系。实际上，还原糖在此反应条件下将形成某些差向异构体的平衡体系，如-D葡萄糖向-D甘露糖、D-果糖转化，构成三种物质的平衡混合物，及一些烯醇式中间体，如1，2-烯二醇、2，3-烯二醇、3，4-烯二醇等。这些中间体可进一步促进葡萄糖的异构化，同时可进一步降解形成多种活性降解物，从而构成整个反应的平衡体系。其构成的组分及含量，与实验条件有关，如试剂碱度、热源强度、加热时间、滴定速度等。因此，不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量。而是用已知浓度的还原糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液，计算还原糖因数。计算公式如下： F＝c×V 式中：F——L10m碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各L5m）相当于葡萄糖的质量，gm； c——葡萄糖标准溶液的浓度，g/ mLm；
V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的体积，Lm。 再利用下面公式计算样品中还原糖的含量。 F 还原糖（以葡萄糖计，gg0/01）=×100 Vm××1000250式中：F——L10m碱性酒石酸铜溶液（甲、乙液各L5m）相当于葡萄糖的质量，gm； m——样品质量（或体积），g（Lm）； V——测定时平均消耗样品溶液体积，Lm； 205一—样品液总体积，Lm。 （2）适用范围及特点 本法又称快速法，是国家标准分析方法（/中第二法），它是在兰-爱农容量法基础上发展起来的，其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显，准确度高，重现性好。适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点模糊不清，影响准确性。 （3）说明与讨论 ①本法所用的碱性酒石酸铜溶液配制方法不同于兰-爱农容量法和高锰酸钾滴定法，方法如下： 甲液 称取g0501.硫酸铜（CuSO·H5O）及次甲基蓝，溶于水中并稀释至L10m0。 42乙液 称取g005.酒石酸钾钠及7g5氢氧化钠，溶于水中，再加入 g4亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至L0100m，贮存于具橡胶塞玻璃瓶中。 ②碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 ③为消除氧化亚铜沉淀对滴定终点观察的干扰，在碱性酒石酸铜乙液中加入了少量亚铁氰化钾，使之与CuO生成可溶性的络合物，而不再析出红色沉淀，消除沉淀对观察滴定终点的干扰，使终点更为明显。2其反应如下： CuO↓+KeF（CN）+HOΔKCueF（CN） H2+OK2462226＋2④本法以测定过程中的Cu量为计算依据，因此，在样品处理时，不能用硫酸铜和氢氧化钠溶液作为＋2澄清剂，以免引入Cu。 ＋2⑤滴定必须在沸腾条件下进行，其原因一是可以加快还原糖与Cu的反应速度；二是次甲基蓝变色反应是可逆的。还原型次甲基蓝遇空气中氧时，又会被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入。避免次甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加耗糖量。 ⑥本法对滴定操作条件要求很严，整个滴定工作须控制在3 inm内完成，其中in2m内加热至沸，然后以每2秒1滴的速度滴定至终点。标准溶液的标定、样品溶液预测及测定的操作条件应保持一致。对每一次滴定被测溶液的使用量，锥形瓶规格，加热电炉功率，滴定速度，预加入大致体积，终点的确定方法等都尽量一致。并将滴定所需体积的绝大部分先加入碱性酒石酸铜溶液中共沸，使其充分反应，仅留1Lm左右进行滴定，并判断终点，以减少因滴定操作带来的误差，提高测定精度。另外，滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 ⑦样品溶液必须进行预测。原因是本法对样品溶液中还原糖浓度有—定要求（10.％左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在L10m左右；另外通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少L1m左右的样液，只留下Lml左右样液在续滴定时加入，以保证在规定时间内完成续滴定工作，提高测定的准确度。 ⑧为了提高测定的准确度，要求用那种还原糖表示结果就用相应的还原糖标定碱性酒石酸铜溶液，如用葡萄糖表示结果就用葡萄糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液。 ⑨还原糖与碱性铜盐的反应，一般书刊上常写成：
KOOC KOOC OHC OHC HOOC HOHC )HOHC(+2 uC＋2H O )HOCH( +2 Cu+ O4 242CH HO OCH CH HO HOHC22 aNOOC aNOOC KOOC KOOC OHC OHC HOOC HOHC或)HOHC(+6 uC＋5H O )HOCH( +6 u3C+ O4 242CH HO OCH CH HO HOHC22 aNOOC aNOOC 上述第一式表明葡萄糖在此反应中的电子转移数为2，被氧化为葡萄糖酸；第二式表明葡萄糖的电子转移数为6，被氧化为葡萄糖二酸。两式都没表明葡萄糖有脱羧基的降解反应。试验研究表明，还原糖的电子转移数接近于6，同时，碱性酒石酸铜溶液是中等强度氧化剂，在此实验条件下，不易将葡萄糖氧化为葡－2萄糖二酸，实测结果也证明了反应后的溶液中确有相当量的CO存在。因此，还原糖与碱性酒石酸铜溶3液的反应应以本书所写示意式为合理。 2.高锰酸钾滴定法 （1）原理 将一定量的样液与一定量过量的碱性酒石酸铜溶液反应，在加热条件下，还原糖把二价铜盐还原为氧化亚铜。反应式同直接滴定法。 经抽气过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁溶液，氧化亚铜被氧化为铜盐而溶解，硫酸铁被还原为亚铁盐。 用高锰酸钾标准溶液滴定生成的亚铁盐。 根据滴定时高锰酸钾标准溶液消耗量，计算氧化亚铜含量。计算公式如下： X=c×(V−V)×××1000 1021000式中：X——样品中还原糖质量相当于氧化亚铜的质量，gm； 1c——高锰酸钾标准溶液的浓度， ol/Lm； V——测定用样品液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，Lm； V——试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，Lm； 0 40138.——氧化亚铜的摩尔质量，ogl/m。 再从《相当于氧化亚铜质量时葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖的质量表》中查出与氧化亚铜相当的还原糖量（见附表10），即可计算出样品中还原糖含量。计算公式如下： AX=×100 2V1m××1000250式中：X——样品中还原糖的含量，％； 2 A——由X查表得出的氧化亚铜相当的还原糖质量，gm； 1 m——样品质量（体积），g（Lm）； V——测定用样品溶液的体积，Lm； l205——样品处理后的总体积，Lm。
（2）适用范围及特点 本法又称贝尔德蓝（Bertrand）法，是国家标准分析方法（B/GT05790.中第一法），方法的准确度和重现性都优于直接滴定法，并适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。但操作复杂、费时，需使用专用的检索表。 （3）说明与讨论 ①本法所用的碱性酒石酸铜溶液配制方法与直接滴定法不同。方法如下： 甲液 称取g34639.硫酸铜（CuSO•H5O），加适量水溶解，加硫酸，再加水稀释至L500m，42用精制石棉过滤。 乙液 称取g731酒石酸钾钠与5g0氢氧化钠，加适量水溶解，并稀释至L050m， 用精制石棉过滤，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。 +2②本法以测定过程中产生的的eF为计算依据，因此，在样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作+2为澄清剂，以免引入eF。另外，所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，+2还有过剩的Cu存在。所以，煮沸后的反应液应呈蓝色（酒石酸钾钠铜络离子）。如不呈蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度。 ③测定必须严格按规定的操作条件进行，必须控制好热源强度，保证在in4m内加热至沸，否则误差很大。实验时先取L50m蒸馏水，加碱性酒石酸铜甲、乙液各L25m，调整热源强度，使其在in4m内加热至沸，维持热源强度不变，再正式测定。另外，在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。 ④生成的氧化亚铜用铺好石棉的古氏坩埚或G垂融坩埚抽滤，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗4液不呈碱性为止。石棉精制的方法如下：取石棉先用ol/L3m盐酸浸泡2～3d，用水洗净，再加10％氢氧化钠溶液浸泡2～d3，倾去溶液，再用热碱性酒石酸铜乙液浸泡数小时，用水洗净。再以ol/L3m盐酸浸泡数小时，以水洗至不呈酸性。然后加水振摇，使成微细的浆状软纤维，用水浸泡并贮存于玻璃瓶中，即可用作填充古氏坩埚用。 ⑤还原糖与碱性酒石酸铜溶液的反应过程十分复杂，除按上述反应式进行外，还伴随有副反应。此外，不同的还原糖还原能力也不同，反应生成的CuO量也不相同。因此，不能根据生成的CuO量按反应式22直接计算出还原糖含量，而需利用经验检索表。 3.萨氏法 （1）原理 将一定量的样液与过量的碱性铜盐溶液共热，样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜。 ＋2Cu+还原糖→Cu O2氧化亚铜在酸性条件下溶解为一价铜离子，同时碘化钾被碘酸钾氧化后析出游离碘。 －+2CuH+OOS＝2CuOS++H O22442OIKH3+IK5+OS＝3KOS+3H3I+O 3242422氧化亚铜溶解于酸后，将碘还原为碘化物，而本身从一价铜被氧化为二价铜。 ＋－+22Cu+I＝u2C+2I 2剩余的碘与硫代硫酸钠标准溶液反应。 I+2NaSO＝aNSO IaN2+2223246根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量。从而计算出样品中还原糖含量。计算公式如下： (V−V)×S×f0 还原糖（%）=×100 V2m××1000V1式中 V──测定用样液消耗aNSO标准溶液体积，Lm； 223 V──空白试验消耗aNSO标准溶液体积，Lm； 0223 S──还原糖系数（Lg/m），即
f──aNSO标准溶液浓度校正系数，=f实际浓度/0500.； 223V──样液总体积，Lm； 1V──测定用样液体积，Lm； 2m──样品质量，g。 （2）适用范围及特点 该法又称ogioySm法，是一种微量法，检出量为0501.～g3m。灵敏度高，重现性好，结果准确可靠。因样液用量少，故可用于生物材料或经过层析处理后的微量样品的测定。终点清晰，有色样液不受限制。 （3）说明与讨论 ①萨氏试剂也是一种碱性铜盐溶液，主要由硫酸铜-磷酸盐-酒石酸盐组成，与碱性酒石酸铜溶液相比，萨氏试剂用aNOPH代替了部分HOaN，使试剂碱性较弱，因此不必配成甲、乙液，配成的混合溶液也可 24保存较长时间。同时还原糖的还原当量高，可提高测定的灵敏度。因此，该法可测定微量还原糖。另外，萨氏试剂中加入了大量的 aNOS，可降低反应液中的溶解氧，避免生成的CuO重新氧化。萨氏法自1393242年由iogySom提出以来，在萨氏试剂的组成上经过了多次改进，使试剂更稳定，方法更灵敏。目前形成了多种萨氏改良法，除微量法外，还有常量法。典型的萨氏试剂组成为：7ga1NOPH·12HO，4g0酒石酸242钾钠，oLl1/0Ha1LmO0Nm溶液，u8SgOC·5HO，401gaNOS·01HO，olL/1OL/I5K62mm溶液，依次422423溶解后混合在一起并加水至L100m，用微孔玻璃漏斗过虑后备用。 ②萨氏试剂碱度的降低，还原糖的氧化速度变慢，反应时间增加，会延长测定时间，因此试剂的碱度不宜过低。由于不同还原糖的还原能力及反应速度不同，反应时所需加热时间也不同。另外，萨氏试剂与碱性酒石酸铜溶液一样，同还原糖的反应也不符合等摩尔关系。利用表9－1所示的加热时间和还原糖系数进行操作和计算，可得到正确的测定结果。 表9－1 还原糖的加热时间和系数 糖的种类 加热时间（inm） 系数（g/Lm）糖的种类加热时间（inm）系数（g/Lm） 阿拉伯糖 2355~ 半乳糖3455~ 木 糖 2355~ 转化糖 1255~ 葡萄糖 1255~ 麦芽糖 2355~ 果 糖 1255~ 乳 糖 3400~ 甘露糖 2355~ ③碘化钾不加在萨氏试剂中，而在临用前再加入，可避免生成的CuO沉淀溶解，增加CuO与氧接22触的机会，使其再被氧化。 ④要严格控制操作条件，确保测定的准确度，保证空白试验，萨氏试剂的标定和样品测定在同一条件进行。空白和试样均须作平行试验，平行滴定之差不得超过。淀粉指示剂不宜加入过早，否则会形成大量淀粉吸附物，达到滴定终点时仍不褪色，造成误差。另外，滴定至蓝色消失时即为终点，此是溶液呈微绿色，而不是无色。 ⑤硫代硫酸钠极易分解，空气中的二氧化碳溶于水中生成的碳酸能与硫代硫酸钠作用生成亚硫酸氢钠和硫，空气的氧化以及微生物的作用，也可使有效成分减少，造成误差。防止措施：配制硫代硫酸钠溶液的蒸馏水在临用前煮沸，以减少水中溶解的氧气、二氧化碳和防止微生物的作用；硫代硫酸钠溶液要贮存在棕色瓶中，抑制日光对硫代硫酸钠的分解；每隔一定时间对硫代硫酸钠溶液进行重新标定。 4.蓝-爱农法 （1）原理 用样品试液滴定一定量、煮沸的碱性酒石酸铜溶液，以次甲基蓝为指示剂，达到终点时，稍微过量的样品试液将蓝色的次甲基蓝还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的鲜红色沉淀。根据试液的用量，查蓝-爱农法专用检索表（见附表7-9），求得样品中还原糖的含量。 （2）适用范围及特点 本法又称nnyo aEeL-tMhdeo，准确度高、重现性好，是一种快速简单的方法。许多国家和国际组织把该法定为测定还原糖的标准分析方法。但该法试剂、操作要求严格，终点不易判断，对于新学者不易掌握。
（3）说明与讨论 ①本法所用的碱性酒石酸铜溶液同高锰酸钾滴定法。 ②还原糖与碱性酒石酸铜溶液的反应不符合等摩尔关系，不能用化学方程式计算。 ③本法对滴定操作条件要求很严，要求滴定在沸腾条件下进行，样液必须在in2m内加热至沸，总煮沸时间在in3m内完成，其中维持沸腾inm2，然后以每2秒1滴的速度滴定至终点。实际上样液的滴加量约为L1m。为了达到上述要求，一般需对样品溶液进行预测，以便预先加入比实际用量少1Lm左右的样液，只留下Llm左右样液在续滴定时加入，以保证在规定时间内完成续滴定工作，提高测定的准确度。其他操作条件的要求同直接滴定法。 ④由于个别操作和试剂成分的变动，实测的还原糖因数可能与表中所列值不相符。宜用标准还原糖对碱性酒石酸铜溶液进行校正。校正时测定结果用那种还原糖表示，就应用那种还原糖标准溶液，校正方法同样品测定，只是用还原糖标准溶液代替样品溶液，按下面公式计算校正系数。 式中 F——碱酒石酸铜溶液浓度校正系数； C──还原糖标准溶液配制的实际浓度，gm／L10m0； G──查表所得还原糖标准溶液L100m所含毫克数。 如允许有1%的测定误差，则可省略这项校正，可直接查蓝-爱农法那种还原糖因数表。也可用还原糖标准溶液标定L10m费林氏溶液而求出还原糖因数,此法误差为50%.。 ⑤用本法测定加糖乳制品时，蔗糖的存在会使滴定时样液的消耗量减少，使测定结果偏高，故当蔗糖与乳糖的含量比超过3∶1时，应加以校正。校正方法是在滴定消耗量上加上表9－2中校正值再计算。 表9－2 乳糖、蔗糖共存时测定乳糖的校正值 L10m碱性酒石酸铜溶液试液 糖液滴定量（Lm） 蔗糖对乳糖量的比 3∶16∶1 15 20 52 60. 03 70. 53 80. 04 90. 54 905. 05 015. （二）铁氰化钾法 1.第一法（/53BT851G-） （1）原理 还原糖在碱性溶液中将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，本身被氧化为相应的糖酸。 剩余的铁氰化钾在乙酸的存在下，与过量的碘化钾作用析出碘。 析出的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定。
由于反应是可逆的，为了使反应顺向进行，用硫酸锌沉淀反应中所生成的亚铁氰化钾。 实验表明，如试样中还原糖含量多时，剩余的铁氰化钾量少，而与碘化钾作用析出的游离碘也少，因此滴定游离碘所消耗的硫代硫酸钠量也少；反之，试样中还原糖少时，滴定游离碘所消耗硫代硫酸钠则多。但还原糖量与硫代硫酸钠用量之间不符合等摩尔关系。因而不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量。而是首先按下面公式计算出氧化还原糖时所用去的铁氰化钾的量，再通过查经验表（见附表11）的方法即可查得试样中的还原糖的百分数。 (V−V)×c01V= 式中 V──氧化样品液中还原糖所需／L铁氰化钾溶液体积，Lm； V──滴定空白液消耗硫代硫酸钠溶液体积，Lm； 0V──滴定样品液消耗硫代硫酸钠溶液体积，Lm； 1c──硫代硫酸钠溶液的浓度，ol1m／L。 （2）适用范围及特点 本法的特点是滴定终点明显，准确度高，重现性好，适用于各类食品中还原糖的测定。是粮食、油料等样品中还原糖测定的国家标准分析方法，见B/G8T115935-。 （3）说明与讨论 ①本法是以铁氰化钾氧化还原糖，用硫代硫酸钠测定剩余的铁氰化钾量来计算样品中还原糖的含量。＋3因此，在样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免亚铁氰化钾氧化引入eF。可用中性醋酸铅澄清样品。另外，所用的铁氰化钾溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，还有过剩的 ＋3eF存在。 ②样品提取液与KeF（CN）溶液混合后应立即将试管放入剧烈沸腾的水浴中，并使管中液面在沸水36液面下3～m4c，准确加热i2n0m后取出，立即用水迅速冷却，否则误差很大。试管可置铁丝笼中，每次可同时作若干样品测定。 ③铁氰化钾易分解、易氧化，宜置于棕色瓶中或外边罩一个黑色纸套于一般瓶中保存。每次使用前用必须标定铁氰化钾的浓度。方法为：吸取配制好的铁氰化钾溶液L10m于L250m锥形瓶中，共3～5份。各加入10%氢氧化钠溶液、水L152m.和玻璃珠数粒。置石棉网上加热至沸，保持i 加入次甲基蓝指示剂1滴，立即用%标准的还原糖滴定之蓝色退去为止。正式滴定时，先加入比预测时约少的糖液，煮沸in1m，次甲基蓝指示剂1滴，再用糖液滴定之蓝色退去为止。按下式计算： A=c×V 式中：A——相当于L10m铁氰化钾溶液的还原糖的量，g； c——还原糖的浓度，0%.1； V——滴定时消耗还原糖的体积，Lm。 2.第二法 （1）原理 样品中的还原糖具有还原性，在碱性溶液中能将煮沸的铁氰化钾还原。根据铁氰化钾的浓度和检液滴定量可计算出样品中的还原糖的含量。还原糖与铁氰化钾的反应同第一法。 当滴定到终点时，稍微过量的还原糖能将次甲基蓝还原为无色的隐色体。反应式见还原糖测定的直接滴定法。 实验表明，还原糖量与铁氰化钾溶液的反应不符合等摩尔关系。因而不能根据上述反应式直接计算出还原糖含量。而是需要用标准的还原糖标定一定量的铁氰化钾溶液，然后根据此值和样品滴定量来计算还原糖含量。 （2）适用范围和特点 本法试剂用量少，操作简便、快速，重现性好，准确、误差小。适用于各类食品中还原糖的测定。但滴定要迅速，否则滴定终点模糊不清，影响准确性，尤其深色样品，见刘福岭、戴行钧编著，食品物理与
化学分析方法。 （3）说明与讨论 ①样品处理同铁氰化钾法第一法。 ②本法对滴定操作条件要求很严，要求在低压电炉上将铁氰化钾溶液加热至沸，准确沸腾in1m，趁沸迅速用样液滴定至蓝色消失，这样终点易判断，误差小，重现性好。另外，锥形瓶规格，加热电炉功率，滴定速度，预加入大致体积，终点的确定方法等都尽量一致。并将滴定所需体积的绝大部分先加入碱性酒石酸铜溶液中共沸，使其充分反应，仅留L50m.左右进行滴定，并判断终点，以减少因滴定操作带来的误差，提高测定精度。 ③滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 （三）碘量法 1.原理 含有游离醛基的糖（葡萄糖）和半缩醛羟基的糖（乳糖、麦芽糖），于碱性溶液中在碘的作用下，可被氧化为相应的一元酸。反应式如下： 由于加入的碘与氢氧化钠都是过量的，两者作用生成次碘酸钠残留在反应液中，当加入盐酸使反应液呈酸性时析出碘： 用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘量，可计算出糖氧化时所消耗的碘量。反应式如下： 根据上述反应方程式，可以由消耗的碘量求出醛糖的量。 在一定范围内，上述反应是完全按化学反应式来定量的，因此，可以利用化学反应式进行定量计算，而不用经验检索表。从反应式可计算出olm1m碘相当于葡萄糖g108m；麦芽糖 324gm；乳糖306 gm。 2.适用范围和特点 本法可用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖，适用于各类食品，如硬糖、异构糖、果汁等样品中葡萄糖量。详见黄伟坤等编，《食品检验与分析》，002年。 3.说明与讨论 （1）碘量法自819年创始以来，已经历了多次改良，主要在碱性试剂的选择、反应体系的碱度、反应温度等方面进行了改进。其目的：一是防止酮糖的氧化，降低共存的酮糖的影响；二是使碱性条件下醛糖与碘的反应完全按反应式进行，以便于计算。例如用弱碱性的碳酸钠代替氢氧化钠，以降低反应体系的碱度，在20℃恒温条件下进行。实验证明，在此条件下有2倍的果糖共存时，对葡萄糖的测定影响很小。因此本法常用于样品中有果糖存在时葡萄糖含量的测定。 （2）样品中含有乙醇、丙酮等成分时，因为它们也会消耗碘，影响测定，故应除去。 （3）碘量法分为常量法和微量法，主要差别在于测定时样液用量、试剂浓度及用量不同，常量法用样液量20～L52m， 样液含醛糖002.％～%；微量法用样液量L5m，检出量为520.～g1m。 （4）此法配合直接滴定法，可用于葡萄糖和果糖共存时果糖的测定。先用碘的碱性溶液把葡萄糖氧化，过量的碘用硫代硫酸钠液滴定除去，然后再用直接滴定法测定果糖的含量。 （四）其他方法 1.酚-硫酸法 （1）原理
糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物。反应式如下： 糠醛或糠醛衍生物与苯酚溶液反应，生成黄至橙色化合物，在一定范围内，吸收值与糖含量呈线性关系，因此可比色测定。 （2）适用范围及特点 此法简单、快速、灵敏、重现性好，颜色持久，对每种糖仅需制作一条标准曲线。最低检出量为10µg，误差为2％～5%。适用于各类食品中还原糖的测定，尤其是层析法分离洗涤之后的样品中糖的测定。但由于浓硫酸可水解多糖和糖苷，注意避免这方面的干扰。 （3）说明与讨论 由于不同的糖类能得到不同的的色泽，可制成对应的各类糖的标准曲线，借此测定样品中的糖。己糖及其甲基化衍生物在nm049下比色测定；戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在408nm下比色测定。 2. 3，5-二硝基水杨酸（SND）比色法 （1）原理 在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。反应式如下： 此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在50m4n波长处有最大吸收，其吸光度与还原糖含量有线性关系。 （2）适用范围及特点 此法适用于各类食品中还原糖的测定，相对误差为22.％，具有准确度高、重现性好、操作简便、快速等优点，分析结果与直接滴定法基本一致。尤其适用于大批样品的测定。 （3）说明与讨论 ①水杨酸比色法自2219年由大科利特戈弗提出后，经多次对3，5-二硝基水杨酸试剂的组成和配制比例进行改进，提高了试剂的稳定性、灵敏度和分析的准确度。目前普遍认可的配制方法是：称取56g. 3，5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入L100m容量瓶中，加入ol2/Lm氢氧化钠溶液L352m，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到L10m0。 ②若样品显酸性，可加入2%氢氧化钠溶液调至中性。 ③显色试剂不能放置过久，否则标准曲线变动。 3.半胱氨酸-咔唑法 （1）原理 单糖与强酸反应生成糠醛或其衍生物，再与显色剂半胱氨酸及咔唑缩合成有色络合物，此络合物在05n6m处有最大吸收，可以比色测定。 （2）适用范围及特点
本法是微量法，适用于葡萄糖和果糖共存时果糖的测定。显色剂半胱氨酸和咔唑可与所有糖类反应，但果糖发色程度远远超过葡萄糖，即使葡萄糖含量高于果糖1倍，对测定结果影响也不大，因蔗糖在此测定条件下会水解，增加果糖含量，故此法不能用于有蔗糖共存的样品测定。 （3）说明 样品处理液含酮糖控制在5～05µLmg/，用亚铁氰化钾和硫酸锌溶液澄清样品。测定时必须将样品处理液置于冰水浴中，缓缓加入硫酸溶液。冷却后再加入咔唑乙醇溶液，在40℃水浴中加热in3m0，冷却后测定吸光度。详见521B-86/G91T69。 4.旋光法 )ASMUCI(（1）原理 葡萄糖、果糖、麦芽糖及乳糖等还原糖分子中具有不对称碳原子，故有旋光性。用旋光仪测定旋光度，在一定的条件下，旋光度的大小与试样中这些还原糖含量呈线性关系。 （2）适用范围及特点 该法简单、快速，在制糖、食品、发酵厂和一些检验部门，常用于商品葡萄糖、果糖、麦芽糖等的测定。但被测糖溶液中常含有其它的糖和电解质等光学活性物质，将影响被测物质旋光度的大小，因此本法适合于纯度较高的糖溶液的测定。 （3）说明与讨论 ①由于葡萄糖等在溶解之后，常发生变旋作用。因此用旋光法测定这些糖时，宜放置过夜再测定。若需立即测定，可将糖液调为中性加热至沸，或加几滴氨水后再定容。 ②本法适用于浅色和低浊度的糖液测定，若糖液颜色太深或混浊度太高，不能直接测定旋光度值，需要用中性醋酸铅澄清。 ③用待测溶液将旋光管至少冲洗2次，并将溶液装满观测管，注意不使观测管内夹带空气泡。将帽盖旋紧于旋光管上，但仅须旋至防止溶液漏出的程度，过紧可能使盖玻璃变形并产生光学活性。并尽量少用手接触旋光管。 ④ASMUCI法规定旋光度的标准温度为.20℃，因此测定旋光度的待测液及仪器的温度应保持在.20±℃。 5.酶-比色法 （1）原理 葡萄糖氧化酶（DOG）在有氧条件下，催化β-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液状态）氧化，生成-D葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢，受过氧化物酶（DOP）催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。 在波长5m0n处测定醌亚胺的吸光度，可计算出食品中葡萄糖的含量。计算公式如下： C1CX=××100= VV1000×100022m×m××10000VV11式中：X──样品中葡萄糖的含量，质量百分率，％； C──标准曲线上查出的试液中葡萄糖含量，µg； m──试样的质量，g； V──试液的定容体积，Lm； 1 V──测定时吸取试液的体积，Lm。 2（2）适用范围及特点 本法属国家标准分析法(/1BT2G656981-)9，最低检出限量为µLg/m，为仲裁法。由于葡萄糖氧化酶（GDO）具有专一性，只能催化葡萄糖水溶液中β-D-葡萄糖被氧化，不受其它还原糖的干扰，因此测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。适用于各类食品中葡萄糖的测定，也适用于食品中其它组分转化
为葡萄糖的测定。 （3）说明与讨论 ①葡萄糖组合试剂盒由三瓶试剂组成。1号瓶内含ol0/.L2m磷酸盐缓冲溶液（p=H7）100 Lm，其中4-氨基安替比林为ol/mL410050.；2号瓶内含ol20/.Lm苯酚溶液100 Lm；3号瓶内含葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。1、2、3号瓶须在4℃左右保存。用时将1号瓶和2号瓶的物质充分混合均匀，再将3号瓶的物质溶解其中，使葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶完全溶解即得酶试剂溶液，此溶液须在4℃左右保存，有效期一个月。 ②试液制备时，对不含蛋白质的试样，用重蒸馏水溶解试样，过滤，弃去最初滤液，得试液；对含蛋白质的试样，先用亚铁氰化钾溶液、硫酸锌溶液和氢氧化钠溶液沉淀蛋白质等杂质，再过滤，弃去初滤液，得试液。对含二氧化碳的样品，可取一定量样品于三角瓶中，旋摇至基本无气泡，然后置沸水浴中回流处理in10m，取出冷却至室温。试液中葡萄糖含量大于300µLg/m时，应适当增加定容体积。 6.酶-电极法 （1）原理 葡萄糖氧化酶（DOG）在有氧条件下催化β－葡萄糖（葡萄糖水溶液状态）氧化，生成-D葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。 生成的过氧化氢与过氧化氢电极接触产生电流。该电流值与β-D-葡萄糖的浓度呈线性比例，在酶电极葡萄糖分析仪上直接显示葡萄糖含量。可按下面公式计算： R×VR×V1000×mX=×100= 1001000×m式中：X──样品中葡萄糖的含量，质量百分率，％； R──仪器测定值，gm／L100m； V──试液的定容体积，Lm； m──试样的质量，g。 （2）适用范围及特点 本法属国家标准分析法/1BT2G6(56981-)9，最低检出限量为gL/，为快速法。由于葡萄糖氧化酶（OGD）具有专一性，只能催化葡萄糖水溶液中βD--葡萄糖被氧化，不受其它还原糖的干扰，因此测定结果较直接滴定法和高锰酸钾法准确。适用于各类食品中葡萄糖的测定，也适用于食品中其它组分转化为葡萄糖的测定。 （3）说明与讨论 ①用葡萄糖组合试剂盒测定，组合试剂盒由葡萄糖氧化酶膜圈、复合试剂和β-D-葡萄糖标准溶液三部分组成。 ②试液制备时，对一般固体试样和固液体试样，用蒸馏水溶解试样，用快速滤纸或脱脂棉过滤。弃去初滤液，收集1～L2m滤液于带盖小试管中；对水果、蔬菜试样，加入一定量煮沸的蒸馏水和组合试剂盒中的缓冲液，并继续煮沸3～in5m，冷却至室温后用研钵研细或用组织捣碎机捣碎，用蒸馏水稀释定容，用快速过滤纸或脱脂棉过滤。弃去初滤液，收集1～L2m滤液于带盖小试管中；对食用葡萄糖试样，用蒸馏水溶解后煮沸in2m，冷却后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 ③测定时首先将电极表面清理干净，吸取由复合试剂配成的缓冲溶液滴在电极表面。用小镊子取一片酶膜圈，安装在电极表面，使酶膜圈中心和电极中心的白金完全贴紧，形成无气泡的薄层液体，然后将电极安装在反应池内。开动仪器，缓冲溶液即自动进入反应池，并自行冲洗，当仪器出现进样指令后，将标准溶液注入进样口内。20～40s后仪器自动显示标准溶液的指示值，再等03～06s，仪器自行完成冲洗过程，即可重复注入标准溶液数次，直至仪器显示允许开始测定样品。当连续两次标准溶液显示值的相对误差小于02%.时，即完成仪器校正步骤。然后准确注入试样，20～40s后读取显示值。 ④当样品中葡萄糖含量小于%时，两次测定值不得超过其平均值的%；当样品中葡萄糖含量大于或等于%01.时，两次测定值不得超过其平均值的02%.。
三、蔗糖的测定 蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，蔗糖可水解为具有还原性的葡萄糖和果糖。因此，可以用测定还原糖的方法测定蔗糖含量。对于纯度较高的蔗糖溶液，也可用相对密度法、折光法和旋光法等测定。 1.盐酸水解法 （1）原理 样品脱脂后，用水或乙醇提取，提取液经澄清处理以除去蛋白质等杂质再用盐酸进行水解，使蔗糖转化为还原糖。 然后按还原糖测定方法分别测定水解前后样品液中还原糖含量，两者差值即为由蔗糖水解产生的还原糖量，即转化糖的含量.乘以换算系数即为蔗糖含量。 根据蔗糖的水解反应，蔗糖的相对分子量为324，水解后生成2分子单糖，相对分子量之和为306，故由转化糖的含量换算成蔗糖含量时应乘以换算系数为/03264＝。计算公式如下： ①直接滴定法 式中：F──L10m酒石酸钾钠铜溶液相当于转化糖的质量，gm； V──测定时消耗未经水解的样品稀释液体积，Lm； 1V──测定时消耗经过水解的样品稀释体积，Lm； 2m──样品质量，g； ②高锰酸钾滴定法 式中：c──高锰酸钾标准溶液的浓度，ol/Lm； V──测定用经水解的样品稀释液消耗高锰酸钾标准溶液的体积，Lm； 1V──测定用经水解的样品稀释液消耗酸钾标准溶液的体积，Lm； 2V──试剂空白消耗高锰酸钾标准溶液的体积，Lm； 0x──测定未经水解的样品稀释液时，与消耗的高锰酸钾标准溶液相当的CuO量，gm； 12x──测定经水解的样品稀释液时，与消耗的高锰酸钾标准溶液相当的CuO量，gm； 22A──由x查表得出的相当于还原糖的量，gm； 11A──由x查表得出的相当于还原糖的量，gm； 22m──样品质量，g； V──测定用样品稀释液体积，Lm； （2）说明与讨论 ①本法摘自B/-蔗糖是一种呋喃果糖苷，它的水解速度远比其他双糖、低聚糖和多糖要快得多。利用此特点可测定蔗糖。本方法规定的酸水解条件为：在L5m0样液中，加ol/L6m盐酸L5m，在68～70℃水浴中加热in51m，取出于流动水下迅速冷却，立即调至中性。在此条件下，蔗糖可完全水解，而其他双糖和淀粉等的水解作用很小，可忽略不计。 ②为获得准确的结果，必须严格控制水解条件。取样液体积、酸的浓度及用量、水解温度和时间都不
能随意改动，到达规定时间后应迅速冷却，以防止低聚糖和多糖水解，果糖的分解。 ③用还原糖法测定蔗糖时，为减少误差，测得的还原糖含量应以转化糖表示。因此，选用直接滴定法时，应采用％标准转化糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液。选用高锰酸钾滴定法时，查附表4时应查转化糖项。 2.酶-比色法 （1）原理 在β-D-果糖苷酶（βSF-）催化下，蔗糖被酶解为葡萄糖和果糖。葡萄糖氧化酶（DOG）在有氧条件下，催化β-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液状态）氧化，生成-D葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。受过氧化物酶（DOP）催化，过氧化氢与4-氨基替比林和苯酚生成红色醌亚胺。 在波长5m0n处测定醌亚胺的吸光度，按下式计算食品中蔗糖的含量。 式中：X──样品中蔗糖的含量，质量百分率，％； C──标准曲线上查出的试液中蔗糖的含量，µg； m──试样的质量，g； V──试液的定容体积，Lm； 1 V──测定时吸取试液的体积，Lm。 2（2）适用范围及特点 本法属国家标准分析法（见B/GT621-869169），最低检出限量为µLm/g。适用于各类食品中蔗糖的测定。由于β-D-果糖甘酶具有专一性，只能催化蔗糖水解，不受其它糖的干扰，因此测定结果较盐酸水解法准确。 （3）说明与讨论 ①蔗糖组合试剂盒由四瓶试剂组成。1号瓶内含β-D-果糖苷酶400U，柠檬酸和柠檬酸钠；2号瓶内含ol0/.L2m磷酸盐缓冲溶液（p=H7）L010m，其中4-氨基安替比林为ol/mL410050.；3号瓶内含ol20/.Lm苯酚溶液200 Lm；4号瓶内含葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。1、2、3、4号瓶须在4℃左右保存。用时将1号瓶内的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为6 6Lm，此溶液即为β-D-果糖苷酶试剂；2号瓶和3号瓶的物质充分混合均匀，再将4号瓶的物质溶解其中，使葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶完全溶解即得葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶试剂溶液。这两种酶试剂溶液须在4℃左右保存，有效期一个月。 ②试液制备同酶-比色法测定葡萄糖。 ③测定时，必须严格按酶反应条件进行，即取一定量试液，加入L01m.β-果糖苷酶溶液，在63±1℃恒温in20m。取出后加入Lm3葡萄糖氧化酶-过氧化物酶溶液，摇匀，在36±1℃恒温in40m，冷却至室温，用重蒸馏水定容至刻度，在波长nm50处测定吸光度，查标准曲线计算样品中蔗糖含量。 四、总糖的测定 在许多食品中共存多种单糖和低聚糖。这些糖有的是来自原料，有的是生产过程中为某种目的而人为加入的，有的则是在加工过程中形成的（如蔗糖水解为葡萄糖和果糖）。对这些糖分别加以测定是比较困难的，通常也是不必要的。食品生产中通常需要测定其总量，这就提出了“总糖”的概念，总糖是指具有还原性的（葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的蔗糖的总量。 总糖是食品生产中常规分析项目。它反映的是食品中可溶性单糖和低聚糖的总量，其含量高低对产品的色、香、味、组织形态、营养价值、成本等有一定影响。总糖是麦乳精、糕点、果蔬罐头、饮料等许多
食品的重要质量指标。 总糖的测定通常是以还原糖的测定方法为基础的，常用的是直接滴定法，此外还有蒽酮比色法等。 （一）直接滴定法 1.原理 样品经处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，以直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量，再按下式计算总糖的含量。 式中：F──L10m碱性酒石酸铜溶液相当的转化糖质量，gm； V──样品处理液总体积，Lm； 1V──测定时消耗样品水解液体积，Lm； 2m──样品质量，g。 2.说明与讨论 （1）总糖测定的水解条件同蔗糖，测定时必须严格控制水解条件，使蔗糖完全水解，多糖不水解和单糖不分解。 （2）直接滴定法测定还原糖，不完全符合等摩尔关系，测定时必须严格遵守操作中有关规定，否则结果将会有较大误差。 （3）总糖测定结果一般以转化糖计，但也可以以葡萄糖计，要根据产品的质量指标要求而定。如用转化糖表示，应该用标准转化糖溶液标定碱性酒石酸铜溶液、如用葡萄糖表示，则应该用标准葡萄糖溶液标定。 （4）在营养学上，总糖是指能被人体消化，吸收利用的糖类物质的总和，包括淀粉。这里所讲的总糖不包括淀粉，因为在测定条件下，淀粉的水解作用很微弱。 （二）蒽酮比色法 1.原理 单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物。以葡萄糖为例， 反应式如下： 糖 羟甲基呋喃醛 蒽酮 蒽酚 羟甲基呋喃醛 蒽酚
蓝绿色的化合物 当糖的量在02～g020m范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。可按下式计算糖的含量。 －4总糖（以葡萄糖计，％）＝c×稀释倍数×10 式中 c──从标准曲线查得的糖浓度，µLg/m； －410──将Lg/um换算为％的系数。 2.适用范围及特点 该法是微量法，适合于含微量糖的样品，具有灵敏度高、试剂用量少等优点。 3.说明与讨论 ①该法按操作的不同可分为几种，主要差别在于蒽酮试剂中硫酸的浓度（66％～95％）、取样液量（1～L5m）、蒽酮试剂用量（5～L20m）、沸水浴中反应时间（6～in15m）和显色时间（10～in30m）。这几个操作条件之间是有联系的，不能随意改变其中任何一个，否则将影响分析结果。 ②蒽酮试剂不稳定，易被氧化，放置数天后变为褐色，故应当天配制，添加稳定剂硫脲后，在冷暗处可保存4h8。 ③反应液中硫酸的浓度高达60％以上，在此高酸度条件下，在沸水浴中加热，可使双糖、淀粉等发生水解，再与蒽酮发生显色反应。因此测定结果是样液中单糖、双糖和淀粉的总量。如要求测定结果包括淀粉，则样品处理时应采用52％高氯酸作提取剂；如要求测定不包括淀粉，应该用80％乙醇作提取，以避免淀粉和糊精溶出。此外，在测定条件下，纤维素也会与蒽酮试剂发生一定程度的反应，因此应避免样液中含有纤维素。 ④本法反应条件控制较严，如反应温度、显色时间、试剂和试液的初始温度等都将影响显色状况，操作稍不留心，就会引起误差。样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀，如样液色泽较深，可用活性炭脱色。 五、可溶性糖类的分离与定量 前面介绍的几种测定糖的方法，所测结果多是几种糖的总量，不能确定糖的组成及每组分的含量。但是，在科研和生产中，有时需要对各种糖分别进行定量，现在一般都采用色谱分析法来完成这项工作。由于食品种类繁多、组成、性状各异，具体应用这些方法时，必须根据样品的组成、性状、选择适当的色谱分离条件和样品处理方法。 （一）气相色谱法 糖类分子间引力一般较强，挥发性弱，故不能直接进行气相色谱分析。但把糖制成某种具有挥发性的衍生物，就可以用气相色谱法进行分离定量，分析中常用衍生物有：三氯硅烷（TMS）衍生物、三氟乙酰（TEA）衍生物、乙酰衍生物和甲基衍生物等。其中最常用的是前两种。 1.原理 样品经处理后，进行衍生使之生成挥发性TMS衍生物，然后注入色谱仪器，在一定色谱条件下进行分离，用火焰电离检测器检测，得出色谱图，再与标准样品的色谱图比较，根据峰的保留时间定性，根据峰面积与内标物峰面积之比，查标准曲线得出试样中糖的含量。 2.适用范围 此法适用于果汁、果酱、饼干、糕点等加工食品以及水果、蔬菜。不适用于含乳糖的乳制品。 3.色谱条件 色谱柱：3％ nocileiS1-FQCD，o brosorhcmW（WA，SOMD）60～08目。
温度：柱温，102～204 ℃；进样口、检测器温度205℃；升温速度，6℃／inm。 流速：氮气流量，L60m／inm；氢气L50m／in m；空气 1L／inm。 图9－ 1 MTS衍生物分析单糖和双糖的气相色谱图 1，2.果糖；3，5.葡萄糖；.4山梨糖醇，甘露糖醇； 6.内标物芘；7.蔗糖；8，9.麦芽糖；.10葡萄糖醇 4.说明与讨论 （1）脂肪含量高的样品，应先用正已烷脱脂。含脂肪较低的样品不必脱脂。淀粉含量较高的样品应该用80％乙醇提取， 一般样品可用水提取。 （2）TMS衍生物的制备方法是吸取 适量制备的试样溶液（总糖含量在g01m以下），放入L25m的磨口圆底烧瓶中，水溶液试样要进行冷冻干燥，乙醇溶液试样要在40℃以下减压干燥。用微量进样器吸取内标物芘的吡啶溶液（g4m0／L50m）500µL，加到干燥试样中，然后加 、，加塞，充分振荡混匀，使糖溶解，在室温上放置15～in60m，即得TMS衍生物溶液。 （3）糖类的异构体较多，进行气相色谱法分析时，各异构体被分离，得出各自的峰（见图9－1），定量时要把这些峰值加起来计算。 （二）高效液相色谱法 1.原理 样品经适当的前处理后，将糖类的水溶液注入反相化学键合相色谱体系，用乙腈和水作为流动相，糖类分子按其分子量由小到大的顺序流出，经示差折光检测器检测，与标准比较定量。按下式计算： 式中：A──由标准工作曲线查得的样液中某种糖浓度，Lg/mm； V──样液总体积，Lm； m──样品质量，g。 2.适用范围 本法广泛应用于食品中糖的测定。由于萃取与提取步骤、色谱条件和检测类型有着宽广的范围，因此，几乎所有含游离糖的样品都可以试用这种分析技术。测定不同的食品时，应根据待测糖的种类，改变流动相乙腈溶液的浓度，采取适当的样品处理方法等，提高方法的选择性、灵敏度和准确度，扩大其适用范围。操作方法可参照9/041TB20-Q。 3.色谱条件 色谱柱：µknp BdaoaarhdbCoyra te（m4m×300mm）； 流动相：乙腈+水（0+820）；流速：／inm； 进样量：20µL；温度：室温。 4.说明与讨论 （1）本方法可以在in15m内完成5种糖的分离， 精密度和准确度都很好，变异系数小于2％。 图9－ 2 乳制品中糖类的分离
（2）µtnaeobprdhBrdoa/aykC色谱柱的寿命有限，应用µpolakn/dPa orBasiB填充的保护柱可延长柱的使用寿命。此外，常用的还有氨丙烷基键合硅胶柱，如Lichrosorb-NH，国产的有-GNWHY（天津化学22试剂二厂）。 （3）也有用丙酮-乙酸乙脂-水代替毒性较大的乙腈作流动相的。 （三）离子色谱法 1.原理 糖是一种多羟基醛或酮的化合物，具有弱酸性，当pH在21～41时，会发生解离，所以能被阴离子交换树脂（CAPH）保留，用pH为12或碱性更大的氢氧化钠溶液淋洗，可实现糖的分离（见图9－3），再以脉冲安培检测器（DAP）检测，以峰保留时间定性，以峰高外标法定量。 2.适用范围及特点 本法适用于果汁、蜂蜜、牛乳及其制品、饮料、 黄酒、大豆粉等多种食品。具有灵敏度高（检测下限－9可达10gg/K级）、选择性好、操作简单、样品不必经过复杂的前处理等优点。 3.色谱条件 色谱柱：SA-6CIPH阴离子分离柱，保护柱为A-6CGIPH检测器：脉冲安培检测器，工 作参数为： E 为V020m， t s06m；E 为V060m，t s60m； 1122E 为V080m，t s204m。 33 流动相： oL/溶液； 流速：inL0/。 4.说明与讨论 图9－3 11种糖的离子色谱图 （1） 用ADP-CAPH分析糖的唯一缺点是由于1.木糖醇 2.山梨糖醇 3.鼠李糖 4.阿拉伯糖 5.葡萄糖 检测过程属于氧化检测，所以象甲醇、丙醇 6.果糖 7.乳糖 8.蔗糖 9.棉子糖 10.水苏糖 11.麦芽糖 等有机改进剂在实验过程中不能使用。 （2）流动相的脱气十分重要，流动相中的气体不仅会影响高压泵的正常运转，在DAP-CAPH分析样品时，还会影响基线稳定性。 （3）DAP金电极使用完后其表面有可能变得粗糙，影响基线稳定，此时必须对电极表面进行抛光，抛光必须严格按说明书上的技术要求进行。 （4）CAPH柱每次用后用比流动相稍浓一些的oaNH溶液冲洗，这样做能使保留值具有较好的重要性。 （四）其它方法 1.平面色谱法 （1）原理 在一张层析滤纸或一块特制的薄板上，一端滴上要分离的糖溶液，放在密闭容器内，使展开剂从有样品的一端流向另一端，由于各种糖在展开剂中的分配系数、吸附能力、亲和力等的不同，从而使样品中的各组分以不同速度移动而得到分离。再通过适当溶剂显色使分离后的各组分在滤纸或薄板的各个不同位置上显示出来。与已知糖的R值比较进行定性分析，用斑点面积定量法、薄层扫描法、或将滤纸（薄板）上f斑点剪下（刮下）等，用适当溶剂把各组分洗脱下来，再用酚-硫酸法、蒽酮法等微量法测定各组分糖的含量。 一般来说，在一定的操作条件下，每一种糖类物质都有恒定的R值，且R值从大到小依次为单糖，ff双糖，三糖，四糖，戊糖，己糖；在己糖中，酮糖，醛糖。也有例外情况，如展开剂内含有酚时，果糖移动速度就较木糖要慢些。双糖的R值中，1，4键结合的要比1，6键结合的大；αD-葡萄糖苷的双糖较βfD-葡萄糖苷的双糖大。糖的定量方法很多， （2）适用范围及特点 本法具有设备简单，试剂廉价，操作方便，所需样品量少和灵敏度较高等特点，适合于糖的组分较复
杂的食品或配料中各组分糖的测定，如蜂蜜、淀粉糖浆和低聚糖等。但展开时间较长，准确度不高，属半定量方法。操作方法可参照9/041TB20-Q。 （3）说明与讨论 ①要求所用滤纸质地均一，厚薄一致，并保持平整，否则会出现斑点畸形，溶剂前沿不齐与R值改变f等；滤纸必须具有一定机械强度、合适的松紧程度和一定纯度，以便滤纸被溶剂润湿后能站立不倒，展开速度合适，不出现“复斑”和“托尾”现象。 ②糖的薄层分析，常用硅胶G制作薄板，硅胶G是一种微酸性的极性吸附剂，表面积大，具有较强的吸附能力，吸附量大，其吸附活性与其含水量密切相关，一般含水量越大，活性越低；含水量越小，活性越高。在进行薄层分析时，要求薄层板厚薄均匀，厚度符合分析要求；表面平滑细腻，无气泡皱纹；薄层在板上粘附牢固不易脱落等特点，且在展开前须对薄板进行调活处理，使其活性适当。 ③常用的展开剂及其应用范围列于表9－3， 表9－3分离单糖和低聚糖常用的展开剂 展开剂 被分离的混合物 1.乙酸乙酯：吡啶：水＝2：1：2 木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、 2.乙酸乙脂：乙酸：水＝3：1：3 葡萄糖 3. 正丙醇：水＝85：15 低聚半乳糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖 4.正丁醇：吡啶：水＝45：25：40 乳糖、半乳糖、葡萄糖 5.正丁醇：乙酸：水＝3：3：1 异麦芽低聚糖、麦芽低聚糖、葡萄糖 6.正丁醇：乙醇：水＝10：1：2 蜜二糖、果糖、葡萄糖 7.正丁醇：乙酸：水＝4：1：5 葡萄糖、半乳糖、甘露糖等六碳糖， 阿拉伯糖、木糖等五碳糖，乳糖等二糖 8.正丁醇：吡啶：水＝6：4：3 鼠李糖、岩藻糖、半乳糖、甘露糖、 葡萄糖等 9.乙酸丁酯：乙酸：水=3：2：1 用于分离中性糖 10.异戊醇：吡啶： ol/＝2：2：1 用于分离中性糖 .1正丁醇：乙醇：水=4：1：1 用于分离戊糖 12.乙酸乙酯：吡啶：水：乙酸=5：5：3：1 用于分离中性单糖 ④常用氨-硝酸银、苯胺-二苯胺、苯胺-邻苯二甲酸、过碘酸-联苯胺等溶液作显色剂。 ⑤糖的薄层色谱法一般较纸色谱法灵敏度高，样品用量少，展开后得到的斑点小而清晰，且可用具有腐蚀性的试剂直接喷雾显色。但薄层色谱法R值的重现性不如纸色谱法。 f2.电泳法 （1）原理 电泳是指依靠带电物质在外加直流电场影响下的移动来分离混合物各组成成分的方法。一般分为自由电泳和区带电泳。自由电泳是没有支持介质的，混合物的不同组分显示在相应的运动区域内，而这些运动区域是一个一个部分重迭着，一般用作电泳速度的测定，但不能分离混合物，且使用的仪器复杂，难于操作，应用受到限制。区带电泳是利用浸透电解液的各种不同形式的支持介质如滤纸、玻璃纤维、琼脂、明胶和凝胶等来稳定电泳区域，使混合物的不同组分显示在相邻的运动区域内，而且这些运动区域是明显分开的。可用来分离混合物，测定物质的含量，且使用的仪器简单，操作方便，分辨力较好，应用广泛，糖类物质的电泳分析法即属此类。 带有电荷的糖类物质，在外加直流电场作用下，能作定向移动，其移动速度与其所带的电荷量、分子大小和形状等有关。即可将糖类物质分离出来。然后用适当的试剂显色，或用紫外、荧光方法进行定性和定量。电泳分离的速度与外加电压有关，电压越大，移动越快，分离所需时间越短。糖类物质，一般带净电荷少，导电性弱，在实验操作中常需采用较高电压。对于中性糖，必须经过适当的转化，使其变成带有电荷的衍生物，才能进行电泳分析。如利用硼酸与糖反应，糖中相邻的两个羟基与硼酸中的硼配位，失去两分子水，形成带电复合物。另外醋酸、巴比妥酸和亚砷酸等缓冲溶液也常作糖类物质的衍生剂。 2.适用范围及特点 本法具有快速、准确、重现性好、样品用量少等特点，适用于各种食品中单糖、低聚糖和多糖的测定。 3.说明与讨论， （1）在一定pH缓冲溶液中糖类物质的移动速度随其质点带电荷大小而改变，特别是两性化合物，缓
冲溶液的Hp值对物质带电荷有影响，当溶液的pH值低于等电点时，物质带正电荷，反之则带负电荷，在等电点时，其所带的正负电荷相等，此时则停留不动。因此，为了控制电泳速度，必须采用适宜的Hp缓冲溶液。 （2）缓冲溶液的离子强度的越高，电泳速度越慢，反之则越快。一般最适宜的离子强度在200.～20.。此外缓冲溶液的粘度、温度、介质的紧密程度等都影响电泳速度。 （3）现已使用滤纸、醋酸纤维素、玻璃纤维、琼脂、聚丙烯酰凝胶等分离测定了一些单糖、低聚糖和多糖。Oefner等人用高效毛细管电泳分离，紫外检测，可同时测定41种单糖和低聚糖混合物，检出限为。hMercef等人用7-氨基1-，3-二萘磺酸衍生，紫外或荧光检测，分析酸性低聚糖，检出限在oflm级。 第三节 淀粉的测定 淀粉是人类食物的重要组成部分，也是供给人体热能的主要来源，广泛存在于植物的根、茎、叶、种子等组织中。它是由葡萄糖单位构成的聚合体，聚合度为100～030。按聚合形式不同，淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由葡萄糖残基以α1-，4糖苷键连结构成的，分子呈直链状；支链淀粉是由葡萄糖残基以α1-，4苷键连结构成直链主干，而支链通过第六碳原子以β1-，6糖苷链与主链相连，形成“树枝”状支叉结构。一般淀粉均同时含有直链淀粉和支链淀粉，只是不同来源的淀粉，所含这两种淀粉的比例不同。如玉米含直链淀粉约为27%，马铃薯约为2%3，甘薯约为20%，其余部分为支链淀粉。糯玉米、糯大米和糯高粱几乎全部是支链淀粉。由于直链淀粉和支链淀粉的结构不同，性质上也有一定差异。如直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水；支链淀粉常压下不溶于水，只有在加热并加压时才能溶解于水。直链淀粉可与碘生成深蓝色络合物；而支链淀粉与碘不能形成稳定的络合物，呈现较浅的蓝紫色。 许多食品中都含有淀粉，有的是来自原料，有的是生产过程中为了改变食品的物理性状做为添加剂而加入的。如在糖果制造中做为填充剂；在雪糕、棒冰等冷饮食品中做为稳定剂；在午餐肉等肉类罐头中做为增稠剂，以增加制品的结着性和持水性；在面包、饼干、糕点生产中用来调节面筋浓度和胀润度，使面团具有适合于工艺操作的物理性质等。淀粉含量是某些食品主要的质量指标，是食品生产管理中常作的分析项目。 直链淀粉和支链淀粉都以颗粒状存在于胚乳细胞中，具有晶体结构，常称为淀粉粒。不同来源的淀粉，其淀粉粒的形状和大小各不相同，用显微镜观察可鉴别淀粉的种类。淀粉不溶于浓度在30％以上的乙醇溶液，在酸或酶的作用下可以水解，最终产物是葡萄糖。淀粉水溶液具有右旋性，比旋光度为（+）5210.º～520º。淀粉的许多测定方法都是根据淀粉的这些理化性质而建立的。常用的方法有：根据淀粉在酸或酶作用下能水解为葡萄糖，通过测定还原糖进行定量的酸水解法和酶水解法；根据淀粉具有旋光性而建立的旋光法；根据淀粉不溶于乙醇的性质而建立的重量法。现分别介绍如下。 一、酸水解法 1.原理 样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用盐酸水解淀粉为葡萄糖。水解反应为： C(HOHn+n)O═nCHO 601526126126 108 然后按还原糖测定方法测定水解所得的葡萄糖含量，再把葡萄糖含量折算为淀粉含量。换算系数为 218=/69010 .。计算公式如下： （1）高锰酸钾法 式中：A──样品水解液中还原糖含量，gm； A──空白液中还原糖含量，gm； 0 m──样品质量，g； V──样品水解液的体积，Lm；
05──样品水解液总体积，Lm； 90.──还原糖换算为淀粉的系数。 （2）直接滴定法 式中：F──L10m碱性酒石酸铜溶液相当的葡萄糖量，gm； V──滴定时样品水解液消耗量，Lm； V──滴定时空白溶液消耗量，Lm； 0 其他同上。 2.适用范围及特点 此法一步可将淀粉水解至葡萄糖，简便易行，适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时它们也被水解为木糖、阿拉伯糖等还原糖，使测定结果偏高。该法应用广泛，但选择性和准确性不及酶水解法。操作方法可参阅B/-。 3.说明与讨论 （1）本法要求对粮食、豆类、饼干和代乳粉等较干燥 、易磨细的样品磨碎、过04目筛；对蔬菜、水果、粉皮和凉粉等水分较多的样品，需按1∶1加水在组织捣碎机中捣成匀浆。再称取此处理后的样品进行分析。 （2）样品含可溶性糖类时，会使结果偏高，可用85％乙醇分数次洗涤样品以除去。脂肪会防碍乙醇溶液对可溶性糖类的提取，所以要用乙醚分数次洗去样品中的脂肪。脂肪含量较低时，可省去乙醚脱脂肪步骤。 （3）样品加入乙醇溶液后，混合液中乙醇的浓度应在80％以上，以防止糊精随可溶性糖类一起被洗掉。如要求测定结果不包括糊精，则用10％乙醇洗涤。 （4）水解条件要严格控制，要保证淀粉水解完全，并避免因加热时间过长对葡萄糖产生影响（形成糠醛聚合体，失去还原性）。对于水解时取样液量、所用酸的浓度及加入量、水解时间等条件，各方法规定有所不同。在国家标准分析方法中，样品中加入了 L30m6 ol/Lm盐酸，使混合液中盐酸的浓度达5％，要求100℃水解02h.。其它方法还有：混合液中盐酸的浓度达1％时，100℃水解h4；混合液中盐酸浓度达2％时，010℃水解52h.。因水解时间较长，应采用回流装置，以保证水解过程中盐酸的浓度不发生变化。 （5）样品水解液冷却后，应立即调至中性。可加入两滴甲基红，先用40％氢氧化钠调到黄色，再用ol6/Lm盐酸调到刚好变为红色，最后用10％氢氧化钠调到红色刚好褪去。若水解液颜色较深，可用精密pH试纸测试，使样品水解液的pH值约为7。 （6）用20％中性醋酸铅溶液，沉淀蛋白质、果胶等杂质，以澄清样品水解液。再加入10％硫酸钠溶液除去过多的铅。 二、酶水解法 1.原理 样品经除去脂肪和可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为麦芽糖和低分子糊精，再用盐酸进一步水解为葡萄糖，然后按还原糖测定法测定其还原糖含量，并折算成淀粉含量。计算公式同酸水解法。 2.适用范围及特点 利用淀粉酶水解样品，具有专一性和选择性，它只水解淀粉而不会水解半纤维素、多缩戊糖、果胶质等多糖，所以该法不受这些多糖的干扰，水解后可直接通过过滤除去这类多糖。适合于富含纤维素、半纤维素和多缩戊糖等多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，重现性好。但是酶催化活力的稳定性受pH值和温度的影响很大，而且操作繁琐、费时，使用受到了一定程度的限制。本法为B/-中的第一法。 3.说明与讨论 （1）脂肪的存在会妨碍酶对淀粉的作用及可溶性糖类的去除，故应用乙醚脱脂。若样品中脂肪含量较少，可省略此步骤。 （2）淀粉粒具有晶格结构，淀粉酶难以作用。加热糊化破坏了淀粉的晶格结构，使其易于被淀粉酶
作用。 （3）常用于液化的淀粉酶是麦芽淀粉酶，它是α-淀粉酶和β-淀粉酶的混合物。α-淀粉酶水解直链淀粉的初始产物是低分子糊精，最终产物是麦芽糖和葡萄糖；对支链淀粉的初始产物是界限糊精和低分子糊精，最终产物是麦芽糖、异麦芽糖和葡萄糖。β-淀粉酶对直链淀粉和支链淀粉的最终水解产物都是麦芽糖。所以采用麦芽淀粉酶时，水解产物主要是麦芽糖、还有少量葡萄糖和糊精。 （4）淀粉酶解过程中，淀粉粘度迅速下降，流动性增强。淀粉在淀粉酶中水解的顺序为：淀粉→蓝糊精→红糊精→麦芽糖→葡萄糖。与碘液呈色依次为：蓝色、蓝色、红色、无色、无色。因此可用碘液检验酶解终点。酶解终点为酶解液与碘液的反应不呈蓝色。若呈蓝色，再加热糊化，冷却至06℃以下，再加淀粉酶溶液，继续保温，直至酶解液加碘液后不呈蓝色为止。 （5）使用淀粉酶前，应确定其活力及水解时加入量。可用已知浓度的淀粉溶液少许，加入一定量淀粉酶溶液，置55～60℃水浴中保温h1，用碘液检验淀粉是否水解完全。以确定酶的活力及水解时的用量。三、其他方法 （一）旋光法 1.原理 淀粉具有旋光性，在一定条件下旋光度的大小与淀粉的浓度成正比。用氯化钙溶液提取淀粉，使之与其他成分分离，用氯化锡沉淀提取液中的蛋白质后，测定旋光度，即可计算出淀粉含量。计算公式如下： 式中：α──旋光度读数，度； L──观测管长度，dm； m──样品质量，g； 023──淀粉的比旋光度，度。 2.适用范围及特点 本法适用于不同来源的淀粉，具有重现性好，操作简便、快速等特点。由于淀粉的比旋光度大，直链淀粉和支链淀粉的比旋光度又很接近，因此本法对于可溶性糖类含量不高的谷物样品，具有较高的准确度。但对于一些未知或性质不清楚的样品及淀粉已经受热或变性，分析结果的误差较大。 3.说明与讨论 （1）本法属于选择性提取法，用氯化钙溶液作为淀粉的提取剂，是因为钙能与淀粉分子上的羟基形成络合物，使淀粉与水有较高的亲合力而易溶于水中。 （2）用氯化钙溶液淀粉提取时，需加热煮沸样品溶液一定时间，并随时搅拌，以提高淀粉提取率。加热后必须迅速冷却，以防止淀粉老化，形成高度晶化的不溶性淀粉分子微束。若加热煮沸过程中泡沫过多，可加入1～2滴辛醇消泡。 （3）蛋白质也具有旋光性，为消除其干扰，本法加入氯化锡溶液，以沉淀蛋白质。蛋白质含量较高的样品，如高蛋白营养米粉，用旋光法测定时结果偏低，误差较大。 （4）淀粉的比旋光度一般按230°计，但不同来源的淀粉也略有不同，如玉米，小麦淀粉为230°，豆类淀粉为020°。 （5）可溶性糖类比旋光度低，如蔗糖为+656.°、葡萄糖为+552.°、果糖为–°，都比淀粉的比旋光度低得多，它们对测定结果一般影响不大，可忽略不计。但糊精的比旋光度为+95°，对糊精含量高的样品测定结果有较大的误差。 （二）重量法 1.原理 把样品与氢氧化钾酒精溶液共热，使蛋白质、脂肪等溶解，而淀粉和粗纤维不溶解。过滤后，用氢氧化钾水溶液溶解淀粉，使之与粗纤维分离。然后用醋酸酸化的乙醇使淀粉重新沉淀，过滤后把沉淀于100℃烘干至恒重，再于505℃灼烧至恒重，灼烧前后重量之差即为淀粉的含量。计算公式如下： 式中：m──坩埚和内容物干燥后的质量，g； 1
m──坩埚和内容物灼烧后的质量，g； 2 m──样品质量，g； V──测定时取样液量，Lm； 01──样液总量，Lm。 2.适用范围及特点 本法是北欧食品分析委员会的标准方法。适用于蛋白质、脂肪含量较高的熟肉制品，如午餐肉、灌肠等食品中淀粉的测定。结果准确，重现性好，但操作繁琐，时间较长。 3.说明与讨论 （1）氢氧化钾酒精溶液是将HO0K5g溶于L9501%0m乙醇溶液中；醋酸酸化的乙醇溶液是指L9001%0m乙醇溶液中加了L5m冰醋酸。 （2）实验过程中有两次过滤，第一次是从样品溶液中分离提取出淀粉和粗纤维，用氢氧化钾酒精溶液洗涤沉淀，采用滤纸过滤；第二次是以醋酸酸化的乙醇溶液洗涤沉淀淀粉，采用古氏坩埚过滤。过滤过程中易造成损失，需细心操作，确保实验结果准确。 （3）测定肉制品中淀粉也可以采用容量法。即把样品与氢氧化钾共热，使样品完全溶解，再加入乙醇使淀粉析出，经乙醇洗涤后加酸水解为葡萄糖，然后按测定还原糖的方法测定葡萄糖含量，再换算为淀粉含量。此方法没把淀粉与其他多糖分离开，如果在水解条件下这些多糖也能水解为还原糖，将产生正误差。 （三）高压酸水解法 1.原理 在高压下用硫酸水解样品，使淀粉水解为葡萄糖，测定水解液中还原糖总量，同时测定样品总糖量，两者之差即为淀粉水解产生的还原糖量，再乘以换算系数即得淀粉含量。 2.适用范围及特点 该法适用于蔬菜、水果等淀粉含量较少的样品。根据样品中淀粉及脂肪含量少的特点，省略了乙醚除脂肪和乙醇除可溶性糖类的操作步骤，以避免处理过程中淀粉的流失（当淀粉含量少时这种损失不可忽略），并简化了样品处理过程，改变了水解条件，从而大大缩短了测定时间。 3.说明与讨论 （1）本法采用的高压酸水解条件是：样品中加入 L01m0 ol0/硫酸， 压力为，水解时间为in15m。 （2）样品中如含有半纤维素、 戊聚糖、果胶质等多糖类，也可能被水解，造成正误差。另外，水解淀粉的条件与测总糖时的水解条件不同，可溶性糖类如蔗糖、葡萄糖、果糖等在这两种水解条件下的产物不一定完全相同，这也会给结果带来误差。 （四）酶-比色法 1.原理 淀粉在淀粉葡萄糖苷酶（SGA）催化下，最终水解为葡萄糖。葡萄糖氧化酶（OGD）在有氧条件下，催化β-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液）氧化，生成-D葡萄糖酸-δ-内酯和过氧化氢。受过氧化物酶（DOP）催化，过氧化氢与4-氨基安替比林和苯酚生成红色醌亚胺。 生成的醌亚胺在50nm波长处有最大吸收峰，可测定吸光度值，计算食品中淀粉的含量。计算公式如下：
式中：X──样品中淀粉的含量，质量百分率，％； C──标准曲线上查出的试液中淀粉含量，µg； m──试样的质量，g； V──试液的定容休积，Lm； 1V──测定时吸取试液的体积，Lm。 22.适用范围及特点 本法选自国家标准分析方法721B-86/G91T69，简单快速，选择性好，不受其它糖类物质的干扰，适用于各类样品中淀粉的测定，最低检出限量为900.µLg/m。但需专用试剂，价格昂贵，不易保存，应用受到限制。 3.说明与讨论 （1）组合试剂盒由四瓶试剂组成。1号瓶内含淀粉葡萄糖苷酶200U，柠檬酸和柠檬酸钠；2号瓶内含ol2/磷酸盐缓冲溶液（p=H7）200 Lm，其中4-氨基安替比林为ol/05L4010m.；3号瓶内含ol/2L200m.苯酚溶液20 0Lm；4号瓶内含葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶。4个瓶须在4℃左右保存。用时将1号瓶内的物质用重蒸馏水溶解，使其体积为66 Lm，此溶液即为淀粉葡萄糖苷酶试剂；2号瓶和3号瓶的物质充分混合均匀，再将4号瓶的物质溶解其中，使葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶完全溶解即得葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶试剂溶液。这两种酶试剂溶液须在4℃左右保存，有效期一个月。 （2）酶水解条件很严格，制备试液时，要求用二甲基亚砜和ol6m／L盐酸溶液于60±1℃，加热提取in30m，冷却至室温后，用ol6m／L氢氧化钠溶液调整pH值至左右。用重蒸馏水定容，弃去初滤液。测定试液时，要求加入L1m淀粉葡萄糖酶试剂溶液，摇匀，于58±2℃恒温水解in20m。冷却至室温后，加入L3m葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂溶液，摇匀，在+316℃恒温in4m。冷却至室温，用重蒸馏水定容，摇匀，测定吸光度，查标准曲线计算样品中淀粉含量。 （五）蒽酮-比色法 淀粉用稀酸水解为葡萄糖，然后在较高温度下用浓硫酸使葡萄糖脱水生成羟甲基糠醛，再使之与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物。其呈色强度与溶液中葡萄糖的含量成正比，在603nm波长下测定吸光度，根据预先制得的标准曲线求得淀粉的浓度，再换算成样品中淀粉含量。 由于单糖、双糖、糊精和纤维素等都可与蒽酮试剂作用，故在淀粉水解前要除去这些干扰物质。 该法是微量法，适合于含微量淀粉的样品，具有灵敏度高、试剂用量少等优点。但反应温度、显色时间、样液有无颜色和沉淀等都将影响实验结果，因此必须严格控制反应条件。 四、淀粉其他性质的测定 （一）直链淀粉含量的测定 稻米中直链淀粉含量多少是大米食用品质的关键因子。稻米的粘性、硬度、蒸煮时吸水量、蒸煮时间、米饭体积等等在很大程度上取决于稻米中直链淀粉与支链淀粉两组分含量变化以及直链淀粉相对分子质量的大小。当稻米中直链淀粉含量低于2％时，这种大米都呈糯性，蒸煮时米饭很粘；直链淀粉含量在21％～19％的稻米，蒸煮时吸水率低，蒸煮的米饭柔软，粘性较大，涨性小，冷却后仍能维持柔软的质地，食味品质良好；直链淀粉含量在20％～24％的稻米，蒸煮时吸水率高，体积膨胀率大，糊化温度高，米饭蓬松，较硬，冷却后变硬；直链淀粉含量在25％以上的稻米，蒸煮时米饭蓬松，硬，粘性差，冷却米饭变得更硬。因此，直链淀粉含量直接影响米饭香味与蒸煮品质，常被用作评定稻米食用和蒸煮品质的指标。 1.原理 淀粉与碘形成碘-淀粉复合物，并具有特殊的颜色反应。支链淀粉与碘生成棕红色复合物，直链淀粉与碘生成深蓝色复合物。在淀粉总量不变条件下，将这两种淀粉分散液按不同比例混合，在一定条件下与碘作用，生成由紫红到深蓝一系列颜色，代表其不同直链淀粉含量比例，在62 0mn波长下测定吸光度，绘制吸光度与直链淀粉浓度的标准曲线，按下面公式计算。 m×1001X=×100% 1m×5
m×1001X=×100% 2m×5×(1−M)2式中X──直链淀粉占淀粉总量质量分数，％ 1 X──直链淀粉占样品干重的质量分数，％ 2m──从标准曲线求出的直链淀粉质量，g m1m──样品中所含粗淀粉的质量， g mm──样品的质量， gm。 2M──样品的水分含量，%。 2.适用范围和特点 本方法选自BG／ T1-95164958，该方法简便快速、灵敏、准确度高，适用于稻米、玉米、谷子等食物。 3.说明与讨论 （1）要求直链淀粉和支链淀粉纯品必须具备以下条件： 马铃薯直链淀粉：λ为601～mn506， 淀粉含量在85％以上，碘结合量在.159以上， axmλ在20℃时为304以上。 axm支链淀粉为：稻谷，λ205～503nm，，602nm在20℃时为17以下； axm玉米：λ305～504nm，，602nm在20℃时为52以下； axm谷子：λ3n405m05-，，602nm在20℃时为22以下。 axm（2）马铃薯直链淀粉纯品制备方法：称取马铃薯淀粉1g0，加少量无水乙醇使样品湿润，再加入／L氢氧化钠L305m，放入沸水浴中加热搅拌in02m，至完全分散，冷却，以inm/040r离心i2n0m，取上清液用ol5/盐酸调至，然后加入丁醇-异戊醇（1+1）L80m，在沸水浴中加热搅拌in10m，冷却至室温，移入冰箱内（2～4℃）静置2h4，弃去上层污物层，再以i40/n0mr离心in51m，，弃掉上清液，沉淀物即为粗直链淀粉。 用饱和正丁醇水溶液洗涤沉淀物（粗直链淀粉），以in0400r/m离心in15m，将沉淀物转入L200m饱和正丁醇水溶液中，在沸水浴中加热溶解10～in1m5，冷却至室温，放入冰箱内（2～4℃）2h4，弃去上层污物层，以4i0n0r/m离心in51m，沉淀物再加2L00m饱和正丁醇水溶液加热溶解，反复纯化三次。最后沉淀物用无水乙醇反复洗涤离心3～4次，在真空干燥箱中于55～65℃干燥，即得直链淀粉纯品。 （3）本法用ol1/Lm氢氧化钠溶液在沸水浴中加热可加快分散步骤，避免发生沉淀，加热i1n0m对直链淀粉测定结果也无影响。但要求测定样品与绘制标准曲线时的温度相差不能超过±1℃，否则误差较大。 （4）用无水乙醇作为湿润剂，可防止米粉在加入氢氧化钠时结块。 （二）淀粉α化度的测定 未经糊化的淀粉分子，其结构呈微晶束定向排列，这种淀粉结构状态称为β型结构，通过蒸煮或挤压，达至糊化温度时，淀粉充分吸水膨胀，以致微晶束解体，排列混乱，这种淀粉结构状态叫α型，淀粉从β型转化为α型的程度叫淀粉α化度，也即糊化程度。 在食品的生产中，常需要了解产品的糊化程度，因为α度的高低影响复水时间和食品的品质。国家规定，油炸方便面的α度≥85％，热风干燥面α度≥800%.，米粉熟透的质量指标在58％左右。 1.原理 已糊化的淀粉，在淀粉酶水解作用下，可水解成还原糖，α化度越高，即糊化的淀粉越多，水解后生成的糖越多。先将样品充分糊化，经淀粉酶水解后，用碘量法测定糖。以此作为标准，糊化程度定为100％。然后另取样品，不糊化，用淀粉酶直接水解，用同样方法测定糖，通过计算可求出被测样品的相对糊化程度，即样品的α化度。 2.说明与讨论 （1）样品脱脂预处理时，为防止样品的糊化，不可加温到05℃以上。
（2）测定方法如表9－4所示。 （3）样品的α化度按下面公式计算： (c−a)−(c−a)−(c−b)34α化度(%)=×100 (c−a)−(c−a)−(c−b)12（4）样液及试剂的移加，应以相同的时间间隔，按照顺序依次迅速加入。 表9－4 α化度测定方法 三 角 瓶 标 号 A A A A B C1234（1）称样1克 + + + + / / （2）加水50 mL+ + + + + / （3）在沸水浴中加热15分钟 + + //// （4）急剧冷却至室温 ++/ / / /（5）加5%淀粉糖化酶液5 mL+ / + / + / （6）37℃下保温90分钟，时加振摇 + + + + + / （7）加 ol1/mLHCl 2 L m+ + + + + / （8）定容至100 mL+ + + + + / （9）过滤 + + + + + / （10）准确取滤液 01Lm，加塞 + + + + / （11）准确加水10Lm/ // / / + （12）加 Lm+ + + + + + （13）加 + + + + + （14）准确静置15分钟 + + + + + + （15）加10%HOS2 Lm+ + + + + + 24（16）以 + + + + + + 223滴 定 值)Lm(a a a a b c 1234 第四节 粗纤维的测定 食品中的粗纤维在化学上不是单一组分的物质，而是包括纤维素、半纤维素、木质素等多种组分的混合物。是植物性食品的主要成分之一，广泛存在于各种植物体内，其含量随食品种类的不同而异，尤其在谷类、豆类、水果、蔬菜中含量较高。由于其组成十分复杂，且随食品的来源、种类而变化。因此，不同的研究者对纤维的解释也有所不同，其定义也就不同。目前，还没有明确的科学的定义。早在19世纪06年代，德国的科学家首次提出了“粗纤维”的概念，用来表示食品中不能被稀酸、稀碱所溶解，不能为人体所消化利用的物质。到了近代，在研究和评价食品消化率和品质时，从营养学的观点，提出了膳食纤维的概念。它是指人体消化系统或者消化系统中的酶不能消化、分解、吸收的物质。它包括粗纤维和半纤维分析方法所测得的那些化合物。如纤维素、半纤维素、戊聚糖、木质素、果胶、树胶等。膳食纤维比粗纤维更能客观、准确地反映食物的可利用率，因此有逐渐取代粗纤维的趋势。 纤维素与淀粉一样，也是葡萄糖的聚合物，但它是300～0200个葡萄糖残基以β1-，4糖苷键连接而成的。它不溶于水，也不溶于任何有机溶剂，对稀酸、稀碱相当稳定，人类和大多数动物由于没有β1-，4糖苷酶，故也不能消化利用纤维素。半纤维素往往与纤维素共存，它是指细胞壁中那些不溶于水，可溶于冷的稀碱溶液中的多糖。与酸共热时，可部分降解，降解产物有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等。木质素是使植物木质化的物质，它不属于多糖而是多聚芳香族苯丙烷化合物，是纤维素的伴随物质，不能为人和动物消化。 纤维虽然不能被人体消化吸收和利用，营养价值很低，但它能吸收和保留水分使粪便柔软，有利于大便畅通。也能刺激消化液的分泌与肠道的蠕动，在维持人体健康、预防疾病方面有着独特的生理作用，因此已日益引起人们的重视。人类每天要从食品中摄入8～21g粗纤维才能维持人体正常的生理代谢功能。为保证纤维的正常摄取，一些国家强调增加纤维含量高的谷物、果蔬制品的摄食，同时还开发了许多强化纤维的配方食品。在食品生产和开发中，常需要测定粗纤维的含量，它也是食品成分全分析项目之－，对于食品品质管理和营养价值的评定具有重要意义。 食品中粗纤维的测定提出最早、应用最广泛的是重量法，此外还有纤维素测定仪法及不溶性膳食纤维
等的测定。兹分别介绍如下。 一、粗纤维的测定 （一）重量法 1.原理 在热的稀硫酸作用下，样品中的糖、淀粉、果胶等物质经水解而除去，再用热的氢氧化钾溶液处理，使蛋白质溶解、脂肪皂化而除去。然后用乙醇和乙醚处理以除去单宁、色素及残余的脂肪，所得的残渣即为粗纤维，如其中含有无机物质，可经灰化后扣除。计算公式如下： 式中：G──残余物的质量（或经高温灼烧后损失的质量），g； m──样品质量，g。 2.适用范围及特点 该法选自/-具有操作简便、迅速，适用于各类食品。由gnnleHereb等人于0168年提出后，一直沿用至今，是应用最广泛的经典分析法，也是测定纤维的国家标准分析方法。目前，我国的食品成分表中“纤维”项的数据都是用此法测定的，但该法测定结果粗糙，重现性差。由于酸碱处理时纤维成分会发生不同程度的降解，使测得值与纤维的实际含量差别很大，这是此法的最大缺点。 3.说明与讨论 （1）试样一般要求通过04目筛，并且充分混合使之均匀，过粗过细都不好。过粗，则难以水解充分，往往使结果偏高；而过细则往往使结果偏低且过滤困难。 （2）样品中脂肪含量高于1％时，应先用石油醚脱脂，然后再测定，否则结果将偏高。 （3）严格控制酸、碱处理过程，确保测定结果的准确性。实验证明，酸、碱处理过程的回流时间和沸腾的状态等因素都将对测定结果产生影响。酸、碱处理时间必须严格掌握。注意沸腾不能过于剧烈，以防止样品脱离液体，附于液面以上的瓶壁上。每隔in5m摇动锥形瓶一次，以充分混合瓶内物质，并注意加沸水维持原来液面的高度以保持酸、碱的浓度不变。如产生大量泡沫，可加入2滴硅油或辛醇消泡。 （4）回流处理后，必须立即用亚麻布过滤，并用热水洗涤至洗液不呈酸性（以甲基经为指示剂），否则结果出入较大。用亚麻布过滤时，最好采用020目尼龙筛绢过滤，既耐较高温度，孔径又稳定，本身不吸留水分，洗残渣也较容易。过滤时间不能太长，一般不超过in10m，否则应适量减少称样量。 （5）恒重要求：烘干＜g1m，灰化＜。 （6）本方法在测定中，纤维素、半纤维素、木质素等食物纤维成分都发生了不同程度的降解，且残留物中还包含了少量的无机物、蛋白质等成分，故测定结果称为“粗纤维”。 （7）测定粗纤维的方法还有容量法。样品经2％盐酸回流，除去可溶性糖类、淀粉、果胶等物质，残渣用80％硫酸溶解，使纤维成分水解为还原糖（主要是葡萄糖），然后按还原糖测定方法测定，再折算为纤维含量。该法操作复杂，一般很少采用。 （二）纤维素测定仪法 1.仪器构造 纤维素测定仪主要由热抽提器和冷抽提器两部分组成。 热抽提器由辐射加热、试剂和洗涤水的预热系统、冷凝水系统、水泵、试剂泵、真空泵、压力泵等部分组成。冷抽提器由阀门系统、真空排泄系统、压力系统等部分组成。该系统所使用的坩埚由硼硅玻璃（xeryP）制成，配有不同孔隙度的过滤器，根据所配过滤器孔隙度的不同，坩埚可分为P、P、P、P几种型号，分别标注在坩埚上。P为粗过滤器，P为01230190～105µm，P为40～90µm，P为15～40µm。这些坩埚均可承受504℃的高温。但冷坩埚不可立即放入23高温炉内，应从炉口低温区逐步放入炉内高温区；在500℃灰化后，热坩埚也不可立即放在冷的表面上，应先在炉口降温后拿出，以防破裂。仪器配有坩埚夹钳，便于将一组6个坩埚齐插入热、冷抽提器，或将6个坩埚从热冷抽提器中拔出。仪器还配有坩埚支架，便于将一组6个坩埚移到其它地方（如天平室）。 2.工作原理 用水充满热抽提器的水箱，由电加热装置加热水箱中的水，温度保持94℃。由水泵使水在系统中循环。试剂瓶装在保温的支承套中，由试剂泵将试剂泵出，再通过两个热交换器，最后又返回到贮存瓶内，热交换器与水箱内的水加热装置盘绕在一起，以此可使试剂加热升温。
当六个控制阀位于左边时，试剂1（ol/硫酸）被泵入试样坩埚和抽提筒内。由电辐射器加热试剂且保持合适的沸腾速度。当到达抽提时间后，辐射加热将自动关闭，循环终止，发出短促响声信号。然后将控制阀门推向真空位置，进行真空过滤。启动压力泵，排出废液。在热抽提器的上方配有喷雾器，可沿导杆滑动，导杆上设有定位槽，以保证喷雾器能依次向每个抽提筒内喷去离子水洗涤试样。依次用喷雾洗涤试样。当六个控制阀位于右边时，则试剂2（o2ml/氢氧化钠溶液）被泵入试样坩埚和抽提筒内，同上述试剂1的原理进行抽提和洗涤试样。当完成最后的抽提和洗涤后，移走坩埚，将其放入冷抽提器内，再用丙酮洗涤除去残留的有机物，烘干所得残余物减去灰分即为试样中的纤维素，计算公式如下： 式中：G──残余物的质量（或经高温灼烧后损失的质量），g； m──样品质量，g。 3.适用范围及特点 本法样品的抽提、洗涤和过滤等操作由仪器自动完成，操作简便、迅速，适用于各类食品，但由于酸碱处理时，样品中纤维素、半纤维素等成分有不同程度的降解，使测定结果粗糙，重现性差。 4.说明与讨论 （1）要求试样水分含量为5％～10％，通过孔径为1mm的筛绢。高脂肪含量的试样应先在冷抽提器内脱脂，再进行分析。 （2）当试剂开始沸腾后，火力调小，以保持缓慢而稳定的沸腾速率，使其准确沸腾。如果试样浮在试剂表面，可加入一些乙醇以减少表面张力，也可加几滴辛醇以减少或消除泡沫的形成。 （3）如果试样在抽提筒内粘附在试剂表面上方的筒壁上，可将加热器开大些，以增加沸腾的强度，达到洗下粘附的试样的目的，也可以小心用玻璃棒将粘附的试样刮下，或用洗瓶喷水洗下。 （4）借助热抽提器内的反向气流作用，能有效地除掉滤渣或堵塞过滤坩埚的物料。减少过滤时可能会出现问题的另一种方法是使加热器工作，维持抽提筒的热量，使试样粘度不下降。 （5）完成每一试样抽提后，应及时检查水箱内的水位，如需要可加水补充；测定完成后，用压缩空气冲洗坩埚中的灰分，如果坩埚弄脏，可用铬酸洗涤。 二、不溶性膳食纤维的测定 鉴于粗纤维测定方法的诸多缺点，近几十年来各国学者对膳食纤维的测定方法进行了广泛的研究，提出了不溶性膳食纤维，试图用来代替粗纤维指标。不溶性膳食纤维是指来源于各类植物性食物中不溶于水的半纤维素、纤维素和木质素。目前有的国家把它列为营养分析的正式指标之一。 （一）原理 样品经热的中性洗涤剂溶液浸煮后，除去样品中糖、淀粉、蛋白质、果胶等物质被溶解除去，残渣用热蒸馏水充分洗涤后，加入α-淀粉酶溶液以分解结合态淀粉，再用蒸馏水、丙酮洗涤，除去残存的脂肪、色素等，残渣经烘干，即为不溶性膳食纤维。计算公式如下： G不溶性膳食纤维=)%(×100 m 式中：G──残余物的质量（或经高温灼烧后损失的质量），g； m──样品质量，g。 2.适用范围及特点 本法是美国谷物化学家协会（CCAA）审批的方法也是我国国标2/82BT98G-，34929-10BG的方法，适用于谷物及其制品、饲料、果蔬等样品，对于蛋白质、淀粉含量高的样品，由于易形成大量泡沫，粘度大，过滤困难，使此法应用受到限制。本法设备简单、操作容易、准确度高、重现性好。所测结果包括食品中全部的纤维素、半纤维素、木质素，最接近于食品中膳食纤维的真实含量。 3.说明与讨论 （1）不溶性膳食纤维相当于植物细胞壁，它包括了样品中全部的纤维素、半纤维素、木质素、角质等。水溶性膳食纤维是指溶于水的膳食纤维，包括来源于水果的果胶、某些豆类种子中的豆胶、海藻的藻胶、某些植物的粘性物质等，由于食品中水溶性膳食纤维含量一般较少，所以不溶性膳食纤维接近于食品中膳食纤维的真实含量。
（2）中性洗涤剂溶液：.A将乙二胺四乙酸钠和四硼酸钠用L250m水加溶解。B.将30g十二烷基硫酸钠和L10m乙二醇-乙醚溶于L200m热水中，合并于A液中。C.将磷酸氢二钠溶于L150m热水，并入A液中。然后用磷酸调节混合液pH至96.～17.，最后加水至L010m。此液使用期间如有沉淀生成，须在使用前加热到60℃，使沉淀溶解。 （3）样品粒度对分析结果影响较大，本标准要求试样通过mm1筛。 （4）许多样品易形成泡沫，干扰测定，可用十氢钠作为消泡剂，也可用正辛醇，但正辛醇测定结果精密度不及十氢钠。 （5）不溶性膳食纤维测定值高于粗纤维测定值，且随食品种类的不同，两者的差异也不同，实验证明，粗纤维测定值占不溶性膳食纤维测定值的百分比：谷物为13％～27％；干豆类为35％～52％；果蔬为32％～66％。 第五节 果胶物质的测定 果胶物质是由半乳糖醛酸、乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等组成的高分子聚合物，存在于水果、蔬菜及其它植物的细胞膜中，是植物细胞的主要成分之一。其基本结构是半乳糖醛酸以α1-，4苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸。这些半乳糖醛酸中的部分羧基被甲基酯化，剩余部分被钙、镁、钾、钠、铵等离子所中和。 果胶物质以甲氧基含量或酯化程度不同分为原果胶、果胶酯酸、果胶酸。原果胶是与纤维素、半纤维素结合在一起的高度甲酯化的聚半乳糖醛酸，存在于细胞壁中，不溶于水，在原果胶酶或酸的作用下可水解为果胶酯酸。果胶酯酸是羧基不同程度甲酯化和中和的聚半乳糖醛酸，存在于植物细胞汁液中，可溶于水，溶解度与酯化程度有关，在果胶酶或酸、碱的作用下可水解为果胶酸。果胶酸是指甲氧基含量＜1％＋＋＋＋22的果胶物质，它可溶于水，在细胞汁中可与Ca、Mg、K、aN 等离子形成不溶于水或微溶于水的果胶酸盐。 植物中各种形态果胶物质含量与其成熟度有关，并影响植物组织的强度和密度。在果蔬未成熟时主要以原果胶形式存在于细胞壁中，整个组织比较坚硬。在逐渐成熟过程中，原果胶在酶的作用下水解为可溶性果胶酯酸，并与纤维素、半纤维素分离，渗入细胞汁液中，组织随之变软。如果过熟，果胶酯酸在酶的作用下水解为果胶酸，组织变成软疡状态。果胶物质在酸的作用下最终可水解为半乳糖醛酸。 果胶物质是一种植物胶，在食品工业中用途较广，如利用果胶的水溶液在适当的条件下可以形成凝胶的特性，可以生产果酱、果冻及高级糖果等食品；利用果胶具有增稠、稳定、乳化等功能，可以在解决饮料的分层、稳定结构、防止沉淀、改善风味等方面起着重要作用；利用果胶物质能治疗胃肠道、胃溃疡等疾病，低甲氧基果胶能与铅、汞等有害金属络合形成人体不能吸收的不溶解物的性质，可以用其制成功能性食品。 测定果胶物质的方法有重量法、咔唑比色法、果胶酸钙滴定法、蒸馏滴定法等。其中果胶酸钙滴定法主要适用于纯果胶的测定，当样液有颜色时，不易确定滴定终点，此外，由不同来源的试样得到的果胶酸钙中钙所占比例并不相同，从测得的钙量不能准确计算出果胶物质的含量，这使此法的应用受到了一定的限制。对于蒸馏滴定法，因为在蒸馏时有一部分糠醛分解了，使回收率较低，故此法也不常用。较常用的是重量法和咔唑比色法。 一、重量法 1.原理 先用70％乙醇处理样品，使果胶沉淀，再依次用乙醇、乙醚洗涤沉淀，以除去可溶性糖类、脂肪、色素等物质，残渣分别用酸或用水提取总果胶或水溶性果胶。果胶经皂化生成果胶酸钠，再经醋酸酸化使之生成果胶酸，加入钙盐则生成果胶酸钙沉淀，烘干后称重。按下式计算： 式中：m──果胶酸钙和滤纸或垂融坩埚质量，g； 1 m──滤纸或垂融坩埚的质量，g； 2
m──样品质量，g； 52──测定时取果胶提取液的体积，Lm； 520──果胶提液总体积，L m 92023.──由果胶酸钙换算为果胶酸的系数。果胶酸钙的实验式定为CHOCa，其中钙含量712211约677.％，果胶酸含量约为％。 2.适用范围及特点 此法适用于各类食品，方法稳定可靠，但操作较烦琐费时。果胶酸钙沉淀中易夹杂其他胶态物质，使本法选择性较差。 3.说明与讨论 （1）新鲜试样若直接研磨，由于果胶酶的作用，果胶会迅速分解，故需将试样切片浸入热的95%乙醇中，使乙醇溶液最终浓度调整到0%7以上，回流煮沸in15m，以钝化酶的活性。 （2）可溶性糖和脂类等物质对测定有影响，测定前必须设法除去。除去方法为：对于新鲜样品，将试样切片回流煮沸in15m后，用布氏漏斗过滤，残渣置于研钵中，加%07的热乙醇慢慢磨碎，冷却后再过滤，反复操作至滤液不呈糖的反应为止。然后残渣用99％乙醇洗涤脱水，再用乙醚洗涤以除去脂类和色素等；对于通过60目筛的干燥样品，加入热的07％乙醇，反复除去糖类物质，直至滤液不呈糖的反应。然后残渣用99％乙醇洗涤脱水，再用乙醚洗涤以除去脂类和色素等。 （3）糖分检验用苯酚-硫酸法：取检液L1m，置于试管中，加入5％苯酚水溶液L1m，再加入硫酸Lm5，混匀，如溶液呈褐色，证明检液中含有糖分。 （4）水溶性果胶测定时，用水在沸水浴上提取1h，冷却后加水定容，摇匀，过滤，收集滤液；总果胶用加热至沸的ol0/.L5m盐酸溶液，于沸水浴中回流提取1h，冷却后调中性后，用水定容，过滤，收集滤液。 （5）本法是用沉淀剂使果胶物质沉淀析出，而后测定重量的方法。沉淀剂有两类：一类是电解质，如氯化钠、氯化钙等；另一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。果胶物质沉淀的难易程度与其酯化程度有关，酯化度越大，溶解度越大，越难于沉淀。电解质适用于酯化度小和中等的果胶物质，如酯化度为0～03%时，常用氯化钠溶液；酯化度为40％～70%时，常用氯化钙溶液作沉淀剂。有机溶剂适用于酯化度较大的果胶物质，且酯化度越大，选用的有机溶剂的浓度也应越大。 （6）本法采用氯化钙溶液作沉淀剂，加入氯化钙溶液时，应边搅拌边缓缓滴加，以减小过饱和度，并避免溶液局部过浓。 （7）由于果胶物质的粘度一般很大，为了降低溶液的粘度，加快过滤和洗涤速度，并增大杂质的溶解度，使其易被洗去，需采用热过滤和热水洗涤沉淀。 二、咔唑比色法 1.原理 果胶经水解生成半乳糖醛酸，在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比，可比色定量。按下式计算： 式中：c──从标准曲线上查得的半乳糖醛酸浓度，µLg/m； V──果胶提取液总体积，Lm； K──提取液稀释倍数。 m──样品质量，g 2.适用范围及特点 本法适用于各类食品，较重量法操作简便、快速。标准样品的平均回收率为894.％～%7120.，准确度高，重现性好，同一试样五次测定结果的标准误差为±～等优点。 3.说明与讨论 （1）本法样品处理和果胶的提取，同重量法。
（2）糖分存在对咔唑的呈色反应影响较大，使结果偏高。因此从样品中提取果胶物质之前，用70%乙醇充分洗涤试样以完全除去糖分。 （3）硫酸的浓度对呈色反应影响较大，半乳糖醛酸在低浓度的硫酸中与咔唑试剂的呈色度极低，甚至不显色，只有在浓硫酸中才可使其显色，且颜色深浅与浓硫酸浓度和纯度有关。故在测定样液和制作标准曲线时，应使用同规格、同批号的浓硫酸，以保证其浓度、纯度一致。 （4）浓硫酸与半乳糖醛酸混合液，在加热条件下可形成与咔唑呈色反应所必须的中间化合物，在加热in10m后即已形成，在测定条件下显色迅速且具有一定的稳定性，可满足测定要求。 （5）本法的测定结果以半乳糖醛酸表示，因不同来源的果胶中半乳糖醛酸的含量不同，如甜橙为.77％，柠檬为924.％，柑桔为96％，苹果为72％～75％。若把结果换算为果胶的含量，可按上述关系计算换算系数。 思考题 1. 说明糖类物质的分类、结构、性质与测定方法的关系。 2. 直接滴定法测定食品中还原糖为什么必须在沸腾条件下进行滴定，且不能随意摇动三角瓶？ 3. 高锰酸钾法测定食品中还原糖的原理是什么，在测定过程中应注意哪些问题？ 4. 用铁氰化钾法测定食品中还原糖时，向样品中加入铁氰化钾溶液后再加热，是否会引起还原糖水解，为什么？ 5. 测定食品中蔗糖时，为什么要严格控制水解条件？ 6. 食品中淀粉测定时，酸水解法和酶水解法的使用范围及优缺点是什么？现需测定糙米、木薯片、面包和面粉中淀粉含量，试说明样品处理过程及应采用的水解方法。 7. 为什么重量法测定的纤维素要以粗纤维表示结果？ 8. 咔唑比色法测定食品中果胶物质的原理是什么，如何提高测定结果的准确度？ （许牡丹）
附表1 转化糖因数表（蓝-爱农法） 每100毫升糖液含蔗糖量（克） 糖液滴 0 1 5 1025 定 量 每100毫升 每100毫升 每100毫升每100毫升每100毫升转化糖 转化糖 转化糖转化糖转化糖 (毫升) 糖液转化 糖液转化 糖液转化糖液转化糖液转化因数* 因数* 因数*因数* 因数* 糖毫克数 糖毫克数 糖毫克数糖毫克数糖毫克数 15 336 333 317 289 16 316 312 297 271 17 298 295 280 255 18 282 278 264 240 19 267 264 250 227 20 216 21 206 22 196 23 187 24 179 25 171 26 164 27 158 28 152 29 147 30 142 31 137 32 132 33 128 34 124 35 121 36 17 137 14 138 11139 107 40 104 41 102 42 99 43 97 44 94 45 92 46 90 47 88 48 86 49 84 50 82 * 相当于10毫升费林氏试液的转化糖毫克数。 附表2 葡萄糖、果糖因数表（蓝-爱农法） 费林氏试液10毫升 糖液滴 每100毫升 每100毫升 定 量 葡萄糖因素* 糖液含葡萄 果糖因数* * 糖液含果 (毫升) 糖毫克数 糖毫克数 327 16 222
18 274 291 * 10毫升费林氏试液相当的葡萄糖毫克数。 * * 10毫升费林氏试液相当的果糖毫克数。 附表3 麦芽糖、乳糖因素表（蓝-爱农法） 10毫升费林氏试液 糖液滴 水合麦芽糖 无水麦芽糖 水合乳糖 无水乳糖 定 量 CHO·H OCHO CHO·H OCHO·H O122211212221112221121222112(毫升) 每100毫升每100毫升每100毫升每100毫因数* 因数* 因数** 因数**毫克数 毫克数 毫克数 升毫克数 15 542 515 455 432 16 507 482 426 405 17 477 453 401 381 18 450 427 378 359 19 426 405 358 340 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 * 10毫升费林氏试液相当的麦芽糖毫克数。 * *10毫升费林氏试液相当的乳糖毫克数。 附表4 相当于氧化亚铜质量的葡萄糖、果糖、乳糖、转化糖质量表 mg 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水)
续表 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水)
.14 续表 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水) 1 1 续表 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水)
续表 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水)
续表 乳糖 乳糖 氧化亚铜 葡萄糖 果糖 转化糖氧化亚铜葡萄糖果糖转化糖 (含水) (含水)
2219 表5 铁氧化钾定量试样法还原糖换算表 （还原糖含量以麦芽糖计） )NC(eF3KL/) 还原糖含量 )NC(eF3KL/) 还原糖含量)NC(eF3KL/) 还原糖含量666体积L/ m/% 体积L/ m/% 体积L/ m/%
1
第十章 蛋白质和氨基酸的测定 第一节 概述 蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料。一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。人体内的酸、碱及水分平衡，遗传信息的传递，物质代谢及转运都与蛋白质有关。人及动物只能从食物中得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，故蛋白质是人体重要的营养物质，也是食品中重要的营养成分。 蛋白质在食品中含量的变化范围很宽。动物来源和豆类食品是优良的蛋白质资源。部分种类食品的蛋白质含量见表11 0- 表1 0-1 部分食品的蛋白质含量 蛋白质的质量蛋白质的质食 品 种 类 分数（以湿基食 品 种 类 量分数（以湿计）/% 基计）/% 谷类和面食 土豆（整粒、肉和皮） 12 .大米（糙米、长粒、生） 97 .豆类 大米（白米、长粒、生、 大豆（成熟的种子、生） 56 3.强化） 17 . 豆（腰子状、所有品种、 63 2. 小麦粉（整粒） 3 .17成熟的种子、生） 玉米粉（整粒、黄色） 96. 豆腐（生、坚硬） 165. 意大利面条（干、强化） 182. 豆腐（生、普通） 18.玉米淀粉 30 .肉、家禽、鱼 乳制品 牛肉（颈肉、烤前腿） 58 1.牛乳（全脂、液体） 3. 牛肉（腌制、干牛肉） 19 2.牛乳（脱脂、干） 鸡（可供煎炸的鸡胸肉、 13 2.切达干酪 294 .生） 酸奶（普通的、低脂） 火腿（切片、普通的） 167 .水果和蔬菜 鸡蛋（生、全蛋） 152. 苹果（生、带皮） 0 .2 鱼（太平洋鳕鱼、生） 97 1. 芦笋（生） 2 .3 鱼（金枪鱼、白色、罐 56 2. 草莓（生） 0 .6装、油浸、滴干的固体） 莴苣（冰、生） 1 .0 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，摩尔质量大，大部分高达数万～数百万，分子的长轴则长达1nm～100nm，它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、eF、I等元素，但含氮则是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志。 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同。一般蛋白质含氮量为1%6，即1份氮相当于份蛋白质，此数值（）称为蛋白质系
数。不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为，花生为，大米为955.，大豆及其制品为751.，小麦粉为750.、牛乳及其制品为368.。 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的中间产物为月示 、胨、肽等，最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然物中分离得到的氨基酸已达157种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食物供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品的开发及合理配膳等工作都具有极其重要的意义。 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。但因食品种类繁多，食品中蛋白质含量各异，特别是其它成分，如碳水化合物、脂肪和维生素等干扰成分很多，因此蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法，它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一，在国内外应用普遍。该法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白质含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。 近年来，凯氏定氮法经不断的研究改进，使其在应用范围、分析结果的准确度、仪器装置及分析操作速度等方面均取得了新的进步。另外，国外采用红外分析仪，利用波长在～3μm范围内的近红外线具有被食品中蛋白质组分吸收及反射的特性，依据红外线的反射强度与食品中蛋白质含量之间存在的函数关系而建立了近红外光谱快速定量方法。 鉴于食品中氨基酸成分的复杂性，在一般的常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法来完成。色谱技术的发展为各种氨基酸的分离、鉴定及定量提供了有力的工具，近年来世界上已出现了多种氨基酸分析仪，这使得快速鉴定和定量氨基酸的理想成为现实。另外利用近红外反射分析仪，输入各类氨基酸的软件，通过电脑控制进行自动检测和计算，也可以快速、准确地测出各类氨基酸含量。下面分别介绍常用的蛋白质和氨基酸测定方法。 第二节 蛋白质的定性测定 一、蛋白质的一般显色反应 1．氨基黑法 NH2HN=NC6H4NOC6H5NHO3SSO3H 氨基黑1B0是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。
（1）经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑1B0醋酸甲醇溶液（1g3氨基黑1B0溶解于L010m冰醋酸和L900m甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤后可反复使用几次）中，染色in1m0，染色后，用10%醋酸甲醇溶液洗涤约5～7次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行洗脱，用ol10/.Lm氢氧化钠浸泡in30m，于59nm比色测定。 （2）聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：用甲醇固定后，在含1%氨基黑B1 0ol/氢氧化钠溶液中染色in(5m室温)，用5%乙醇洗脱背景底色。或用%7醋酸固定后，于96℃水浴中用7%醋酸（含50.％～1%氨基黑1B0）染色in%,710m醋酸洗脱背景底色。用氨基黑1B0染-SDS蛋白质时效果不好。如果凝胶中含有兼性离子载体，先用1%0三氯醋酸浸泡，每隔2h换液一次，约01次，再进行染色。 （3）凝胶薄层的直接染色：将凝胶薄层放在一定湿度的烘箱内逐步干燥（50℃），没有调温调湿箱时用一张滤纸放于烘箱内，以保持一定的湿度。将干燥的薄层板于漂洗液（705 Lm甲醇，L200m水，L50m冰醋酸）中预处理in10m，然后在染色液（L705m甲醇，Lm002水，L50m冰醋酸，在此溶液中加氨基黑1B0饱和）中染色h5,再在漂洗液内洗涤。 本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。 2．溴酚蓝法 经电泳或层析后滤纸或凝胶于10%.溴酚蓝固定染色液（1g溴酚蓝，g100氯化汞溶于50%乙醇水溶液中，用5%0乙醇稀释至L100m）中浸泡15～in02m，在3%0乙醇：5%醋酸水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用ol/。 C6H4SO3HBrCBrHOOBrBr 此法缺点是灵敏度低，某些摩尔质量低的蛋白质可能染不上颜色。 3．考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝R250 CH2NCNCH2C2H5C2H5-SO3NaSO3NHOC2H5 该染料和蛋白质是通过范德华力结合的。考马斯亮蓝含有较多疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色时漂洗要容易得多。 （1）经电泳后滤纸或醋酸纤维膜在0g20/L磺基水杨酸溶液中浸in1m，取出后放入
或7%醋酸中洗四次，每次in5m，于90℃放置in1m5。 （2）聚丙烯酰胺凝胶也可同上处理。在酸性醇溶液中，考马斯亮蓝-兼性离子载体络合物溶解度显著增大，因此能免去清除兼性离子载体的步骤。可运用下列方法之一： 凝胶用1%0三氯醋酸固定，在0%1三氯醋酸-1%考马斯亮蓝052R（19＋1）中室温染色，用10%三氯醋酸脱底色。 凝胶浸入预热至60℃的%考马斯亮蓝固定染色液（15g0三氯醋酸，45g磺基水杨酸溶于L357m甲醇和L903m蒸馏水的混合液。每g1 考马斯亮蓝R250溶于此混合液L0100m中）中约in3m0，用酸性乙醇漂洗液（乙醇+水+冰醋酸=25+25+8）洗尽背景颜色。染色后凝胶保存于酸性乙醇漂洗液中。本法灵敏度：卵清蛋白300.μg，血清清蛋白002.μg，血红蛋白001.μg。 凝胶浸入考马斯亮蓝固定染色液（g2考马斯亮蓝052R，溶于L010m蒸馏水中，加ol/L2m硫酸L100m，过滤除去沉淀，向清液中滴加 ol/Lm10KOH至颜色从绿变蓝为止。量体积，每L100m加入三氯醋酸2g1）中h1，然后用蒸馏水洗净背景颜色或在%溶液中浸24泡片刻脱除背景颜色。染色后的凝胶保存于蒸馏水中。本法机制未明，起染色作用的可能不是考马斯亮蓝本身，灵敏度不如上法。 考马斯亮蓝法灵敏度比氨基黑高五倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在594nm有最大吸收值，蛋白质在1～10μg呈线性关系。 4．酸性品红法 经电泳后滤纸置于20%.酸性品红溶液中（2g酸性品红溶解于L500m甲醇，L400m蒸馏水和L100m冰醋酸中）加热染色in1m5；取出后浸入醋酸甲醇溶液（50L0m甲醇，加L004m蒸馏水和Lm010冰醋酸）in15m；然后浸入1%0醋酸溶液，每次in20m，至背景无色为止。若欲进行比色，可用10 . ol/mLHaON溶液浸泡2h，在波长为7n50m处比色。 5．氨基萘酚磺酸法 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露于空气中几分钟，或在 ol/L2mlCH中浸一下使表层蛋白变性，再在%0300.氨基萘酚磺酸的oLl10/.m磷酸盐缓冲液（）中染in3m，在紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性时，可先在 ol/Lm3lHC中浸in2m以上使蛋白质充分变性，再染色。 二、复合蛋白质的显色反应 1．糖蛋白的显色 (1)过碘酸f-Schif氏试剂显色法： 试剂 过碘酸液：过碘酸溶解于L30m蒸馏水中，加 L15mol0/醋酸钠溶液及L100m乙醇。临用前配制，或保存在棕色瓶中，可用数日。 还原液：g5碘化钾，g5硫代硫酸钠溶于L100m蒸馏水中，加L95%01m5乙醇及 亚硫酸品红液：2g碱性品红溶解于L040m沸水中，冷却至50℃过滤。在滤液中加入 L10mol2/Lm盐酸和g4偏亚硫酸钾（KSO），将瓶塞紧放在冰箱中过夜，加g1活性炭，225过滤，再逐渐加入ol/L2m盐酸，直至此溶液在玻片上干后不变红色为止，保存在棕色瓶中，冰箱贮存，当溶液变红时不可以再用。
亚硫酸盐冲洗液： L1m浓硫酸，偏亚硫酸钾加入到L100m水中。 显色步骤 将含有样品的滤纸浸在0%7乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸in5m，用7%0乙醇洗一次，在还原液中浸5～in8m，再用70%乙醇洗一次，在亚硫酸品红液中浸24～in5,2m用亚硫酸盐冲洗液洗三次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底板上呈现紫红色。 （2）甲苯胺蓝（ duoeilnTubel）显色法： 试剂 试剂甲：过碘酸溶解在L30m蒸馏水中，加 L51moLl/醋酸钠和 L010m96%乙醇。现配现用。试剂乙：L100m甲醇加L20m冰醋酸及L8m0蒸馏水。试剂丙：溴水。试剂丁：g1/0L甲苯胺蓝水溶液。试剂戊：g4/0L钼酸铵溶液。 显色步骤 将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸in15m，试剂丙中浸in1m5，用自来水漂洗，再在试剂丁中浸in03m，自来水中漂洗至没有蓝色染料渗出（约30～in04m）后，再依次在试剂戊中浸in3m，试剂乙中浸in15m，丙酮中浸in2m后在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分染成蓝色，背景带有红紫色。 （3）阿尔新蓝（naic lAulbe ）显色法： 聚丙烯酰胺凝胶在.152%三氯醋酸中固定in30m后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入1%过碘酸液（在%3醋酸中）中氧化in50m。用蒸馏水反复洗涤去除多余的过碘酸盐。再放入50%.偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐in30m，再用蒸馏水洗涤。浸在0%.5阿尔新蓝（在3%醋酸中）溶液中染4h。 2．脂蛋白的显色 （1）苏丹黑（Sund alkabc）显色法： 将10g.苏丹黑B溶解于煮沸的 L100m06%的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过滤两次，备用。 显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h后取出，用05%乙醇溶液洗涤两次，每次in15m，空气中干燥。 聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑B到无水乙醇中成饱和液，并震摇使乙酰化。用前过滤。按样品液的01/量加入样品液中染色h1或4℃过夜。染色后的样品再进行电泳。 （2）油红O-（Oil red O）显色法： 油红溶解于L6010m0%的乙醇中，30℃放置过夜（1h6）使充分饱和后，在30℃下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。 将滤纸浸入染料液中，在30℃下染色1h8后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在30℃以下显色时，会引起染料沉淀。 第三节 蛋白质的定量测定 一、凯氏定氮法 新鲜食品中含氮化合物大都以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动、
植物食品的蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。 凯氏定氮法由iKelhdla于1833年首先提出，经过长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良凯氏法等多种，至今仍被作为标准检验方法。下面仅对前三种方法予以介绍。 1．常量凯氏定氮法 （1）原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化成二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 ①样品消化：消化反应方程式如下 2HN（CH） HOOC +31HOS =====（HN）OS + 6CO + 12SO + 16H O32224424222浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，将有机物炭化后的碳成为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫： 2HOS +C === 2OS + 2HO + CO↑ 24222二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中： HOS + 2NH ===（HN）OS 243424在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质： 1）硫酸钾 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在304℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至400℃以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下： KOS + HOS == ===2KHSO 24244 OS2HK === =KOS + HO↑ +OS 42423但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失： （HN）OS HN↑+（NH）OSH424344 （HN）OSHHN↑ +OS↑+ H O44332 除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。 2）硫酸铜OuSC 硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，4除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜、使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，硫酸铜的作用机理如下所示： 2CuSOCuOS + SO↑ +O 42422
C + 2CuSOCuOS + SO↑+ CO↑ 42422 CuOS + 2HOSuS2OC + 2H O +OS↑ 2424422 此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜（CuOS）生成，溶液呈现24清澈的蓝绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 ②蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下： HO2aN+（HN）OS ==== 2NH↑aN+OS + 2H O4243242 ③吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐 01-酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（aK01×=），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，1但它有吸收氨的作用，吸收及滴定反应方程如下： 2HN + 4HOB =====（HN）BO + 5H O33342472（HN）BO + 5H O +ClH==2= HN2Cl + 4HBO 42472433（2）适用范围 此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定,是国家标准分析方法，详见B/-。 a．消化装置 b．蒸馏吸收装置 图1 0-1 常量凯氏定氮消化、蒸馏装置 （3）操作方法 准确称取固体样品～2g（半固体样品2～5g，液体样品10～L20m），小心移入干燥洁净的L500m凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜50g.、硫酸钾1g0和浓硫酸L20m，轻轻摇匀后，按图110-中a安装消化装置，于凯氏瓶口放一漏斗，并将其以45°角斜支于有小孔
的石棉网上。用电炉以小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸in3m0。冷却，小心加入L200m蒸馏水，再放冷，加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。 将凯氏烧瓶按图110-蒸馏装置方式连好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下（瓶内预先装入 L05mg4/0L硼酸溶液及混合指示剂2～3滴）。放松夹子，通过漏斗加入70～ mL8004g0/L氢氧化钠溶液，并摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再加入L100m蒸馏水（从漏斗中加入），夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约L205m即可），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1inm，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 将上述吸收液用o01L0l0./m盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量，同时作一试剂空白（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白试验消耗盐酸标准溶液的体积。 （4）结果计算 蛋白质（0gg0/1）= 式中：c——盐酸标准溶液的浓度，ol/mL； V——滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，Lm； 1V——滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，Lm； 2m——样品质量，g； M氮——氮的摩尔质量，oL4/； F——氮换算为蛋白质的系数。 （5）说明及注意事项 ①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。 ②消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未消化完全而造成氮损失。 ③消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。 ④样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不停地摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 ⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～L3m后再继续加热消化。 ⑥若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样L5m的比例增加硫酸用量。 ⑦一般消化至呈透明后，继续消化in30m即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧蒸馏装置不能漏气。 ⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 ⑩硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。 ○11蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸inm1后关掉热源，否则可
能造成吸收液倒吸。 (12)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 2．微量凯氏定氮法 （1）原理 同常量凯氏定氮法。 图21 0- 微量凯氏定氮装置 （2操作方法 样品消化步骤同常量法。 将消化完全的消化液冷却后，完全转入L100m容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。按图10-2装好微量定氮装置，准确移取消化稀释液L10m于反应管内，经漏斗再加入 L10m04g0/L氢氧化钠溶液使呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，夹好漏斗夹，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有 L10mg4/0L（或g0/L2）硼酸吸收液的液面下。蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏in10m后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏in1m，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。 馏出液用ol/10L00m.盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。同时作一空白试验。 （3说明 ①蒸馏前给水蒸汽发生器内装水至/32容积处，加甲基橙指示数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。 ②g2/0L硼酸吸收液每次用量为L25m，用前加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂2滴。 ③在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。 3．自动凯氏定氮法 所谓自动凯氏定氮法，是将常量凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，其原理与试剂与常量法相同，操作方法简述如下。 （1）称取500.～样品，置于消化瓶内，加入硫酸铜与硫酸钾制成的片剂两片，加入浓硫酸L1m0，将消化瓶置于红外线消化炉中。消化炉分成两组，每行一组共4个消化炉。消化瓶放入消化炉后，用连接管连接密封住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉的电源，in30m后8个样品消化完毕，消化液完全澄清并呈绿色。 （2）取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，接连开启加水的电钮、加碱电钮、自动
蒸馏滴定电钮，开启电源，大约经in12m后由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据样品的种类选择相应的蛋白质换算系数F，即可得出样品中蛋白质含量。 （3）开启排废液电钮及加水电钮，排出废液并对消化瓶清洗一次。 大约在2h左右时间内可完成8个样品的蛋白质含量测定工作。该法具有灵敏、准确、快速及样品用量少等优点。 二、双缩脲法 1．原理 当脲被小心地加热至105～106℃时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应如下： HHNOCN +-HO(CN-H)HNHNOCHNOCN + NH 222223 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应： OHOHNH2NH2CuH2NO=CC=OO=CCuSO4NH2NHHNNaOHO=CC=OO=CNH2NH2NaNaH2NOHOH （双缩脲） （紫红色配合物） 由于蛋白质分子中含有肽键（N-OCH-），与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为n506m。 2．方法特点及应用范围 本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。 3．操作方法 ①标准曲线的绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样。按蛋白质含量g4m0、g50m、g60m、g70m、g80m、g9m0、g100m、g10m1分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支L5m0纳氏比色管中，然后各加入L1m四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液准确稀释至L50m，振摇in10m，静置1h，取上层清液离心inm5，取离心分离后的透明液于比色皿中，在56n0m波长下以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。 ②样品的测定。准确称取样品适量（即使得蛋白质含量在40～g10m1之间）于L5m0纳氏比色管中，加L1m四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。 4．结果计算 蛋白质（g/10gm）=
式中 c—由标准曲线上查得的蛋白质质量，gm； —m样品质量，g。 5．说明及注意事项 ①蛋白质的种类不同，对发色程度影响不大。②标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。③含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去。④样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。⑤当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测定值偏低。⑥碱性硫酸铜溶液由olm10.氢氧化钾、5g酒石酸钾钠、61g.硫酸铜溶于水后加水至L100m配成。 三、紫外吸收法 1．Anm光吸收法 028（1）原理 蛋白质及其降解产物（“月示”、胨、肽和氨基酸）的芳香环残基C-[HNH-（R）-OC-]在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用。在此波长（280mm）下，光吸收程度与蛋白质浓度（3～８gm／Lm）成直线关系，因此，通过测定蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所作的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。 （2）适用范围 本法操作简便迅速，常用于生物化学研究工作；但由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收作用，加之光散射作用的干扰，故在食品分析领域中的应用并不广泛，最早用于测定牛乳的蛋白质含量，也可用于测定小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。 （3）操作方法 ①标准曲线绘制：准确称取样品00g2.，置于L5m0烧杯中，加入oLl10/.m柠檬酸溶液L30m，不断搅拌in10m使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以300～in0/50r0m的速度离心5～in10m，倾出上清液。分别吸取50.、、、、、于L10m容量瓶中，各加入ol/L8m尿素的氢氧化钠溶液定容至标线，充分振摇in2m，若浑浊，再次离心直至透明为止。将透明液置于比色皿中，以ol8/Lm尿素的氢氧化钠溶液作参比液，在 208nm波长处测定各溶液的吸光度A。 以事先用凯氏定氮法测得的样品中蛋白质的质量为横坐标，上述吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。 ②样品的测定：准确称取试样0g10.，如前处理，吸取的每毫升样品溶液中含有大约3～g8m的蛋白质。按标准曲线绘制的操作条件测定其吸光度，从标准曲线中查出蛋白质的含量。 （4）结果计算 蛋白质质量分数（%）= 式中：c——从标准曲线上查得的蛋白质质量，gm； m——测定样品溶液所相当于样品的质量，gm。 （7）说明及注意事项 ①测定牛乳样品时的操作手续：准确吸取混合均匀的样品于L25m纳氏比色管中，用95%～%79的冰醋酸稀释至标线，摇匀，以95％～97%冰醋酸为参比液，用1cm比色皿于208nm处测定吸光度，并用标准曲线法确定样品蛋白质含量（标准曲线以采用凯氏定氮法已测出蛋白质含量的牛乳标准样绘制）。 ②测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。 ③温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20～30℃。
2．A和A比值法 n20m602n8m（1）原理 凡是有共轭双键的物质，均具有紫外吸收值。因此，若样品中含核酸，则嘌呤、嘧啶两类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核酸在26n0m处的紫外吸收值大于28n0m处的紫外吸收值，但蛋白质恰恰相反。利用这些性质，通过计算可以适当较正核酸对测定蛋白质浓度的干扰。但是，由于不同的蛋白质和核酸对紫外吸收不同，校正后的测定结果还存在一定的误差。 （2）测定 取一定量的样品稀释液，分别测出样品的A和A，计算出A/A的比值mn20826n0mn20m8n20m6后，从下表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸百分含量。将F值代入，由下述公式可直接算出该样品的蛋白质含量： 蛋白质含量（ Lg/m）=Fd×1×/A×n 0m8n2式中A——该样品液在208nm波长下的吸收值； n20m8 d——石英杯的厚度（cm）； n——样品的稀释倍数。 3．A和A的吸收差法 n25m152n2m对于蛋白质的稀溶液，由于蛋白质含量低而不能使用208nm的光吸收测定，可用n251m和252nm吸收值之差求算蛋白质浓度。 样品测定：取一定量的样品液，以蒸馏水调零，分别测定A和A，并求出差值251nm22n5mA－A，与蛋白质标准溶液吸收差值作对照，求出样品的蛋白质含量。 251nm2m2n5本法在20～g/L001m蛋白质范围内呈良好线性关系。氯化钠、硫酸铵及ol/mL10.磷酸、硼酸和三羟甲基氨基甲烷等缓冲液都无显著干扰作用，但ol0/.L1m氢氧化钠、ol/乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液，在251nm下的吸收较大，必须将其浓度降到ol0/才无显著影响。 4．肽键紫外光测定法 蛋白质溶液在283nm下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，根据这一性质，可测定样品在283nm下的吸收值，与蛋白质标准液作对照，求出蛋白质含量。 本法比20m8n吸收法灵敏。由于醇、酮、醛、有机酸、酰胺类和过氧化物等都具有干扰作用，因此最好用无机酸、无机碱和水作为介质溶液。若含有机溶剂，则可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质，然后用水、稀酸或稀碱溶解后再作测定。在05～g/0L05m蛋白质范围内呈良好线性关系。表210-为紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表。 表1 0-2 紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表。 026/802 核酸质因子026/820核酸质因子026/820核酸质因子量分数（F） 量分数（F） 量分数（F） /% /% /% 6 . 030. 30. 40. 1000. 50. 1020. 50. 1040. 60. 1070.
60. 2000. 70. 70. 注：表中的数值是由结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸的吸光度计算得来的。一般，纯蛋白质的吸光度比值（280/260）约为，而核酸的比值大约为。 四、福林-酚比色法 1．原理 蛋白质与福林（niloF）-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。 2．试剂 ①福林酚试剂甲：将溶液L5A0m和溶液B L1m混合即成。现用现配，过期失效。 溶液A：1g aNCO溶于 L50mol/溶液中。 23溶液B：将%1硫酸溶液和L2g0/酒石酸钠（钾）溶液等体积混合而成。 ②福林酚试剂乙：在体积的磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠（aNOW·2HO）、24225g钼酸钠（aNoOM·2HO）以及L70m0蒸馏水，再加入L8550%m磷酸溶液及L100m浓242盐酸，充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流1h0。回流完毕，加入15g0硫酸锂、L50m蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾in51m，以便除去过量的溴，冷却后加水定容至L10m0，过滤，滤液呈微绿色，置于棕色瓶中保存。使用时用氢氧化钠标准溶液滴定，以酚酞作指示剂，最后用蒸馏水稀释（约1倍左右），使最终浓度为ol0/1L. m① 牛血清蛋白标准溶液：精确称取牛血清蛋白或酪蛋白，配制成100μLm/g溶液。 3．测定 吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲，置于25℃中水浴保温in01m，再加入试剂乙Lm30.，立即混匀，保温in3m0，以介质溶液调零，测定A值，与蛋白质n70m5标准液作对照，求出样品的蛋白质的含量。 本法在0～g/L60m蛋白质范围呈良好线性关系。 4．说明 福林-酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2个数量级。但对双缩脲法有干扰的物质对福林酚法的影响更大。酚类及柠檬酸均对本法有干扰。 五、考马斯亮蓝染料比色法 1．原理 考马斯亮蓝G－250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华引力结合，使蛋白质染色，在n2m06处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单而快速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似，但不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响。 2．试剂 ①牛血清蛋白标准液：精确称取牛血清蛋白g1m0，用蒸馏水配成100μLg/m的标准溶
液。 ②染料试剂：称取考马斯亮蓝20-5G（assico omCbrlnitla uelb 20-5G）g,60m溶于L301%0m过氯酸溶液中，滤去未溶解的染料，贮于棕色瓶中。 3.测定 吸取样品稀释液L2m，加染料试剂L2m，混匀，以介质溶液调零，测定A，与蛋602nm白质标准溶液对照，求出样品蛋白质含量。 本法在0～g/0L01m蛋白质范围内呈良好的线性关系。 六、染料结合法 1．原理 在特定条件下，蛋白质可与某些染料（如胺黑01B或酸性橙12等）定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量可计算出反应消耗的染料量，进而可求得样品中蛋白质含量。 2．适用范围 本法适用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。 3．试剂 ①柠檬酸溶液：称取柠檬酸（含1分子结晶水）421g0.，用水稀释至L100m，加入丙酸（防腐），摇匀后pH应为22.。 ②胺黑10B染料溶液：准确称取胺黑10B染料，用的柠檬酸溶液定容至L100m，摇匀，取出1Lm，用水稀释至L250m，以水为参比液，用1cm比色皿于651nm波长处测定吸光度应为；否则用染料柠檬酸溶液或水进行调节。 4．操作方法 ①样品处理：用组织捣碎机将样品粉碎，准确称取一定量（蛋白质含量在307～g403m），作标样用时称四份（两份凯氏法、两份染料结合法）。如样品脂肪含量高，用乙醚提取脂肪弃去，然后再作试验。 ②染料结合：将脱脂肪后样品全部放入组织捣碎机中，准确加入吸光度为3002.的染料溶液L200m，缓慢搅拌inm4。 ③过滤离心：将结合后的样品溶液用铺有玻璃棉的布氏漏斗自然过滤，或用G熔结玻2璃漏斗抽滤，静置i2n0m，取上清夜L4m，用水定容至L100m，摇匀，取出部分溶液离心in5m（in020m0r/）。 ④比色：取离心后的澄清透明溶液，用1cm比色皿，以蒸馏水为参比液于61n5m波长处测定吸光度。 ⑤标准曲线的绘制：用凯氏定氮法测出上述两份平行样品的总氮量，进而计算出用于染料结合法测定的每份平行样的蛋白质含量，以比色测定得到的吸光度（实质是由沉淀反应后剩余的染料所产生的吸光度）为纵坐标（注意数值最好按从上到下吸光度增大的顺序标出），以相应蛋白质含量为横坐标绘图，即得标准曲线。 该标准曲线供分析同类样品蛋白质含量使用。 ⑥测样：完全按照上述（1）～（4）步骤进行，根据测出的吸光度在标准曲线上查得蛋白质含量即可。 6．说明及注意事项 ①取样要均匀。②绘制完整的标准曲线可供同类样品长期使用，而不需要每次测样时都作标准曲线。③脂肪含量高的样品，应先用乙醚脱脂，然后再测定。④在样品溶解性能不好
时，也可用此法测定。⑤本法具有较高的经验性，故操作方法必须标准化。⑥本法所用染料还包括橙黄G和溴酚蓝等。 七、水杨酸比色法 1．原理 样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，可以在波长60m6n处比色测定，求出样品含氮量，进而计算出蛋白质含量。 2．操作方法 ①标准曲线的绘制：准确吸取每毫升相当于氮含量52.μg的标准溶液0、、、03.、、，分别置于L25m容量瓶或比色管中，分别加入L2m空白酸工作液、L5m磷酸缓冲溶液，并分别加水至L15m，再加入L5m水杨酸钠溶液，移入36～73℃的恒温水浴中加热in15m后，逐瓶加入次氯酸钠溶液，摇匀后再在恒温水浴中加热in15m，取出加水至标线，在分光光度计上于60m6n波长处进行比色测定，测得各标准液的吸光度后绘制标准曲线。 ②样品处理：准确称取～样品（视含氮量而定，小麦及饲料称取样品左右），置于凯氏定氮瓶中，加入L1m5浓硫酸、硫酸铜及54g.无水硫酸钠，小火加热至沸腾后，加大火力进行消化。待瓶内溶液澄清呈暗绿色时，不断地摇动瓶子，使瓶壁黏附的残渣溶下消化。待瓶内溶液澄清后取出冷却，移至L25m容量瓶中并用水稀释至标线。 ③样品测定：准确吸取上述消化好的样液L10m（如取L5m则补加L5m空白酸原液），置于L100m容量瓶中，并用水稀释至标线。准确吸取L2m于L25m容量瓶中（或比色管中），加入L5m磷酸盐缓冲溶液，以下操作手续按标准曲线绘制的步骤进行，并以试剂空白为参比液测定样液的吸光度，从标准曲线上查出其含氮量。 3．结果计算 总氮质量分数（%）= 式中：c——从标准曲线查得的样液的含氮量，μg； K——样品溶液的稀释倍数； m——样品的质量，g。 蛋白质（%）=总氮（%）×F（蛋白质系数，同凯氏定氮法） 4．说明 ①样品消化完全后当天进行测定结果的重现性好，但样液放至第二天比色即有变化。②温度对显色影响极大，故应严格控制反应温度。③对谷物及饲料等样品的测定证明，此法结果与凯氏法基本一致。④试剂配制请参考黄伟坤等编著《食品检验与分析》书。 八、红外光谱法 1．原理 红外光谱法测定由食品或其他物质中分子引起的辐射吸收（近红外、中红外、远红外区）。食品中不同的功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（μm）和近红外（RIN）波段（如3030～30n50m，208～202nm，1506～6017nm）的特征吸收可用于测定食品中的蛋白质含量。针对所要测的成分，用红外波长光辐射样品，通过测
定样品反射或透射光的能量（反比于能量的吸收）可以预测其成分的浓度。 2．应用 红外牛乳分析仪采用中红外光谱法测定牛乳蛋白质含量，同时近红外光谱仪也广泛应用于食品蛋白质的分析中（如谷物、谷类制品、肉类和乳制品中）。这些仪器非常昂贵，且多须经适当的调试。但分析人员只需经最低程度的培训就可以快速分析样品（30s～in2m）。 九、4,4’-二羧基-2,2-联喹啉，choninBiCcA (BicimAcid)法 1．原理 ithSm等人提出，在碱性条件下蛋白质将铜离子，亚铜离子-蛋白质复合物和苹果绿的BCA试剂反应形成浅紫色。反应形成颜色的深浅与一定范围内蛋白质浓度成正比。 2．方法 （1）蛋白质溶液和含有BCA钠盐、aNCO、HOaN、CuSO、p 的BCA试剂234一步混合； （2）在73℃保温in30m或室温下放置2h，或06℃保温3 0inm。温度的选择取决于灵敏度的要求。较高的温度导致较深的颜色反应； （3）在mn625处比色读数，并做空白比较； （4）用ASB（牛血清白蛋白）作标准曲线。 3．应用 BCA法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。 优点：①灵敏度与福林酚法相似。微量BCA法的灵敏度（50.～01μg）稍高于福林酚法；②一步混合的操作比福林酚法更简单；③所用试剂比福林酚法简单；④非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰；⑤中等浓度的变性剂（ol/mL4盐酸胍或ol/L3m尿素）不对反应产生干扰。 缺点：①反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间；②还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大；③不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似；④比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。 十、比浊法 1．原理 低浓度（3%～10%）的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白质沉淀形成蛋白质颗粒的悬浊液。其浊度可由辐射光传送过程中的衰减而确定，辐射光传送过程中的衰减是由于蛋白质颗粒的散射造成的，辐射光衰减的程度与溶液中的蛋白质浓度成正比。 2．方法 测定小麦蛋白质的常规方法为磺基水杨酸法，具体方法如下所述：①小麦面粉用ol/氢氧化钠溶液萃取；②溶碱液的蛋白质从不溶性原料中离心分离；③磺基水杨酸和蛋白质溶液混合；④在504nm处测定其浊度，并扣去空白；⑤蛋白质的含量可根据凯氏定氮法校正过的标准曲线来计算。 3．应用 比浊法已经用于测定小麦面粉和玉米的蛋白质含量。
优点：①快速，可在in1m5内完成；②测定结果不包括除了核酸外的非蛋白质含量。 缺点：①不同的蛋白质沉淀的速率不同；②浊度随酸试剂浓度的不同而变化；③核酸也能被酸试剂沉淀。 十一、杜马斯法（燃烧法） 1．原理 样品在高温下（700～800℃）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD）的气相色谱仪测定。测得的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。 2．方法 样品（100～g500m）称量后置于样品盒中，放入具有自动装置的燃烧反应器中，释放的氮气由内置的气相色谱仪测定。 3．应用 燃烧法适用于所种类的食品，AOCA方法和分别用于肉类和谷物食品。 优点：①燃烧法是凯氏定氮法的一个替代方法；②不需要任何有害化合物；③可在in3m内完成；④最先进的自动化仪器可在无人看管状态下分析多达105个样品。 缺点：①需要的仪器价格昂贵；②非蛋白氮也包括在内。 第四节 蛋白质的末端测定 一、-N末端测定—丹磺酰化法 1．原理 蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯（-SCNlD）反应，生成-SND蛋白质，经水解可生成-SND氨基酸。通过分析-SND氨基酸，可确定蛋白质的-N末端氨基酸。 2．操作步骤 (1)氨基酸的丹磺酰化 分别称取32.μolm层析纯的各种氨基酸，溶于 于具塞玻璃试管中，加入 -SND丙酮溶液，检查pH，必要时用三乙胺调pH ～59.，于室温（25℃左右）下放置2～h4。再用去离子水稀释01倍，贮存于暗处。经层析，得-SND氨基酸的标准图谱。 (2)蛋白质-N末端氨基酸的SND化 取蛋白质（胰岛素B链或其他纯蛋白质）样品，置于具塞玻璃试管中。用少量水溶解后，加入 -SND丙酮溶液（称取丹磺酰氯g205m溶于L100m丙酮之中，贮于棕色瓶，置冰箱保存，一个月内稳定。），用三乙胺（重蒸后）调至p H09.～，塞好塞子，于40℃烘箱中反应2h，或室温（25℃左右）放置2～h4，生成-SND蛋白质。 -SND)3(蛋白质的水解 SND化反应结束后，真空蒸去丙酮，加入
-SND)4(氨基酸的抽提 将上述水解产物，加Lm50.水，用ol1/mL盐酸调至p2H～3。加入乙酸乙酯抽提，分层可在细长滴管中进行。重复抽提2～3次，将上层抽提液合并于小试管中，抽去乙酸乙酯，置于干燥器中备用。 -SND)5(氨基酸的层析与检测 样品生成的-SND氨基酸和标准-SND氨基酸分别进行聚酰胺薄膜层析。 将图谱用nm036或280nm波长的紫外灯检测。比较样品-SND氨基酸和-SND氨基酸的层析图谱，从而确定蛋白质样品的-N末端氨基酸。（若用胰岛素B链，其-N末端氨基酸为苯丙氨基酸。） 二、蛋白质及多肽-C末端测定及顺序分析（羧肽酶法） 1. 原理 蛋白质或多肽及其裂解片段，一般均先进行末端基测定，然后再进行顺序分析，C-末端的测定方法很多，如化学法中的肼解法、还原法、乙内酰硫脲法、同位素标记法以及羧肽酶法等。通常C-末端基的测定要比-N末端基的测定困难，特别是C-末端基的化学测定法效果较差。目前普遍采用羧肽酶法进行C-末端基的测定及C端氨基酸顺序分析，故羧肽酶法至今仍是测定肽链C端比较有效的手段。羧肽酶是一类外肽酶，这些酶与蛋白质或多肽作用时，能从C-末端氨基酸残基开始顺序降解，并逐个释放出游离C端氨基酸。 目前常用的羧肽酶有羧肽酶A-、羧肽酶B-、羧肽酶C-和羧肽酶Y-（分别简称ACP、BPC、CPC和YPC），其中ACP使用最广泛。也有将ACP与BPC混合作用，以此扩大酶解作用的范围，效果较好。YPC则具有更广的作用范围，包括释放C-末端orP的特殊功能，因此，它适用于降解所有的氨基酸，在多肽或蛋白质的结构研究中是一种非常重要的工具酶。 蛋白质或多肽在羧肽酶的作用下，被逐步降解及释放的氨基酸种类和数目随时间而发生变化，将经过一定间隔时间反应的样品分别取出，进行酸化失活处理后可用自动分析仪或CLPH仪进行快速测定，根据不同时间取样的分析结果便能初步确定C-末端基为何种氨基酸。若以酶作用时间为横坐标，对所释放的各氨基酸量（oLl/m）为纵坐标作图，然后根据氨基酸释放的动力学曲线即可进一步判断和确定肽链C端的氨基酸顺序。 在用羧肽酶测定C-末端基时，关键在于测出第一个释放的为何种氨基酸，如果C端第一个氨基酸残基降解的速率很慢，而第二个残基降解的速率则非常快时，这样就很容易得出错误的结论。一般最好采用两种以上C-末端测定方法，进行比较和验证才稳妥可靠。由于酶解反应是连续进行的，很难加以控制。如果几个氨基酸以相近的速率降解时，以及几个相同的氨基酸顺序毗邻排列时，结果就难以确定。这些都是C-末端分析的缺点，有待改进和完善。 2．试剂 ①羧肽酶Y（－20℃保存） ②牛胰核糖核酸酶A（RNase A） ③降解缓冲液（又称消化液） 称取g1纯SDS和亮氨酸，定容于 L01m0ol/.L10m吡啶-醋酸缓冲液中（p ） 3．操作步骤 (1)酶液和样品溶液的制备 ①酶液的配制 将gCPY1m溶于 ②样品溶液的准备
称取适量RNaseA或其他蛋白质，加降解缓冲液溶解，配制成～μol/mL蛋白质样品溶液。然后置于60℃恒温水浴箱中保温in2m0，使蛋白质变性（小肽或肽片段无须进行变性处理），冷却至室温备用。 (2)样品的酶解 取上述蛋白质样品溶液002μL放入干净的具塞试管中，留下25μL样品于另一干净小试管中作空白对照用。然后向样品液中加入5μ L YCP酶液，迅速混匀并开始计算反应时间，盖上塞子后室温放置或于25℃恒温水浴中进行酶解反应。按一定时间间隔（如in1m，in2m，in5m，i1n0m，in2m0，i3n0m及h1等）分别快速取出52μL酶解液放入小离心管中，为了终止酶解反应，立即加入5μL冰醋酸到取出的样品液中，混匀。或用 ol/L1mlCH溶液酸化至p H02.，再加热inm5（60℃以上），使YPC彻底失活。低温离心除去沉淀，上清液留待进行氨基酸分析。 (3)氨基酸分析 取上清液用自动氨基酸分析仪进行氨基酸定性或定量测定。若不能立即分析，必须将上清液样品冷却干燥后，置1～02℃低温冰箱中保存。如果再取出无需另作处理，可按氨基酸分析仪灵敏度配制溶液上样直接进行测定。样品中含有少量SDS既不影响洗脱曲线的图形也不损害氨基酸分析仪。 在进行蛋白质或多肽C-末端氨基酸顺序分析时，鉴于操作上或其他原因，往往会出现被分析的各个氨基酸的实际释放量与测定值有偏差。为了比较准确测定在规定酶解时间内所释放的每个氨基酸摩尔数，通常在酶解液中加入一种已知量（ol/Lm）的非蛋白质氨基酸类似物作为内标，即用亮氨酸来进行校正，可按下列公式进行计算： 亮氨酸实际值释放的氨基酸实际值= 释放的氨基酸测定值×亮氨酸测定值4．实验结果 ①动力曲线的绘制 依据自动氨基酸分析仪测定所提供的数据，以酶解时间为横坐标，对不同时间所释放的各种氨基酸相应的量（ol/mL）为纵坐标作图，绘制出氨基酸释放的动力学曲线图。 ②C-末端分析结果 根据上述氨基酸释放的动力学曲线分析，判断和确定被测蛋白质的C-末端为何种氨基酸，并写出其C-端氨基酸排列顺序。 第五节 氨基酸的定性测定 一、氨基酸的一般显色反应 本节介绍三种显色反应：茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法，具有灵敏度高的特点。 1. 茚三酮法 显色方法有下列数种： ①常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用5Lg/茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，置65℃烘箱中约i3n0m（温度不宜过高，避免空气中氨，以免背
景泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。 为了使各种氨基酸呈现不同颜色，可用下列方法： ②用40g.茚三酮，1g0酚和9g0正丁醇的混合液显色。 ③用/1Lg茚三酮无水丙酮溶液显色完毕后，再用盐酸蒸汽熏in1m。 ④用1g茚三酮，L600m无水乙醇，L020m冰醋酸及L2,4,68-0m三甲基吡啶混合液80℃染色5～inm01。 为了使显色稳定，可用下列方法： ⑤配制含醋酸镉g2加蒸馏水L200m及冰醋酸L4m0的贮存液。将上述贮存液加L200m丙酮及2g茚三酮，即为显色液。点有样品的滤纸上浸有此显色液后，放置于盛有一小杯浓硫酸的密闭玻璃容器中，25℃，18h，或较高温度下适当缩短时间。背景色浅，氨基酸斑点也比较稳定。 ⑥用含o/2LCgCl(或OuSC)的g/4L茚三酮异丙酮溶液显色时，氨基酸斑点呈红色，也24可在茚三酮显色后喷以含钴、镉或铜等无机离子的异丙醇溶液，斑点自蓝紫色变成红色。 2．吲哚醌法 （1）原理 各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。氨对吲哚醌显色没有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色只有在绝对干燥的环境中才能保存。 （2）试剂 ①显色剂：g1吲哚醌溶于L100m乙醇及L10m冰醋酸中（若冰醋酸用量减少则灵敏度稍差）。 ②底色褪色剂：在 L01m0/02Lg0碳酸钠溶液中加入6g0硅酸钠（aNOiS·9HO）在水232浴（60～07℃）中加热搅拌直至完全溶解，待溶液比较清澈为止。在溶解过程中，有时硅酸钠会结成凝胶，此时只需继续搅拌即可溶解。配制时若硅酸钠用量多则褪色较快，但背景容易变黄，硅酸钠用得少（4g0），虽裉色较慢，但背景较为洁白。 显色步骤 层析或电泳后滤纸烘干后，仔细喷上或涂上显色剂，用电吹风迅速吹干，待醋酸气味不太刺鼻时移置100℃烘箱烘5～i1n5m，直至显色为止（温度不要太高，以免引起减色）注意观察所显出的颜色，然后均匀地涂上底色褪色剂，纸的背景即由黄色变为绛红而后逐渐变浅，待黄色背景几乎褪尽时，迅速用电吹风吹干，并随时观察颜色的变化。例如苏氨酸在褪色前为浅红带褐色，褪色后则呈橙黄色或黄色：脯氨酸在褪色前为蓝色，吹干时很快褪成无色。室温较低时，底色褪色很慢，此时可将褪色剂加温到30～40℃。温度过高也不宜，因氨基酸斑点的褪色速度也同时加快，应该避免。 其他显色步骤：显色剂为1g吲哚醌，醋酸锌溶解于70～L80m热异丙醇中，冷却后加L1m吡啶。或者1g吲哚醌，醋酸锌溶解于L95m热异丙醇中，加L3m水，冷却后加L1m冰醋酸。点有样品的滤纸仔细喷以显色剂后，80～85℃放置in10m，背景可用水迅速浸洗去而不使氨基酸斑点退去 由于吲哚醌试剂配制方法不同，对同一种氨基酸所显颜色往往也有差异。 3．邻苯二甲醛法 邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。根据文献报道，氨基酸纸上层析灵敏度达μoLm，在硅胶薄层层析上为～20.μoLm。这里介绍在纸上层析显现氨基酸方法。（荧光胺是另一种常用的荧光试剂，由于荧光胺来源
比较困难，这里未作介绍） （1）原理 邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为30m4n和455nm。 各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，HN，脯氨酸和半胱氨酸。 3（2）试剂 邻苯二甲醛显色液：取邻苯二甲醛，巯基乙醇，1Lm三乙胺，加丙酮+石油醚（60℃～09℃）（1+1）的混合溶剂至L100m。放置50h.后使用。 显色步骤 将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中in1m，冷风吹干，在温度18℃以下，湿度5%0～0%9之间显色，于紫外灯下观察荧光点。 说明 在滤纸上显现氨基酸时，邻苯二甲醛浓度以0%.1为宜。显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解，提高分子碰撞机率，并使极性基团解离，促进反应趋于完全。湿度太低，显不出荧光。温度对显现的荧光延时有显著影响，温度高荧光延时短，温度低荧光延时长。 二、个别氨基酸的显色反应 利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电泳显色，也可单独应用。方法很多，仅将常用的方法介绍如下： 1．精氨酸的显色——坂口（Sakaguchi）反应 (1)第一种方法 试剂：①5g尿素溶解于 HOK。②溴水溶解于 Lm100HO5a%N中。 显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂①后，在空气中吹几分种，再喷试剂②。精氨酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。 (2)第二种方法： 试剂：① 1Lg/8-羟基喹啉的丙酮溶液。②溴水溶解于 显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂①，吹干后，再喷试剂②。精氨酸或其他胍类物质显桔红色。 2．胱氨酸和半胱氨酸的显色 试剂：①亚硝基铁氰化钠（aN)NC(eFON·H5O）溶于 Lm5 ol/L2mHOS溶液25222 4中，加L95m甲醇。此时会有沉淀产生，可保存一个月以上。使用时在每L100m上述溶液中加 L10m82%氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持一天左右。②2g氰化钠溶于L5m水中，然后加L95m甲醇。此时有沉淀产生，使用时只需摇匀即可。 显色步骤：半胱氨酸的显色：在滤纸上喷以试剂①的清液，in5m后半胱氨酸显红色。 胱氨酸的显色：先将滤纸浸入试剂②，迅速取出，稍等片刻再喷试剂甲的清液，inm5后胱氨酸显红色。也可以把试剂②配制的浓度增加一倍，在显色前混和，再喷到滤纸上。
3．甘氨酸的显色 试剂；邻苯二甲醛溶于 L100m77%乙醇中。 显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（n356m）下显巧克力棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍有效。以甘氨酸为N端的小肽也能显色，但其N端被保护后，以及其他氨基酸均不显色。 4．脯氨酸的显色 试剂：1g吲哚醌和51g.醋酸锌，1Lm醋酸，L5m蒸馏水混和，再加入L59m异丙醇。新鲜配制。 显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上以上试剂，80℃～85℃烘箱内放置in30m，脯氨酸显蓝色，再以30℃温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。 也可剪下脯氨酸斑点，在试管中加入L5m水饱和酚，在黑暗中洗脱in1m5，间歇振摇，于601nm测定其吸光度。从已知标准曲线即可求得样品内脯氨酸含量，测定范围5～02μg。 5．丝氨酸和羟赖氨酸的显色 试剂：①ol50/过碘酸钠（agIN8O74m溶于数毫升甲醇中，加2滴oLl6/m盐酸，4再用甲醇稀释至L100m）。②1g5醋酸铵加冰醋酸，加Lm1乙酰丙酮，用甲醇稀释到L100m。 显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂①，近干后再喷试剂②，室温放置2h，紫外灯下照射，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。 6．羟脯氨酸的显色 试剂：①1g吲哚醌溶于L010m乙醇及L10m冰醋酸。②1g对二甲胺苯甲醛溶于Lm010的丙酮浓盐酸（9＋1）混合液中。（此试剂不稳定，隔数日后溶液颜色增深发黑，灵敏度降低，故用时新鲜少量配制。 显色步骤：将待鉴定的溶液点于小方块纸上，干后先点上试剂①，热风吹干。这时纯羟脯氨酸呈墨绿色，纯脯氨酸呈深蓝色（极灵敏），对其他氨基酸呈程度不同的紫红色（不太灵敏）；然后再点上试剂②吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色，而其他氨基酸与吲哚醌所生成的颜色则褪去。 7．色氨酸的显色 (1)第一种方法 试剂：1g对二甲氨基苯甲醛加L90m丙酮，L10m浓盐酸。新鲜配制。 显色步骤：点有样品的滤纸干燥后，喷上以上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸显蓝色或紫红色。茚三酮显色后，仍可使用本法。 (2)第二种方法： 试剂： L10m35%甲醛加L2051%m盐酸，L20m无水乙醇。 显色步骤：点有样品的滤纸喷上以上试剂后，100℃烘in5m，色氨酸在长波长紫外光下呈现荧光（黄-橙-带绿色）。 8．酪氨酸的显色 试剂：①0%.1α-亚硝基β-萘酚的9%5乙醇溶液。②10%硝酸水溶液。 显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂①后，吹干，再喷试剂②，然后在100℃烘inm3，酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，后转变为桔红色，其后渐退去。
灵敏度1～2μg酪氨酸。茚三酮显色后，再用此试剂处理，仍能显色，茚三酮所显出的紫红色斑点变成红色。 9．酪氨酸和组氨酸的显色——playu反应 试剂：①对氨基苯磺酸与 L45mol2/1Lm盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至L500m。用时取出L3m0，在0℃与等体积的%5亚硝酸钠水溶液相混合。（室温放置太长会失效） ②10%碳酸钠水溶液。 显色步骤：点有样品的滤纸上喷试剂①，片刻后再喷试剂②。组氨酸及含组氨酸的多肽显桔红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。 第六节 氨基酸定量测定 一、氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法 1．原理 氨基酸具有酸性的OOC-H基和碱性的HN-基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内2盐。当加入甲醛溶液时，HN-基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱2溶液来滴定HOOC-基，并用间接的方法测定氨基酸总量。反应式（有三种不同的推论）如下： 2．方法特点及应用 此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。 3．操作方法 吸取含氨基酸约g20m的样品溶液于L100m容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取L200m.置于L200m烧杯中，加水L60m，开动磁力搅拌器，用oL0l5./0m氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示，记录消耗氢氧化钠标准溶液Lm数，供计算总酸含量。
加入甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。 同时取L80m蒸馏水置于另一L200m洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至p8H．2，（此时不计碱消耗量），再加入中性甲醛溶液，用o0l5./0Lm氢氧化钠标准溶液滴定至2p9H.，作为试剂空白试验。 4．结果计算 氨基酸态氮质量分数（%）= 式中：V——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（）所消耗氢氧化钠标准溶液1的体积，Lm； V——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，Lm； 2 c——氢氧化钠标准溶液的浓度，ol/Lm； m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g； ——氮的毫摩尔质量，oLmmg/。 5．说明 ①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。 (二)茚三酮比色法 1．原理 氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。 该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为507nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。 2．操作方法 (1)标准曲线绘制 准确吸取200μg L/m的氨基酸标准溶液00.、50.、、51.、02.、、L03m.（相当于0、100、002、300、400、500、600μg氨基酸），分别置于L52m容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为，然后加入茚三酮溶液（2/0Lg）和磷酸盐缓冲溶液（pH为）各L1m，混合均匀，于水浴上加热in15m，取出迅速冷至室温，加水至标线，摇匀。静置i1n5m后，在5m7n0波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。 (2)样品测定 吸取澄清的样品溶液1～L4m，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸微克数。 3．结果计算 氨基酸含量（g/10gm）= 式中：c——从标准曲线上查得的氨基酸的质量数，μg； m——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。 4．说明及注意事项 ①通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品5～g01或吸取样液样品5～L0m1，置于烧杯中，加入L50m蒸馏水和g5左右活性炭，加热煮沸，过滤，用03～L04m热水洗
涤活性炭，收集滤液于L010m容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。 ②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，具体操作可参阅黄伟坤等编著《食品检验与分析》。 (三)非水溶液滴定法 1．原理 氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现中性，而在冰醋酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。 _CHCOOH +RCHRCH3COOCOOH +CH3COOH+NH2NH3_+CH3COOH2ClO4HClO4++CH3COOH_++CH3COOCH3COOH22CH3COOH_RCHCOOH +COOH +HClO4RCHClO4+NH2NH3 本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸 2．测定 (1)直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品g5m0左右，溶解于L20m冰醋酸中，加2滴甲基紫指示剂，用ol/0L010m.高氯酸标准液滴定（用L01m体积的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸液，滴定至同样终点颜色。 (2)回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品30～g40m左右，溶解于 3．说明 (1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。 (2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于Lm2甲酸中，再加L20m冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。 (四)邻苯二甲醛法TPO(法 )1．原理 邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为304和455nm。可能产物为：
OHCH2CHOHCH2 SHSCH2CH2+OHH2NCCOOH+HCHORCOOHNCR 各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天门冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，HN，脯氨酸，和半胱氨酸。 3本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法约高100倍以上，可测到～－410×1olm氨基酸。如用于血清中α-氨基氮的测定，每次血清用量只需5～10μL。与另一种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已有用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。 (五)三硝基苯磺酸法 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物，如下式所示： RNO2NO2 R--CNHCOOOH Naso 3 CHOOCNO+NOHN+222 -Hso3HNONO22NO2 R+H + NaHSONHCOOHC3 NO2HNO2 中间络合物在光谱上有二个吸收值相近的高峰，分别位于n35m5和420nm附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（-PNT氨基酸），402nm处的吸收值显著下降，而305nm附近的吸收峰则移至30m4n处。 利用TNBS与氨基酸反应的这一特性，可在n40m2处（偏碱性溶液中）或在304nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。下表列出各种氨基酸与TNBS反应后在不同条件下测定的吸光度。在n4m03处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在n40m2处的吸光度－2因氨基酸种类而异；在加入适量OS时，吸收值升高。 3本法允许的测定范围是～40.μolm氨基酸。 表310-各种氨基酸与TNBS反应后在不同条件下测定的吸光度 ①－②③ 2氨基酸种类 碱性溶液酸性溶液加OS 酸性溶液 3甘氨酸 丙氨酸 甲硫氨酸
缬氨酸 亮氨酸异亮氨酸 苏氨酸丝氨酸 天冬氨酸谷氨酸 天冬酰胺谷氨酰胺 酪氨酸苯丙氨酸 色氨酸沉淀 组氨酸 赖氨酸沉淀 精氨酸 α-N-苄氧羰酰-赖氨酸 沉淀 脯氨酸 00 α-N-苄氧羰酰-赖氨酸 0 0 ①取不同含量氨基酸液Lm1，加OCHaN%4 Lm1，%TNBS 1mL，于40℃反应2h，用水补充至Lm4，3在420nm处测定。制作氨基酸浓度—吸光度坐标图，从曲线中求得各氨基酸于1μmol时的吸光度。 ②条件同上，但在与SBNT反应时加 Lm1，最后总体积也是Lm4，同样在420nm处23测定。 ③条件同①，但与SBNT反应后加 1mol/LHCl 1mL酸化，在340nm处测定。 (六)乙酰丙酮和甲醛荧光法 1．原理 氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成-N取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基41-,二氢吡啶，产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。主要反应如下： OOH3CCOOH3CNH2CCH3CCH3CCH2HCHOHOOCC+R++CH2H3CCOOCCH3CH3H3CN 乙酰丙酮 甲醛 氨基酸 荧光物质 2．试剂 混合试剂：取ol1/Lm乙酸钠溶液L10m，加入乙酰丙酮溶液和30%甲醛溶液L1m，用水稀释至L03m。 3．测定 取氨基酸液Lm1，加入混合试剂L1m，用棉花塞满试管口，避光于100℃下加热in10m，冷却，加水Lm2，然后测定荧光值。 表1 0-4各种氨基酸的发射波长和检测范围
化合物（激发波长45m0n） 发射波长（mn） 检测范围（g/Lm） 甘氨酸 4582～01 苯丙氨酸4098～04 丝氨酸4585～52 半胱氨酸（盐酸盐） 500 20～100 谷氨酸 45820～100 与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。 二、个别氨基酸的定量测定 （一）赖氨酸的测定 1．原理 用铜离子阻碍游离氨基酸的α-氨基,使赖氨酸的ε-氨基可以自由地与1-氟-2,4二硝基苯BNDF)(反应,生成ε-DP-N赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长309nm处有吸收峰,从而求出样品中游离赖氨酸的含量. 2．试剂 (1)氯化铜液：称无水氯化铜，用水稀释至L010m。 (2)磷酸三钠溶液：称无水磷酸钠,用水稀释至L100m。 (3)硼酸盐缓冲液（～）：称4465g.带有01结晶水的四硼酸钠，用水稀释至 L100m。 (4)磷酸铜悬浮液：搅拌情况下，把氯化铜液Lm020，缓慢倒入400 Lm的磷酸三钠溶液中，把悬浮液以02i00nr/m速度离心inm 5，用硼酸盐缓冲液再悬浮沉淀物，洗涤离心3次，把最后的沉淀物悬浮在硼酸盐缓冲液中，并用缓冲液稀释至1L。 (5)1-氟2-，4二硝基苯DF()BN溶液：吸取1B0NLDmF用甲醇稀释至L100m。 (6)赖氨酸-HCl标准溶液：称取一定量赖氨酸lCH-，用水配成g/02L0m的工作标准液。 (7)L1g0/0丙氨酸溶液。 3．测定 (1)称取通过40目筛的均匀试样0g10.，置于L100m烧瓶中。另吸取赖氨酸lCH-标准工作液L5m（相当g1m赖氨酸lCH-），连同试剂空白同时进行试验。 (2)向各烧瓶中加入L25m磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸L,振摇in15m。吸取1B0%NFD溶液置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热in15m。 (3)取出烧瓶,立即加入ol1/mLCH溶液L,25m并不断摇动使之酸化和分散均匀。 (4)烧瓶中的溶液冷却至室温,用水稀释至取约L40m悬浮液进行离心。 (5)用L25m二乙基醚提取上清液3次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65℃水浴中加热in51m，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。 (6)吸取上述各处理液L1m0，分别与95%乙醇溶液L10m混合，用滤纸过滤。 (7)用试剂空白液凋零，测定样液A，与赖氨酸lCH-标准液对照，求出样品中赖氨309nm酸lCH-的含量。 本法在0～g/mL04赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。 4．说明 (1)添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸lCH-浓度具有良好的线性关系。 (2)用醚提取酸性溶液，可将所有中性或酸性的-PND氨基酸衍生物除去，并把WDFB
的产物破坏，否则这些产物在30m9n处存在干扰。 （二）色氨酸的测定 1.原理 样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生成哈尔满化合物（ananorrmh），具有特征荧光值，可以进行定量测定。反应式如下： HCHOCH2CHCOOHCH2CHCOOHNNH2NNCH2HCOOH-H,CO2NNNHNHH 2．试剂 (1) (2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～L5)%，加水至L100m。 (3)色氨酸标准溶液：称取g10m色氨酸，用 3．测定 称取样品粉末100～gm020于离心管中，加入4Lm乙醚,摇匀后过夜，以in300r0/m速度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3次，收集乙醚液于试管中，于40℃水浴除去醚。残留物中加入 ol/ N aHO4Lm，火焰封口，于101℃水解16～2h4。水解液用 ol/L4mClH溶液调节至p6H～8后,用水定容至L,50m过滤备用。 吸取滤液，加入2%甲醛和ol/三氯化铁-三氯乙酸混合液L2m，摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至L1m0。在激发波长为35m6n，发射波长49m4n条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。 本法在0～g/mL01色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。 （三）苯丙氨酸的测定 1．原理 苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激发波长356nm，发射波长409nm处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。 2．试剂 试剂均用分析纯试剂和玻璃器重蒸水配制。 (1)二肽-茚三酮试剂 ①ol/L5mm亮丙二肽溶液：称取L-亮氨酰-L-丙氨酸g1m，溶于L1m水中，临时配制。 ②ol/m3L0m茚三酮溶液：称取茚三酮g543m，溶于L100m水中，冰箱贮存。 ③ol0/.L6m琥珀酸盐缓冲液：称取琥珀酸g06,78.加水约L25m，用 ol/溶液调至8p58H.,加水至L,01m0冰箱贮存。
临用前3种溶液按顺序以21++5（体积比）混合。 (2)铜试剂 ①ola2m/5LNmCOolm./4Lm0-酒石酸钾钠溶液，称取无水碳酸钠6g26.，酒石酸钾钠（含234份结晶水）g13m1，加水至L. 010m② ol/溶液 临用前将①、②两溶液按23+（体积比）混匀。 ol(/3L)三氯醋酸溶液：称取三氯醋酸9g8溶于1L水。临用前取ol60/.Lm三氯醋酸稀释01倍，得ol/的溶液。 (4)标准苯丙氨酸溶液：称取苯丙氨酸配制成g/Lm66.的氨基酸标准液。 3．测定 （1）血清的去蛋白处理：吸取新鲜血清50～100μL和等体积ol/L60m.三氯乙酸溶液混匀，静置in01m后，以in0400r/m速度离心in10m，吸取上清液用水精确稀释5倍。 （2）样品测定：吸取血清稀释液100μL，置于样品管中，另吸取苯丙氨酸标准液25μL，加olm/三氯乙酸溶液100μL，然后两管均加水至200μL，同时作试剂空折。再向各管加入二肽-茚三酮。放在75℃水浴中保温in80m（或65～70℃，保温约in104m）。取出冷却，加入铜试剂，振摇均匀，i9n0m内在激发波长为35m8n，发射波长427nm条件下，测定样品的荧光值，与苯丙氨酸标样作对照，求出样品游离苯丙氨酸的含量。 4．计算 f1−f0m'苯丙氨酸含量（g/Lm）=× f2−f0m式中：f为检样荧光值；f为标样荧光值；f为试剂空白荧光值；’m为标样氨基酸质量120（gm）；m为样品质量，gm。 5．说明 (1)反应的温度、时间对荧光物质的生成有显著影响。60℃保温in01m2所得相对荧光值较低，苯丙氨酸含量略高时，测定值容易参差不齐，低于60℃相对荧光值更低，实验更加不稳定。将温度提高至576-0℃相对荧光值增高，保温约in104m以后荧光值不再显著增高，此时的测定值约为60℃保温in120m时的两倍。将温度提高至75℃，相对荧光最高值提前在in80m左右出现，维持半小时左右后逐渐减退。80℃以上相对荧光值显著降低，最高值更早出现。 (2)荧光物质的稳定性：从保温完毕加入铜试剂后算起，相对荧光值约稳定in90m，以后逐渐下降。 (3)苯丙氨酸和茚三铜、铜盐作用的产物如果没有二肽存在几乎没有荧光产生。能促使产生荧光的二肽甚多，以L-亮-L-丙二肽的荧光值为100%，则甘-L-丙为95%，甘-Ld-苯丙为75%，L-丙-L-丙为70%，L-丙-甘为30%，甘L--色为28%。这些二肽单独和茚三酮作用都不显荧光，在p H85.时，除苯丙氨酸外,只有亮氨酸和精氨酸产生荧光,相当于等当量苯丙氨酸的4%，除此以外其他氨基酸均小于50%.，可以认为对苯丙氨酸有较好的专一性。 (4)反应溶液的pH低于，产生的荧光较低，pH大于85.荧光增加，在p H86.时达到最高值，但专一性下降。由于蛋白质沉淀三氯醋酸对pH有较大影响，应该严格限制用量，在实际操作中血清用量应限于10μL，用量过大会使三氯醋酸用量也相应增多，除非用适量氢氧化钠中和，否则使荧光值降低甚至消失。 （四）酪氨酸的测定 1．原理
酪氨酸和1-亚硝酸-2-萘酚反应,生成有色化合物,此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条件下加热,产生稳定的荧光物质,可用荧光法定量测定。 2．试剂 试剂均用分析纯和玻璃器重蒸馏水制备。 (1)亚硝酸萘酚试剂 ①1-亚硝酸-2-萘酚乙醇溶液：称取1-亚硝酸-2-萘酚g20m，溶于L100m无水乙醇，于4℃下保存。 ② ol/L3mHNO溶液。 2③ ol/溶液，于4℃下保存。 2临用前将①、②、③三种溶液按(2+3+3)体积混合。 （2）ol/三氯醋酸溶液：称取三氯酸酸9g8溶于1L水中。稀释01倍即得ol/。 （3）21,二氯乙烷（HClCCHlC） 22(4)标准酪氨酸溶液（g/）:称取L-酪氨酸，先加入数滴浓盐酸，微热完全溶解后，加水至L10m，用氢氧化钠溶液中和到近中性，定容至L,01m0置冰箱保存。临用时吸取贮存液Lm2，定容至L50m。 3．测定 (1)样品去蛋白处理：吸取新鲜血清05～010μL和等体积ol/mL60.三氯醋酸溶液混匀，in0400r/m离心in10m，吸取上清液用水精确稀释5倍，即得稀释01倍的样品溶液。 (2)样品测定：分别吸取样液100μL于具塞试管1；标准酪氨酸溶液25μL和ol/三氯醋酸溶液100μL于具塞试管2；ol/三氯醋酸溶液010μL于具塞试管3；各管用水补充容积至200μL。 将各管置于55℃水浴数分钟，加入新配制的亚硝酸萘酚试剂L,摇匀，55℃保温in20m，保温后加水，摇匀后再加三氯乙酸溶液L3m。充分振摇以便将多余的试剂抽提入二氯乙烷溶液中，in0400r/m离心in10m，将上层水溶液移至另一试管内，在i8n10m内，于激发波长为,486nm发射波长为nm55处，测定样品的荧光强度，与氨基酸标样对照（消除试剂空白荧光值），求出样品氨基酸含量。 本法在0～ol2/酪氨酸范围内呈良好的线性关系。 4．说明 (1)荧光物质的稳定性：从保温完毕算起，相对荧光值在inm018内平均减少2%左右。 (2)酪胺的存在对荧光光度测定存在干扰，色氨酸、色胺、苯丙氨酸、5-羟色氨酸，5-羟吲哚乙酸均有轻微的荧光值。 （五）脯氨酸的测定 1．原理 在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在一定条件下（包括pH、缓冲液浓度和吲哚醌浓度），可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。 2．试剂 )1(的柠檬酸盐缓冲液：柠檬酸12g.，用 ol/1LmNaOH溶液调，并加水至l100m。pH计检测（可用 ol10/.LmClH溶液调节）。 (2) (3)水饱和酚溶液：于分液漏斗内加入酚及水，剧烈摇动后，放置过夜分层，取下层酚溶液。
3．测定 称取蛋白质样品g5m（视样品含量而定），加 ol/Lm6lHC溶液L2m，封管后于104℃水解4h。启封，加蒸馏水稀释至盐酸浓度达o20l5./mL。 吸取一定量蛋白质酸水解液～(含脯氨酸～5μ)g于小烧杯内，75℃干燥至恒重。残留物加9p3H.柠檬酸缓冲液L,使残留物完全溶解后，加.L7g05/吲哚醌丙酮溶液L,混匀，于100℃烘箱内使溶剂蒸发50h.左右。以下各步聚在避光条件下操作。先加水饱酚溶液，剧摇后，加Lm1蒸馏水和L2m丙酮，混匀成均相溶液，立即于波长589nm的条件下，以试剂空白调零，测定样品的Anm，与氨基酸标准对照，求出样品中589脯氨酸的含量。 本法在0～g/mL01氨基酸溶液范围内呈良好线性关系。 4．说明 (1)要获得最佳的灵敏度及专一性，必须严格控制本法所规定的条件，即控制缓冲液ol/0L.,913pmH，吲哚醌浓度g70/。 (2)脯氨酸与吲哚醌形成的蓝色化合物见光不稳定，在一般实验室光照下，1h后吸光值下降2%6，必须避光操作。 (六)羟脯氨酸的测定 1．原理 羟脯氨酸在有过量丙氨酸（其作用是减少其他氨基酸的干扰）的条件下，用氯胺T氧，化生成△-吡咯啉-4-羟-2-羧酸和吡咯-2-羧酸，它们不溶于甲苯，但将溶液加热处理后可溶于甲苯中。所以在加热前先用甲苯除去其他物质，加热后再用甲苯把这些氧化产物抽提，最后用对-二甲基苯甲醛试剂显色。在波长506nm处有最大的吸收值，可进行定量测定。 2．试剂 (1) ol/氯胺T试剂：称取氯胺 T4g11.，溶于不含过氧化物的甲基溶纤剂（ethmy oceslolve）L52m中。新鲜配制。如有大量泡沫表示溶剂不纯。 (2) Lol/硫代硫酸钠溶液：称取硫代硫酸钠（含五份结晶水），用水L10m0溶解。加甲苯一层保存。 (3 )对-二甲基氨基苯甲醛试剂：量取浓硫酸，慢慢加入L200m无水乙醇中，冷却，即为溶液A。另称取对-二甲基氨基苯甲醛2g10，溶于无水乙醇中，用37℃水浴加热使溶解，冷却，为溶液B。在冰浴中，将溶液A慢慢加入溶液B中，并混匀。 (4) ol/L6m盐酸 (5) 100g/L丙氨酸溶液：称取丙氨酸01g，溶于蒸馏水L90m中，调节至，再稀释至L100m。 (6) 硼酸钾缓冲液：称取硼酸681g.及氯化钾22g5，溶于蒸馏水L800m中，用ol/1L0m氢氧化钾及ol/L1m氢氧化钾调节pH至，用蒸馏水稀释至1L。 (7) 10g/L酚酞乙醇溶液 )8(羟脯氨酸标准液：精确称取羟脯氨酸g18m，加浓盐酸使溶解，移入L50m容量瓶中，加蒸馏水至刻度。浓度为g/。新鲜配制。用时再用蒸馏水稀释10倍，浓度为Lg/mm063.。 3．测定 )1(酸水解：当样品中的羟脯氨酸大多数以结合形式，甚至大分子的结合形式存在时，要测定其总量则应先进行水解。分别吸取： ① 测定管：样品液； ② 标准管：Lg0/.3m06m羟脯氨酸Lm01.；
③ 空白管：蒸馏水； 置于刻有L1m5刻度的具塞试管中。然后各加入浓盐酸，用硅橡胶塞塞后混匀，置100℃烘箱中过夜（61h1-8）。取出冷却后各加1%酚酞乙醇液1滴，ol/m1L2氢氧化钾，ol1/Lm氢氧化钾，并用ol0/.L1m氢氧化钾滴至粉红色。各管加蒸馏水至L51m刻度。（测定管如有沉淀物，离心除去。） )2(氧化和抽提：上述三管各吸取，分别加入三支具塞试管中，各加蒸馏水，g1/0L酚酞乙醇液1滴，用ol/氢氧化钾或ol/.0L05m盐酸调节至粉红色。各管加固体氯化钾g3使溶液饱和，再加/01Lg0丙氨酸及.7p8H硼酸钾缓冲液，混匀，室温放置20～in30m，振摇数次。各加ol0/.L2m氯胺T试剂，混匀，室温放置2i5nm（振摇数次）。各加入ol/硫代硫酸钠溶液（中止氧化）及甲苯，塞紧，用力振摇in5m，离心，吸出上层甲苯，弃去。再塞紧，置100℃沸水浴中in03m，冷却。各加甲苯，塞紧，用力振摇in5m，离心。 )3(样品测定：吸取上述三管的上层甲苯抽提液Lm52.，各加对-二甲基氨基苯甲醛试剂，充分混和，放置in03m。以甲苯作空白调零，在50m6n读取各管吸光值。 4.说明 )1(本法对羟脯氨酸有特异性，其他氨基酸即使同时存在0100倍也无干扰。 )2(如测定游离羟脯氨酸可省去第一步酸水解操作。 （七）胱氨酸的测定 1．原理 用亚硫酸盐使胱氨酸还原为半胱氨酸和-S半胱氨酸磺酸，其他含二硫键的物质也被还原。通过巯基被磷钨酸还原成钨蓝的反应测定半胱氨酸，从而定量出胱氨酸。非胱氨酸的巯基可在加磷钨酸前先加氯化汞与巯基结合。因反应pH为5，其他还原性物质如尿酸、抗坏血酸也使磷钨酸还原，通过空白对照加以去除。 2.试剂 )1(亚硫酸钠试剂：称取亚硫酸氢钠g261.及氢氧化钠20g.，溶液于蒸馏水至L100m。冰箱保存。 )2(乙酸盐缓冲液：oLl2/m乙酸钠溶液L100m和ol2/Lm乙酸液L20m混合。 )3(磷钨酸试剂：称取不含钼的钨酸钠04g,溶于蒸馏水约L300m。加85%磷酸溶液L32m，回流煮沸2h，冷却至室温，加蒸馏水至1L，加入硫酸锂（含1份结晶水）32g，冰箱保存。 )4(胱氨酸标准溶液（g/4Lm00）：称取胱氨酸g40m，溶于 3．测定 )1(取4支试管中分别吸取 ① 测定管：样品液（胱氨酸含量在gL20/.mm）。 ② 样品空白管：样品液。 ③ 标准管：胱氨酸标准液、蒸馏水。 ④ 试剂空白管：蒸馏水。 )2(胱氨酸的还原反应：上述各管分别加入醋酸盐缓冲液，亚硫酸钠试剂30 .Lm。测定管和标准管各加入蒸馏水落石出；样品空白管和试剂空白管各加蒸馏水、ol/溶液，混合后放置in2m。 2 )3(巯基的还原反应和比色：上述各管分别加磷钨酸试剂Lm01.，混合后于in15m内，在600nm波长下，以试剂空白管校正零点，测定标准管吸光度；以样品空白管校正零点，测定样品测定管吸光度，与氨基酸标样作对照，求出样品氨基酸含量。
本法在0～g/0L02m氨基酸范围内呈良好的线性关系。 4．说明 如果测定的样品中有胱氨酸结晶时，可用离心方法把沉淀物分离。然后向沉淀物加ol/1LHClm溶液，放在60℃恒温水浴中保温in15m，使胱氨酸溶解。再离心后，取此上清液与初次离心上清液合并进行分析。 （八）谷氨酸的测定 1．原理 L-谷氨酸在大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶作用下脱羧释放出二氧化碳，用华勃士呼吸仪由测压法测得二氧化碳放出量，计算出谷氨酸含量。 2．试剂 )1(大肠杆菌丙酮粉的制备：大肠杆菌37℃液体培养1h8（培养基成分：豆饼水解液3%、蛋白胨1%、酵母膏1%、牛肉膏1%、玉米浆50%.、KOP%、p H07.），离心（in30m5r0/）24 in,20m收集菌体。菌体用冷蒸馏水或生理盐水洗涤，离心后，将菌体用冷丙酮（0℃以下）搅匀，抽滤，所得粉白色的大肠杆菌丙酮粉，具有专一性强的谷氨酸脱羧酶的活性。置冰箱贮存，保持数月酶活性不变。 (2) ol/.乙酸盐缓冲液：称取乙酸钠，用蒸馏水溶解后，加乙酸调至，最后定容至L. m010(3) 20g/L大肠杆菌丙酮粉悬浮液（含谷氨酸脱羧酶）：称取丙酮粉2g，溶于的ol5/乙酸盐缓冲中。 3．测定 )1(取样品稀释液L(1m谷氨酸含量～gm)于反应瓶主室（F）中，其中再加醋酸盐缓冲液，L1m蒸馏水；在反应瓶侧室（G）内加入大肠杆菌丙酮粉悬浮液。 )2(装瓶密封，固定在振荡板上放入73℃恒温水浴。旋调检压液达m206m左右，振荡，与外界平衡inm5，关闭上端三向阀门与外界隔闭，旋检压液至m105m处，再振摇in5m，调准检压液闭口端至mm105处，记下开口端检压液高度，此为初读。 (3)记下初值后，迅速将侧室中酶液倒入反应液中，振摇01～in15m（使二氧化碳完全放出）。旋调检压液闭口端至1m50m处，记下开口端检压液高度，此读数减去初读再加上或减去空白瓶差额即为压差△H。 根据下式计算L-谷氨酸含量： 谷氨酸含量（gm）=K×△H× 22,400,000 式中，△H——表示在检压管上读出的压差毫升数， ——为谷氨酸的摩尔质量 22，400，000——表示om1l -L谷氨酸脱羧标准状态下放出二氧化碳的微升数 K——表示反应瓶常数 4．说明 本法专一性强，不受其他氨基酸及-D谷氨酸的干扰，适用于谷氨酸生产中发酵液的测定，测定量以不超过Lg/mm01.为宜。
第七节 氨基酸的分离及测定 一、薄层色谱法 1．原理 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的R值，不同成分则有不同的R值，因而各种氨基酸可达到彼此分离的目的。然后用茚三酮ff显色，与标准氨基酸进行对比，即可鉴别样品中所含氨基酸的种类，从显色斑点颜色的深浅可大致确定其含量。 2．试剂 ① 展开剂Ⅰ：叔丁醇-甲乙酮-氢氧化铵-水（5＋3＋1＋1），须临时配制。 ② 展开剂Ⅱ：异丙醇-甲酸-水（20＋1＋5），须临时配制。 ③ g5/L茚三酮的无水丙酮溶液 ④ 羧甲基纤维素或微晶纤维素 ⑤ 标准氨基酸溶液：浓度0～gL/2mm。 3．操作方法 ① 薄层板制备：称取1g0微晶纤维素，加入L20m水和丙酮，研磨in1m后调成匀浆后，用薄层涂布器于洁净干燥的玻璃板上（玻璃板02m×002m，厚度m3m），使涂层厚度以300～500μm为宜（比一般的薄板厚一些），置水平架上晾干后即可使用。 ② 样品液制备：称取样品g5m，放入小试管内，加入ol0L/.盐酸溶液（恒沸点盐酸）。在火焰上熔融封口后，置于101℃烘箱中水解2h4。取出，打开封口，置真空干燥器中减压抽干，以去掉多余的盐酸。以稀氨水调节p7H左右，再加入10%异丙醇至最后体积达，置冰箱中保存备用。 ③ 点样：用微量注射器吸取样液5Lu（每种氨基酸约1至10μg），分次滴加在距薄板下边缘约m2c处，边点边用电吹风吹干，使点样直径在2～3mm内。 ④ 展开：采用双向上行法展开。将已点样的两个薄板的薄层面朝外合在一起，放入层析缸（m20×50210m5×）中的玻璃船内，将两板的上端分开靠在缸壁上。先进行碱向展层，将展开剂I从两块板中间加入，薄层浸入展开剂中的深度约，盖好缸盖，进行展开。当溶剂前沿达到距原点约1cm1时（时间约1～），即可将薄板取出，冷风吹干，放平，刮去前沿上端的黄色杂质部分。再进行酸向层展，将薄板重新放入另一个缸中的船槽内，与碱向体系成垂直方向，加入展开剂II，进行展层。展开至距原点约1cm1时，取出，吹干。 ⑤ 显色：每块板喷以7～%0m茚三酮丙酮液，喷雾时应控制使薄层板恰好湿润而无液滴流下。喷雾后的薄板用电吹风吹干。有氨基酸存在的地方逐渐显出蓝紫色斑点，仅脯氨酸为黄色斑点。用铅笔将斑点圈出，并用描图纸绘制、复印或摄影保存。 ⑥ 标准氨基酸按上述步骤进行点样、展层和显色。为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液，所得图谱供比较和确定样品中的氨基酸含量。 4．结果计算 氨基酸含量（g/kgm）= 式中：V——样品溶液的总体积，Lm； 0——V点样用样品溶液的体积，Lm；
m——样品的质量，g； 1m——样品色斑相当于标准氨基酸的量，μg。 25．说明 ① 薄层色谱法操作简便快速，灵敏度高，成本低廉，故应用广泛。 ② 薄层扫描仪是一种定量测定薄层斑点的现代仪器，它的问世更发挥了薄层色谱法的优势，使之可与CG和CLPH法相媲美。 二、氨基酸自动分析仪法 1．原理 氨基酸的组分分析，现在广泛地采用离子交换法，并由自动化的仪器来完成。其原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱下来，即先是酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次是非极性的芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；摩尔质量小的比摩尔质量大的先被洗脱下来，洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。 定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。 阳离子交换树脂是由聚苯乙烯经交联再磺化而成，其交联度为8。 氨基酸分析仪有两种，一种是低速型，使用300～400目的离子交换树脂；另一种是高速型，使用直径4～6μm的树脂。不论哪一种，在分析组成蛋白质的各种氨基酸时，都采用柠檬酸缓冲液作为洗脱液；完全分离和定量40～46种游离氨基酸时，则使用柠檬酸锂缓冲液。但分析后者时，由于所用缓冲液种类多，柱温也要变为三个梯度，因此一般不能用低速型。 2．仪器 氨基酸自动分析仪 3．操作方法 ① 样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去脂肪杂质后，直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上柱进行分析。 酸水解的方法：称取干燥的蛋白质样品数毫克，加入 如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去杂质的方法如下： 去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解，然后用乙醇溶液洗涤，得蛋白质沉淀物。 去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。 去核酸：将样品在L10/0g氯化钠溶液中，85℃加热6h，然后用热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。 去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳离子交换树脂进行去盐处理。其方法是用国产723型树脂，先用ol1/mL盐酸使其转成H型，然后用水洗至中性，装在一根小柱内。将去除盐酸的水解样品用水溶解之后上柱，并不断用水洗涤，直至洗出液中无氯离子为止（用硝酸银溶液检查）。此时氨基酸全被交换在树脂上，而无机盐被洗去，最后用
ol2/Lm的氨水溶液把交换的氨基酸洗脱下来。收集洗脱液进行浓缩，蒸干，然后上柱进行分析。 ②样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样品量根据所用自动分析仪的灵敏度来确定。一般为每种氨基酸10.μolm左右（水解样品干重为左右）。对于一些未知蛋白质含量的样品，水解后必须预先测定氨基酸的大致含量后才能分析，否则会出现过多或过少的现象。测定必须在p5H～、010℃下进行，反应进行时间为01～in51m，生成的紫色物质在n7m05波长下进行比色测定。而生成的黄色化合物在404nm波长下进行比色测定。做一个氨基酸全分析一般只需1h左右，同时可将几十个样品一起装入仪器，自动按序分析，最后自动计算给出精确的数据。仪器精确度在1±～%3。用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如图310-。 图1 0-3 自动分析仪氨基酸分离图谱 4．结果计算 带有数据处理机的仪器，各种氨基酸的定量结果能自动打印出来，否则，可用尺子测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积进而计算出氨基酸的精确含量。另外，根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。 5．说明 ① 显色反应用的茚三酮试剂，随着时间推移发色率会降低，故在较长时间测样过程中应随时采用已知浓度的氨基酸标准溶液上柱测定以检验其变化情况。 ② 近年出现的采用反相色谱原理制造的氨基酸分析仪，可使蛋白质水解出的17种氨基酸在i1n2m内完成分离，且具有灵敏度高（最小检出量可达ol1pm）、重现性好以及一机多用等优点。 三、气相色谱法 1．原理 将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物——三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用三氟乙酸酐（AAFT）的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。其酯化、酰化反应式如下：
OOHHHClRCC4COHH9OHR+CCHCO4H92O+100+-NH2NH3ClOHOHORCC(CO4H9)CF3CO+RC2CCO4H9+-NH3ClNCCF3HO 2．主要仪器 ① 超声波浴 ② 气相色谱仪：带程序升温和氢火焰离子检测器。 色谱条件：分离蛋白质的02种氨基酸的三氟乙酰基正丁酯，一般采用双柱系统。 柱I：己二酸乙二醇聚酯柱（AGEP）。供分离除组氨酸、精氨酸、色氨酸和胱氨酸以外的61种氨基酸混合物之用。固定液为AG53%2P0E.。 柱II：供分离组氨酸、精氨酸、色氨酸和胱氨酸之用。固定液用硅酮类（如VO、VO。 170121+7用硅藻土载体（osoChrrobm 80/10,0W目），用浓盐酸浸泡2h4，用蒸馏水洗至中性，然后在104℃干燥1h2；不锈钢柱为m3m×。老化：柱温202℃，N作载气，流速Lin/2m5m， 。 柱温：起始08℃，进样以4℃inm/程序升温至251℃，至分析结束。 鉴定器温度302℃；进样温度200℃；进样量1～01μL，载气NinL/04mm；H经过分2 2子筛柱，in5L0/m；空气经硅胶柱inL/06m.。 整个分析可在in40m内完成。 3．试剂 ① 正丁醇、二氯甲烷：均为分析纯，先用无水氯化钙处理，然后分别用全玻璃蒸馏器重蒸馏一次。 ② 无水氯化钙：分析纯 ③ 三氟乙酸酐：分析纯 ④ ol/L3m盐酸浓度的正丁醇溶液：在气体发生器中，使氯化铵与硫酸混合，产生氯化氢气体。让气体通过两级浓硫酸的干燥后，再通入重蒸馏过的正丁醇溶液中。最后通过标定，直至正丁醇溶液中盐酸的浓度为oLl3/m即可。 ⑤ 氯化铵：优级纯 ⑥ 硫酸：优级纯 ⑦ 高纯N 24．操作方法 ① 样品处理：根据需衍生样品所含氨基酸数量，可分为常量、半微量及微量衍生的方法。常量衍生时，氨基酸总量在1～g20m；半微量衍生时，为～gm1；微量衍生时，为1～020μg。下面以半微量衍生的方法为例，叙述其具体操作：将总量约为g1m的氨基酸的稀盐酸（ol/）溶液加入L10m容量瓶中。将容量瓶置010℃砂浴，吹入高纯N，蒸发2水分，待恰好干燥时取出，加入二氯甲烷再置砂浴继续吹入高纯N，使残存的水分2和二氯甲烷成共沸物吹出。吹干后，加入盐酸正丁醇混合液，在超声波浴中振荡约in2m以加速氨基酸的溶解（当样品中有碱性氨基酸和胱氨酸等组分时，尤需此一步骤，否则氨基酸不溶或溶不完全将影响酯化反应的顺利进行）。盖紧磨口塞，将容量瓶置100℃砂
浴中，酯化in35m。稍冷，吹入高纯N，在砂浴中蒸发正丁醇和盐酸，按前述步骤加入二2氯甲烷进行共沸，进一步除去水分。最后加入三氟乙酸酐和二氯甲烷，在超声波浴中振荡1～in2m。将磨口塞继续盖严后，置干燥器中室温下进行酰化反应。2h即可对所形成的衍生物进行气相色谱分析。 ② 定性鉴定：根据保留时间与标样比较后加以定性，它们是：丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸和胱氨酸 ③ 定量测定：采用正亮氨酸为内标。以峰高乘半峰宽的方法计算出色谱峰面积之比并求出含量。 5．说明及注意事项 ① 近年使用七氟丁基（BFH）酰化和使用正丙基的-BFH-N正丙酯酯化，可用一根VO1的柱子完成分离，因其操作较简便、精密度与氨基酸自动分析仪法相当而得到了重视。 ② 样品处理操作应在通风橱中进行。 ③ 氯化氢气体也可采用氯化钠与硫酸反应制得。 四、高效液相色谱法 高效液相色谱法适于分析沸点高、分子量大、热稳定性差的物质和生物活性物质。用于氨基酸的分析已进行了大量的研究工作，并已取得了广泛应用。由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，而紫外吸收检测器（DVU）和荧光检测器（DF）又是CLPH仪的最常用配置。故人们需将氨基酸进行衍生化，使其可以利用紫外吸收或荧光检测器进行测定。 氨基酸的衍生可分为柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生需额外的反应器和泵，常用于氨基酸分析仪，如前文所提的茚三酮反应。此外，如荧光胺（Fluarm）、邻苯二甲醛（AOP）也有被人采用。在氨基酸的CLPH测定中，更多的还是采用柱前衍生法，这是因为比起柱后衍生法它的优点有：（1）固定相采用C或其它疏水物，可分辨分子结构细小的差异；（2）81反相洗脱，流动相为极性溶剂，如甲醇、乙二腈等，避免对荧光检测的干扰，可提高灵敏度及速度；（3）一机多用。常用的柱前衍生化试剂见表10－5。 下面仅以esartW推出的法为例作一介绍。 1． 原理 含蛋白质的食品，用ol/6LmHCl水解并在101℃加热2h4，用内标α－氨基丁酸（ABAA）稀释和过滤后，取一小部分用6－氨基喹啉－N－羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（QAC）衍生，用反相液相向色谱分析。 2．主要仪器与试剂 （1）高效液相色谱仪，带紫外检测器、梯度洗脱、温控装置。 （2）氨基酸分析柱 （3）脱气、溶剂过滤、混合等附件与装置。 （4）atesrW公司ACCQ－Flour试剂包，衍生用。 （5）流动相试剂：由乙腈、ATDE、HOP等试剂配成，具体操作可参阅atesrW公司法说明书。 3．操作说明 操作步骤可分为：称取样品 置于水解试管 加盐酸溶液 冷冻固化后抽真空 烧结封口 01℃下水解22 h 用水溶解 吸取溶解液1～L2m于蒸发试管中旋转蒸发至干（＜50℃﹚ 加入内标物（BAAA）混合均匀 吸取一定量液加入QAC衍生试剂 密封后于05℃下反应inm 01 进CLPH仪测定。
分析结果由计算机打印出来。分离图见图10－4。 4．讨论 （1）此法由美国waters公司推出，随机附带所需各种专用试剂包及附件，该法具有操作简便，灵敏度高的优点（可达olpm～olfm级）。 （2）本法可同时测定各种氨基酸。
思考题 1. 当选择蛋白质测定方法时，那些因素是必须考虑的？ 2. 为什么凯氏定氮法测定出食品中的蛋白质含量为粗蛋白含量？ 3. 在消化过程中加入的硫酸铜试剂有哪些作用？ 4. 样品消化过程中内容物的颜色发生什么变化？为什么？ 5. 样品经消化蒸馏之前为什么要加入氢氧化钠？这时溶液的颜色会发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明了什么问题？ 6. 蛋白质蒸馏装置的水蒸汽发生器中的水为何要用硫酸调成酸性？ 7. 染料结合法测定食品中的蛋白质的原理？ 8. 蛋白质的结果计算为什么要乘上蛋白质系数？265.的系数是怎么得到的？ 9. 说明甲醛滴电法测定氨基酸态氮的原理及操作要点。 10. 用什么方法可对谷物中的蛋白质含量进行快速的质量分析？ 11. 从离子交换色谱柱上洗脱氨基酸，采用什么定量测定方法？ （钱和）
第十一章 维生素的测定 第一节 概述 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有03余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有02余种。维生素的命名多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B、维生素C等。也有根1据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等，或按照其化学结构如视黄醇、硫胺素等。这些维生素结构复杂、理化性质及生理功能各异，但都有以下共同特点：它们或其前体化合物都在天然食物中存在；不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功能是通过作为辅酶的成分调节代谢过程，需要量极少；一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病，但是，摄入量过多，超过非生理量时，可导致体内积存过多而引起中毒。 食品中维生素的含量主要取决于食品的品种及该食品的加工工艺与贮存条件。许多维生素对光、热、氧、HP值敏感。在正常摄食条件下，没有任何一种食物含有可满足人体所需要的全部维生素，人们必须在日常生活中合理调配饮食结构，来获得适量的各种维生素。测定食品中维生素的含量，在评价食品的营养价值，开发利用富含维生素的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症，研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的工艺及贮存条件，监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒等方面，具有十分重要的意义和作用。 按照维生素的溶解性能，习惯上将其分为两大类：脂溶性维生素和水溶性维生素。前者能溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K各小类，其共同特点是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；后者溶于水，包括B、C各小类，其共同特点是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出。二类维生素的分布见表11－1。 表11－ 1维生素的类别 名称 英文名 脂 溶维生素A（A、A） iint amV A(A 名 )loniter121性维生素D（D、D、D、D） iint amVD, coiaclflheelr ooarlocli f2345维维生素E（α-，β-，γ-，δ等八种）iint amVE,αh-oeltpr ooc生维生素K(K1,K2) itna mVK（Klho:iq,lypnu oeK:farnqneuoi）12素 维生素B族 int amVB plemxo c 维生素B（硫胺素） itna mVB nniruea,eniatih,m11水维生素B（核黄素） itna mVBoifblian,v r22溶维生素B（泛酸、遍多酸） itna mVBnpecttna ho,i dcia33性维生素B（ 酰胺、尼克酰胺） itna mVBidena, ncininoiat,m55维维生素B（吡哆素） itna mVBiprdxn, yoie66生维生素B（生物素） itna mVBin Ha,nbtvioim,77素 维生素B（叶酸） itna mVBolic ,fcid, acin fola 1111 Pteroyl ic gmlutaacid 维生素B（钴维生素） itna mVBins ol,bacam2121维生素C iint amVC, corcab sidc ia 1
维生素的分析方法有生物鉴定法、微生物法、化学法和仪器法。生物鉴定法不但非常费时（21天）、费力，而且需要有动物饲养设施和场地，一般仅在没有其他合适的可选方法，或者要求测定分析样品的生物利用率的情况下才使用。微生物法是基于微生物生长需要特定的维生素，方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，样品不需经化学改性，但费时较长，仅限于水溶性维生素的测定。仪器分析方法中，有荧光法、分光光度法、色谱法、酶法、免疫法等多种方法，它们快速、灵敏、有较好的选择性。荧光法用于硫胺素的测定具有良好的准确性与灵敏度，且经济、简便、省时，被国内外广泛作为标准测定方法。CLPH可用于大多数维生素的分析，并且在某些条件下可同时分析几种维生素或同效维生素（维生素的异构体），但分析费用较高。不同的分析方法所适用的食品基质有所区别，在选择分析方法应予以注意。食品中维生素含量的表示，一般均以质量表示。 本章主要介绍食品中比较常见的几种维生素的测定。 第二节 脂溶性维生素的测定 食物中的脂溶性维生素常与类脂物质共存，摄入时一道被人体吸收。脂溶性维生素具有以下的理化性质： 1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、三氯甲烷、乙醚、苯、乙醇等有机溶剂。 2． 耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E在无氧情况下，对热、酸、碱稳定。维生素 K对酸、碱都不稳定。 3． 耐热、耐光、耐氧化性：维生素A、D、E、K耐热性都好，但维生素A易被氧化，光和热会促进其氧化。维生素D性质稳定，不易被氧化。维生素E容易被氧化，对可见光稳定但易被紫外线破坏。维生素K对热稳定，但容易被光、氧化剂及醇破坏。 根据上述性质，测定脂溶性维生素时通常先用皂化法处理样品，水洗去除类脂物。然后用有机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化物），浓缩后溶于适当的溶剂中测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸，抗坏血酸等）。对于某些含脂肪量低、脂溶性维生素含量较高的样品，可以先用有机溶剂抽提，然后皂化，再提取。对于那些对光敏感的维生素，分析操作一般需要在避光条件下进行。 一. 高效液相色谱法（CLPH）测定食物中维生素A、E的含量 维生素A又名视黄醇，只存在于动物组织中，在植物体内则以胡萝卜素的形式存在。维生素A为条状淡黄色晶体，熔点62～46℃，不溶于水，能溶于乙醇、甲醇、氯仿、乙醚和苯等有机溶剂。易被氧化破坏，对酸不稳定，但却经得起沸腾的碱处理。 维生素A有许多异构体，在动物的脂肪中存在的维生素A的母体化合物称为视黄醇，即维生素A，其结构式为： 1CHCHCH323CHOH2CH3CH3 维生素A(视黄醇 ) 1 在鱼肝油中存在一种类视黄醇物质，其生物效能为视黄醇的40％，在3位上脱氢，称作3－脱氢视黄醇，又称作维生素A，其结构式为： 2 2
CHCH33CH3HC3CHOH2CH3 维生素A2 维生素E又称生育酚，属于酚类物质。目前已经确认的有八种异构体：α－、β－、γ－、δ－生育酚和α－、β－、γ－、δ－生育三烯酚。其中以α－生育酚的活性最高，若以α－生育酚的生理活性为100，则β－及γ－生育酚和δ－生育三烯酚的活性分别为40、8及20，其他形式的活性更低。故通常都以α－生育酚作为维生素E的代表进行研究。生育酚和生育三烯酚之间的区别在于后者的侧链上有三个双键，不同生育酚或生育三烯酚之间的区别是环状结构上的甲基的数目和位置不同。他们的结构式如下： R3HC3R2OCH3CHCHCH333HOR1 生育酚 R3HC3R2OCH3CHCHCH333HOR1 生育三烯酚 化合物 R R R1 23 α-生育酚 CH3 CH3 CH3 β-生育酚 CH3 H CH3 γ-生育酚 H CH3 CH3 δ-生育酚 H H CH3 维生素E为黄色油状液体，溶于脂溶性溶剂，对热稳定，在酸性环境比碱性环境稳定。在无氧条件下，对热与光以及对碱性环境也相对较为稳定。 维生素E广泛分布于动、植物食品中，含量较多的为各种粮食的胚和植物油，如麦胚油、棉籽油、玉米油、花生油、大豆油和芝麻油。莴苣叶和柑橘皮含量也多。几乎所有绿叶植物都含有维生素E。此外，肉、禽、蛋、乳、豆类及鱼肝油中也都含有维生素E。 （一）原理 样品中维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。用高效液相色谱法C反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器，用内标法81定量测定。 （二）样品处理 1.皂化 称取适量样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约40μg）于三角瓶中，加L30m无水乙醇，振摇使样品分散。加入10L/0gL5m抗坏血酸溶液和苯并[e]芘溶液（5μg/L，内标用），混匀，加10mL氢氧化钾溶液（50％浓度），混匀，于沸水浴上回流30min，使皂化完全，皂化后立即放入冰水中冷却。 2.提取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100mL水将乙醚液洗至中性，约4－5次。 3.浓缩 将乙醚提取液经无水硫酸钠（约5g）滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙 3
醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上离心5min（3000r/min），上清液供色谱分析用。 （三）液相色谱分析 色谱推荐条件： 预柱：ODS 10μm,4mm× 分析柱：ODS 5μm,×25cm 流动相：甲醇：水＝98：2，混匀，临用前脱气。 紫外检测器波长：300nm,量程 进样量：20μL 流速：～ (四)计算 X=ρ/m×V×100/1000 式中 X - 某种维生素的含量，mg/100g; ρ- 由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL； V – 样品浓缩定容体积，mL； m – 样品质量，g。 （五）讨论 1. 本法摘自B G83182－09，适用于各种食物和饲料中维生素A和E的同时测定。最小检出限分别为维生素 ，α－生育酚 n189g.，γ－生育酚 ,δ-生育酚 。 2. 定性方法采用标准物色谱图的保留时间定性，定量方法采用内标两点法进行定量计算。先制备标准曲线，根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此值在标准曲线上查到其含量。或用回归方程求出其含量。用微处理机二点内标法进行计算时，按其计算公式由微机直接给出结果。 3．实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器，避免维生素的破坏。 4．本法不能将β－生育酚和γ－生育酚分开，故γ－生育酚峰中含有β－生育酚峰。HPLC图谱见图11－1。 5． 测定维生素E还有比色法、荧光法等。 图11－1 维生素A和维生素E色谱图 二、比色法测定维生素A的含量 （一）原理 维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比，在602nm波长下测定其吸光度。 4
（二）测定方法 1．样品处理 维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。 皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但操作费时，且易导致维生素A的损失。操作过程如下：称取～g5样品于锥形瓶中，加入L501m％氢氧化钾溶液及20～L40m乙醇，于电热板上回流in03m，至皂化完全。将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，用无水乙醚充分洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗内，将水层与乙醚层分开，水层反复用乙醚抽提直至无维生素A为止。合并醚层后，先用水洗提后，再用ol/mL50.氢氧化钾溶液洗涤除去醚溶性酸皂，再用水洗涤醚层，直至洗涤水不呈碱性（用酚酞指示剂）为止。将醚层放出，经过无水硫酸钠脱水后，蒸馏浓缩至剩下L5m乙醚时减压抽气至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜范围内，供比色测定。 研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5～u0g1样品的测定，如肝脏等。步骤简单、省时，结果准确。操作过程如下：称取2～5g样品，放入盛有3～5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并匀质化。将全部均质化的样品无损的转移入具塞的锥形瓶内，加入50～L100m乙醚，振摇抽提，使样品中维生素A溶于乙醚中，然后静置澄清或离心澄清。取澄清乙醚2～L5m，放入比色管中，在07～08℃水浴中抽气蒸干，立即加入L1m三氯甲烷溶解，供比色用。 2．标准曲线制备 准确取一定量维生素A标准溶液于4～5个容量瓶内，用三氯甲烷配置标准系列。再取相同数量比色管顺次取Lm1三氯甲烷和标准系列使用液L1m，各管加入乙酸酐1滴，制成标准系列，于602nm波长处，以三氯甲烷调节零点，将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入l9m三氯化锑－三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，绘制标准曲线。 3．样品测定 于一比色管中加L10m三氯甲烷，1滴乙酸酐为空白液，另一比色管中加入L1m三氯甲烷，其它比色管分别加入L1m样品溶液及1滴乙酸酐，以下步骤同标准曲线的制备。 （三）计算 x=ρ/m×v×01/010 式中：x－样品中维生素A含量，g/10gm（如按国际单位，1IU＝维生素A）； ρ－由标准曲线上查得维生素A的含量，Lug/m； m－样品质量，g； v－抽取后加三氯甲烷定量的体积，Lm； （四）讨论 1．本法摘自B1G2838－09，适用于食品中维生素A的测定。 2．三氯化锑有腐蚀性，不能粘在手上，三氯化锑与水能生成白色沉淀，所以不能碰到水。 3．三氯化锑与维生素A生成的蓝色物质很不稳定，要在6s内完成吸光度的测定，否则蓝色反应逐渐消失，使结果偏低。 三、胡萝卜素的测定 胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有β－紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转移为维生素A，故称为维生素A原。如α、β、γ胡萝卜素，其中以β－胡萝卜素效价最高，β－胡萝卜素的结构如下： 5
CH3HC3CHCHCH333CHCHCH333CH3CH3 胡萝卜素主要存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜素为食物的家禽、兽类、水产动物的体内也会含有胡萝卜素。 胡萝卜素对热、酸、碱都比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。胡萝卜素可溶于脂肪及大多数有机溶剂，纯品为深红色带有金属光泽的晶体，其溶液在405nm波长处有最大吸收（正己烷），故只要能完全分离，便可定性定量。分离的方法常有纸层析、柱层析和高效液相色谱法等。国家标准B139G28－09采用的是纸层析法。 （一）原理 以丙酮和石油醚提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于40m5n波长下进行比色测定。 （二）测定步骤 1．样品处理 对于含脂量不高的样品，如粮食、水果、蔬菜等，样品经磨粉或打成匀浆后，直接加入丙酮－石油醚混合溶剂反复抽提，直至抽提液无色为止，然后用分液漏斗分离出溶剂相经浓缩定容后供层析点样用。如果是含脂量较高的样品，如植物油、油籽油料等，则需在提取色素前先经50％HOK乙醇溶液皂化处理，皂化液再用石油醚反复提取。皂化过程可破坏植物细胞壁，使胡萝卜素释放完全，并且可破坏叶绿素，减少对胡萝素卜素的色素分离干扰。 2．浓缩与定容 提取液经洗涤分离后，溶剂相减压蒸发，最后用石油醚定容，备层析点样用。 3．展开与洗脱 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测定。 4．比色与含量计算 国标法采用1cm比色杯，于45n0m波长下测吸光度，从标准曲线上查出－胡萝卜素含量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以β－胡萝卜素计）。 （三）讨论 1．植物性样品中，胡萝卜素常与黄酮类物质、叶绿素等有色物质共存，黄酮类物质极性稍大。叶绿素易在强碱性溶液中被降解。采用适当的分离方法可使胡萝卜素同其他干扰物质分离。 2．皂化处理可提高胡萝卜素由细胞壁中的释放，并且减少提取时出现的乳化现象而带来的误差。但皂化过程中的热处理会导致异构化反应的出现，反式结构的类胡萝卜素可能均转化为顺式结构。 3．纸层析法、柱层析法均不能区分α－、β－和γ－胡萝卜素，虽然标准品为β－胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为β－胡萝卜素，故对结果影响不大。 4．用CLPH法可以获得更好的结果，其样品前处理与纸层析法基本相同，该法可以区分α－、β－胡萝卜素，是一种目前先进的测定方法。 四、维生素D的测定 维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又称钙（或骨）化醇，系类固醇的衍生物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在，具有维生素D活性的 6
化合物约有01种，记作维生素D、D、D等，其中最重要的是维生素D、维生素D及其23423维生素D原。维生素D无天然存在，维生素D只存在于某些动物性食品中。但它们都可23由维生素D原（麦角固醇和7－脱氢胆固醇）经紫外线照射形成： CH3HCCH33CHHC33CH3HCHC33HC3HC3HHHC3CH2HHOHO 麦角固醇 维生素D2(麦角钙化醇) HC3HC3CH3HCCH33CH3CH3HCCH33CH3HOHO 7－脱氢胆固醇 维生素D3(胆钙化醇) 维生素D的测定方法有：比色法、紫外分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等。比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。高效液相色谱法是目前分析维生素D的最好方法，灵敏度高，分析速度快，是我国国标/BGT53149.－1997所采用的方法。这里仅介绍高效液相色谱法。 （一）原理 试样在焦性没食子酸保护下皂化，用石油醚萃取不皂化物，萃取物经正相色谱柱分离富集，再用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器测定，与标准试样比较定量。 （二）测定步骤 1．样品处理 样品溶液中加入2％焦性没食子酸乙醇溶液混匀后，再加入57％HOK溶液加热回流皂化in30m，冷却后转移入分液漏斗中，用石油醚反复萃取，萃取液浓缩，最后用L1m正己烷溶解备用。 2．正相硅胶柱富集 推荐CLPH条件。 色谱柱：4mm×30cm，硅胶柱。 流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数％加入异丙醇。 流速：inL/m1m，柱温：20℃，检测波长：256nm。 注射Lu50维生素D标样（Lg1/um）和20L0u样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集样品于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入甲醇溶解，供检测用。 3．反相C柱检测 18推荐CLPH条件 色谱柱：×2 5cmC或同等性能色谱柱。 18流动相：甲醇，流速：in/Lm1m，柱温：20℃，检测波长：6n25m。 注射5u0L维生素D标准溶液和5u0L样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。根据峰面积（或峰高）的比值求算出样品中维生素D的含量。 （三）讨论 1．本法摘自B/－1997，婴幼儿配方食品和乳粉通用检测方法中维生素D的测定，适用于食品或强化食品及饲料中维生素D含量的测定。本法对维生素D和D不加区23别，两者混合存在时，以总维生素D定量之。 7
2．据资料介绍【杨祖英，食品检验，化学工业出版社，】样品用脂肪酶水解处理，用丙酮萃取，丙酮萃取液用乙醚再萃取，最后用CLPH定量测定，在6n25m下测维生素D，维生素K，在波长20m9n下测维生素A，维生素E。流动相为甲醇，C柱。可同时测定四18种维生素含量。 3．维生素D含量的表示可用质量含量g/10gm，也可用国际单位，1国际单位（1IU）相当于u05g02.维生素D。 第三节 水溶性维生素的测定 水溶性维生素包括维生素B(硫胺素)、维生素B（核黄素）、维生素B（吡哆醇、吡哆126醛、吡哆胺）、维生素PP（烟酸）、叶酸、泛酸（维生素B）、生物素（维生素B）、维生素37C等，广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。维生素B对光，特别是紫外线敏感，易2被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般多在酸性溶液中进行前处理。维生素B、1B通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，2再进行提取。为进一步去除杂质，还可用活性人造浮石、硅镁吸附剂等进行纯化处理。维生素C通常用草酸、草酸——乙醇、偏磷酸——乙醇溶液直接提取。维生素C既具有有机酸的性质，也具有还原剂的性质。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用；偏磷酸本身不稳定，与水结合逐渐变成磷酸，只能保存170~天，且价格较贵，溶解费时，但它能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量高的样品。 测定水溶性维生素的方法常有高效液相色谱法、荧光比色法、比色法和微生物法等。 一、维生素B的测定 1维生素B又称抗神经炎素，它是由一个嘧啶环和一个噻唑环所组成的化合物，因其分1子中既含有氮（N），又含有硫（S），故又称硫胺素。硫胺素常以盐酸盐的形式出现，为白色结晶，溶于水，微溶于乙醇，不易被氧化，比较耐热，特别是在酸性介质中相当稳定。但在碱性介质中对热极不稳定。亚硫酸盐在中、碱性介质中能加速硫胺素的分解和破坏。硫胺素在碱性介质中可被铁氰化钾氧化产生硫色素，在紫外光照射下产生蓝色荧光，可借此以荧光比色法定量。硫胺素能与多种重氮盐偶合呈现各种不同颜色，借此可用比色法测定。比色法灵敏度较低，准确度也稍差，适用于含硫胺素高的样品。荧光法和高效液相色谱法灵敏度很高，是目前常用的方法。 (一)荧光比色法 1．原理 硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成硫色素（吡哆色素），在紫外光照射下，硫色素发出蓝色荧光，在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，其荧光强度与硫色素的含量成正比，反应式如下： ClHCCH33NNNNHCHCNNNSHCHCHONHSCHCHOH3322222 硫胺素 硫色素 8
如样品中所含杂质较多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后测定纯化液中硫胺素的含量。 2．样品处理步骤 (1) 提取 称取一定量试样，加ol/盐酸溶液使其溶解后置13p0Ka压力锅中水解，冷却后中和至，再加淀粉酶水解，使硫胺素游离出来。 (2) 净化 吸取提取液L2800~m置于已装好活性人造沸石的盐基交换管中，使硫胺素被活性沸石吸附，然后用热的酸性氯化钾溶液洗脱，收集洗脱液定容后待测定，同时作标准硫胺素应用液的吸附和洗脱对照。 (3) 氧化 取A、B两个Mzaeil—oesrnG反应瓶，各加L5m试样净化液，A瓶中节L15mgL30/01m氢氧化钠溶液（试剂空白），B瓶中加L3m碱性铁氰化钾溶液（试样），于相同条件下振摇，各加L10m正丁醇萃取。以同样步骤作标准硫胺素应用液的氧化和萃取。分离出萃取液后供测荧光强度。 3．荧光强度测定 在激发波长n653m，狭缝5nm；发射波长453nm，狭缝5nm条件下依次测定试样空白、标准空白、试样、标样的荧光强度。 4．结果计算 x=(U－U)×（p×V）/(S－S)×V/V×1/m×1000/10 bb12式中：x—样品中硫胺素含量，g/10gm； U—试样荧光强度； U—试样空白荧光强度； bS—标准荧光强度； S—标准空白荧光强度； bρ—硫胺素标准应用液浓度，Lug/m； V—用于净化的硫胺素标准应用液体积，Lm； V—试样水解后定容的体积，Lm； 1V—试样用于净化的提取液体积，Lm； 2m—样品重量，g； 01/010—样品含量由gu/g换算成g/10gm的系数。 5．讨论 ①本法摘自B1G929030-，适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品。 ②硫色素在紫外线照射下会被破坏，故硫胺素氧化后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室中进行氧化和荧光测定。 ③操作过程中的其它注意事项，详见B031G-9290中的说明。 (二 )高效液相色谱法同时测定食品中B族维生素（B、B、B、叶酸） 1251．原理 高效液相色谱法用于测定B族维生素是近年来报道最多的新方法，它具有操作简便、准确可靠的特点。由于普及上的原因，暂未被我国国标所采用。本法以庚烷磺酸的甲醇溶液为流动相，用紫外和荧光检测器以标准对照法定量测定。 2．样品处理 样品处理方法参照荧光法中样品处理步骤，在酸性介质中加压水解，水解液先用滤纸 9
粗滤，使用前再用微孔过滤膜过滤备用。 3．液相色谱参考条件 ⑴高效液相色谱仪 具紫外检测器和荧光检测器 MT⑵色谱柱 AKPAuDNBOC3· 918⑶流动相 30%甲醇7%0重蒸水加入ol/庚烷磺酸离子对试剂（CIP—B），7使HP值保持在5HP左右。 ⑷流速 inL /m01.⑸检测器 紫外245nm，荧光ξ9n02=m，ξ =53n9mxM⑹灵敏度 紫外，荧光TT 080A.⑺柱温 室温 ⑻进样量 标准、样品均为2u0L。 4．结果计算 x/=h×ρ×100/0 m1×0式中：x—样品中维生素含量，gu10g0/； h—样品峰高； h—标准峰高； 0ρ—标准溶液维生素浓度，u g/Lm； m—样品质量，g。 5．讨论 ⑴本法摘自《食品检验》（主编杨祖英，化学工业出版社，0120年）~。 ⑵改变样品处理方法以及色谱条件，还可同时测定维生素B、B、烟酸、烟酰胺等。16参考资料同上书~P。 二、维生素B的测定 2维生素B又名核黄素，是由核糖醇与异咯嗪连接而成的化合物。能溶于水，水溶液呈2现强的黄绿色荧光，对空气、热稳定，在中性和酸性溶液，即使短时间高压加热，亦不致于破坏，在120℃下加热6h，仅有少量破坏，但在碱性溶液中则较易被破坏。游离核黄素对光敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。在碱性溶液中受光线照射很快转化为光黄素，有较强的荧光强度。 测定核黄素常用的方法有荧光法和高效液相色谱法。荧光法又分为测定自身荧光的核黄素荧光法和测定光分解产物荧光的光黄素荧光法 ，前者分析精度不高，只适合于测定比较纯的试样，后者的灵敏度、精密度都较高，且只要提取完全，可省去将结合型核黄素转变为游离型的操作。高效液相色谱法具有简便、快速的特点。我国国标B G1301-929中采用的是核黄素荧光法。 ㈠ 原理 核黄素在~50400n4m波长光照射下产生黄绿色荧光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素含量成正比。先把样品中的核黄素经硅镁吸附剂吸附分离，除去干扰杂质后测定其荧光强度，然后在试液中加入低亚硫酸钠（aNS OB，也叫连二亚硫酸钠），将核黄素还原为无荧光的222物质，再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，还原前后的差值即为食品中核黄素所产生的强度。 OHOHOHOHCH-(CHOH)-CHOH232HCCCCCH22HHHHNHCNO3ONHCN3NHNHHCHCN33OO 核黄素 无色核黄素 10
㈡ 样品处理步骤 1．水解 称取适量样品，用ol10/盐酸溶液于12℃下加压水解in30m，冷却后中和至，然后用淀粉酶或蛋白酶酶解1h6，过滤备用。 2．氧化去杂 吸取一定体积的样品水解液和标准核黄素应用液于具塞试管中，在冰醋酸酸性条件下，用高锰酸钾氧化去杂质，然后滴加过氧化氢溶液去除多余的高锰酸钾。 3． 核黄素的吸附和洗脱 用湿法装好硅镁吸附柱后，让氧化除杂后的样品溶液和标准核黄素溶液分别通过吸附柱，核黄素被吸附在柱上，水洗除去杂质后，用L5m洗脱液和水洗脱核黄素，供作荧光比色测定。 ㈢比色测定 1．于激发光波长404nm，发射光波长52nm，测量样品管和标准管的荧光值。 2．待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液（约Lm75~）中加亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各管的空白值。 ㈣结果计算 [xA=(－B)×m]/[C(－)D×]m×f×01/010 1式中：x—样品中核黄素含量，g/10gm； A—试样荧光值； B—试样空白荧光值； C—标准荧光值； D—标准空白荧光值； m—样品质量，g； m—标准管中核黄素含量，ug； 1f—稀释倍数； 01/010—样品核黄素含量的换算系数。 ㈤讨论 1．本法摘自B1G929031-，适用于各类食物中核黄素含量的测定。 2． 标准曲线在.g~00u21含量间有良好的线性关系。 3．高效液相色谱法见硫胺素测定。 三、维生素B的测定 6维生素B又称抗皮炎维生素，主要以三种天然形式存在：吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺。6结构式如下： CHOCHNHCHOH222HOCHOHHOCHOHHOCHOH222HCNHCNHCN333 吡哆醇 吡哆醛 吡哆胺 这三种化合物均易溶于水，微溶于丙酮及醇，不溶于醚及氯仿。在酸性溶液中对热稳定，但在碱性溶液中受光照射时易被破坏。测定维生素B的方法有微生物法、荧光法和高效液6相色谱法等。其中，微生物法是经典法，它的优点是：特异性高、精密度好、准确度高、操作简便、样品不需要提纯。缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。荧光法样品需经提纯，操作复杂。高效液相色谱法是目前最先进简便的方法。我国国标B/GT741-079189采用的是微生物法。这里只介绍微生物法。 11
㈠原理 微生物的生长与它们对某些特定的维生素的需求有关，因此在微生物分析法中，将某些微生物在含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得出样品中该维生素的含量。受试微生物可用细菌、酵母等，生长速率可通过测定浊度、产酸量、质量变化或呼吸作用，其中浊度分析（或光密度）是最常用的方法。维生素B的含量在Lg2/nm以内，其浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关系，6可用微生物定量。 ㈡操作步骤 1．菌种的制备 选用卡尔斯伯酵母菌（aShacc eosycmrCaigsensrlesrb TCC A .9O080N简称CS）为受试菌种，按微生物培养要求制备菌种试管和接受液。 2． 样品制备 称取均匀样品使之含有不超过10gn维生素B，放入L100m三角瓶中，加6ol/，于12℃加压水解5h，冷却，中和至，混匀，定容至L100m，24过滤。 3． 测试管的制备 在三支试管中分别加入、100.、样液，再加入L5m吡哆醇Υ培养基，在12℃下高压灭菌in10m，冷却备用。 4． 标准管的制备 在三组各6支试管中分别加入吡哆醇标准溶液，使其含量分别为0、1、2、4、6、8gn，再加L5m吡哆醇Υ培养基，同测试管灭菌备用。 5． 接种及培养 在上述各试管中各加入1滴接种液，于（30±）℃恒温培养箱中培养2h21~8。 6． 测定 在 505nm波长下测定各管的吸光度值。绘制维生素B标准工作曲线，并查出样品管中6维生素B的含量。 6㈢结果计算 -6x（g/10gm）=ρ/Vm×10×100 式中：x—样品中吡哆醇含量，g/10gm； ρ—由测试管得出样液的平均吡哆醇含量，Lnmg/； V—样品制备时的定容体积，Lm； 6-10—由ng换算为gm的系数。 ㈣讨论 1．本法摘自B/GT74891-0791，适用于药物、食物及饲料的检测。 2． 操作中的所有步骤均需避光处理。 3． 生物分析法仅限于对水溶性维生素的分析测定，除了此处介绍的B之外，还应用6于维生素B （以Lacuioslo lbctaicLhemnini CTCA8073菌种为受试微生物）、烟酸（受试微21生物为Labaoctiulsl claPantrum TCCA1840）、叶酸（受试微生物为Laactabciulsl harusonms CTCA4796）等，详细步骤可参阅CAOA有关条目。 四、维生素C的测定 维生素C又名抗坏血酸，自然界存在的有L－型、D－型两种，D－型的生物活性仅为L－型的10/。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜中含量都很丰富。 维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2，3－二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总 12
抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。 OOHOHCHOHCHO22OOHCOHOHCOHOOHOHHOHHOOCHOHHOO2 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 2，3－二酮古乐糖酸 测定维生素C的常用方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和高效液相色谱法等。靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸，该法简便，也较灵敏，但特异性差，样品中的其它还2++21+原性物质（如eF、nS、Cu等）会干扰测定，测定结果往往偏高。苯肼比色法和荧光比色法测得的都是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量，其中以荧光法受干扰的影响较小，准确度较高。高效液相色谱法可以同时测得抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的含量，具有干扰少、准确度高、重现性好，灵敏、简便、快速等优点，是目前最先进的方法。 （一）荧光法 1．原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（ADPO）反应生成具有荧光的喹喔啉（nuaoqixneil），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 HOOOONHOOOOOHCHO2HOHONHOHCHOCHOHO22 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 荧光化合物 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与DPAO反应，以此消除样品中荧光杂质所产生的干扰。 2．操作步骤 （1）样品制备：称取均匀的样品，加0g10偏磷酸－乙酸溶液（PgOH15和CHALO4m04溶于L050m水中）打成匀浆，控制HP值为21.（必要时加ol5/溶液稀释），过24滤，滤液备用。 （2）氧化处理：分别取样品溶液及标准抗坏血酸使用液（L0u10g/m）各L100m于带塞三角瓶中，加g2活性炭，振摇in1m，过滤，滤液备用。 （3）空白溶液的制备：各取L5m标准抗坏血酸氧化液和样品氧化液分别于2个L5m0容量瓶中，各加L5m硼酸－乙酸钠溶液，混合振摇in15m，用水稀释至L05m，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。 （4）样品及标准溶液的制备：各取Lm5标准氧化液和样品氧化液分别于二个L50m容量瓶中，各加入L505m％乙酸钠溶液，用水稀释至L50m，摇匀备用。 （5）荧光反应：取“标准空白”溶液，“样品空白”溶液及（4）中的“样品”溶液各L2m于L10m具塞试管中，在暗室中迅速向各管中加入L5m邻苯二胺，振摇混合于室温下反应in35m，用激发光波长33n8m，发射光波长42n0m测定荧光强度。另作一个标准系列的抗坏血酸荧光测定，作出标准曲线。 3．结果计算 x=ρ/mv×f×01/010 13
式中：x－样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，g/1g00m； ρ－由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，Lumg/； v－荧光反应所用试样体积，Lm； f－样品溶液的稀释倍数； m－试样质量，g。 4．讨论 （1）本法摘自B132G29－90中的第一法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量的测定。最小检出量为Lu00g2./m。 （2）本实验全部过程应避光。 （3）活性炭用量应准确，其氧化机理是基于表面吸附的氧进行界面反应，加入量不足，氧化不充分，加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用。实验证明，2g用量时，吸附影响不明显。 （4）邻苯二胺溶液在空气中颜色会逐渐变深，影响显色，故应临用现配。 （二）2，4－二硝基苯肼法 1．原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化后成脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用，生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。 2．操作步骤 （1）样品制备：称取适量样品，（含1～g2m抗坏血酸）鲜样加1：1量2％草酸溶液打成匀浆，干样则加1％草酸溶液磨成匀浆，最后用1％草酸溶液定容至Lm010。过滤，滤液备用。 （2）氧化处理：取L25m滤液加入g50.活性炭，振摇in1m，过滤，取L21%0m硫脲溶液，混匀备用。 （3）呈色反应： 取三支试管，每支试管都加入上述氧化稀释液L4m。其中一支试管作空白，另两只试管各加入L2m01.％2，4－二硝基苯肼溶液，将三支试管放入（37±）℃恒温箱或水浴中准确保温3h。取出试管放入冰水中。空白管冷至室温后加入％2，4－二硝基苯肼溶液，10～i1n5m后也放入冰水中。 向每支试管滴加L85m％硫酸，边加边摇动，滴加时间至少需要in1m。加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下准确放置in30m后立即比色。 （4）比色用1cm比色杯以空白液调零点，于n50m0波长下测吸光值。 （5）标准曲线绘制： 加2g活性炭于L50m标准溶液（Lg/1m）中，振摇in1m，过滤。取L10m滤液置于L500m容量瓶中，加硫脲，用1％草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为L2m0gu/。取出溶液用1％硫脲稀释或抗坏血酸浓度依次为1、2、4、5、8、01、Lug2/1m，按样品测定步骤进行显色反应并比色。以吸光值为纵坐标，抗坏血酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 3．结果计算 x=ρ/mv×f×01/010 式中：x－样品中抗坏血酸含量，g/10gm； ρ－由标准曲线得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，Lgu/m； v－试样用1％草酸溶液定容的体积，Lm； f－样品氧化处理过程中的稀释倍数； m－称取的样品质量，g。 4．讨论 14
（1）本法摘自2/29BT13G－09中的第二法，适用范围同荧光法。 （2）肼比色法容易受共存物质的影响，特别是谷物及其加工食品，必要时可用层析法纯化。 （3）实验过程应避光操作。 （4）硫脲可保护抗坏血酸不被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。 （5）试管从冰水中取出后，样品中因糖类的存在会造成颜色逐渐加深，故必须计时，in30m后准时比色。 （三）2，6－二氯靛酚氧化还原法 1．原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6－二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失。反应式如下： OOOClClOClClOHOOOHOONH+H+NHHOHHOHCHOH2CHOH2OHOH 还原型抗坏血酸 染料（粉红色） 脱氢抗坏血酸 染料（无色） 2．操作步骤 （1）样品制备：同2，4－二硝基苯肼法。也可在偏磷酸－乙酸溶液中提取（见荧光法）。（2）滴定 吸取样品抽提过滤液5～L10m于L50m三角瓶中，快速加入2，6－二氯靛酚溶液，直至红色不立即消失，然后一滴一滴的加入，以呈现的粉红色在15 s内不消失为终点。同时作空白。 3．结果计算 x=(V－V/)m×T×100 0式中：x－样品中还原型抗坏血酸含量，g/1g00m； V－滴定时样液消耗染料的体积，Lm； V－空白滴定时消耗染料的体积，Lm； 0T－用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出L1m染料溶液相当于抗坏血酸的量，Lg/m； m－滴定时所取滤液中含有样品的质量，g。 4．讨论 （1）本法源自CAOA方法29716.，.，所得结果为样品中还原型抗坏血酸的含量。 （2）样品中如含有还原性的铁离子、铜离子或亚锡离子等物质时，会使结果偏高。在提取过程中，可加入ATDE等螯合剂。 （3）国标B313G24.－98果蔬汁中L－抗坏血酸的测定方法中，采用乙醚萃取比较法来判别所加入2，6－二氯靛酚的滴定终点：于比色管中加入一定量样品试液，再加入某一量染料溶液混匀，然后加L2m乙醚振摇萃取，如乙醚层刚至淡玫瑰红色，则所加入的染料量为终点量。如乙醚层为无色或深红色，表明未到终点或过量。需进一步试验，确定精确的终点。该法的样品溶液需经乙醚萃取处理，以用10％的硫酸铜溶液煮沸in15m后的样品溶 15
液作为空白，在有铜离子存在时，还原型抗坏血酸完全被氧化破坏。 思考题： 1、测定食品中维生素有哪些方法？各有什么优缺点？ 2、测定脂溶性维生素时样品需如何处理？ 3、测定水溶性维生素时，从样品中提取浓缩可采用哪些方法？ 4、说明用高效液相色谱法测定维生素A、E的原理。 5、维生素C的测定方法有哪些？其依据原理是什么？ （刘耘） 16
第十二章 食品添加剂的测定 第一节 概述 一、食品添加剂的种类 食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及防腐和加工工艺的需要加入食品中的化学合成或者天然物质。食品添加剂的种类很多，按来源分为天然食品添加剂和人工合成食品添加剂两大类。按食品添加剂的功能、用途划分，各国分类不尽相同，我国《食品添加剂使用卫生标准》将其划分为22类：（1）酸度调节剂；（2）抗结剂；（3）消泡剂；（4）抗氧化剂；（5）漂白剂；（6）膨松剂；（7）胶姆糖基础剂；（8）着色剂；（9）护色剂；（10）乳化剂；（11）酶制剂；（12）增味剂；（13）面粉处理剂；（14）被膜剂；（15）水分保持剂；（16）营养强化剂；（17）防腐剂；（18）稳定剂和凝固剂；（19）甜味剂；（20）增稠剂；（12）食品香料；（22）其他。 二、食品添加剂的安全使用和管理 食品添加剂在用于食品之前，尽管已在实验室中进行了多次安全性测试，但毕竟不是食品的基本成分，因此，食品添加剂存在安全性问题。但食品添加剂在安全性监督管理下，在允许范围内按照要求使用一般来说是安全的。OHW／OAF规定了《使用食品添加剂的一般原则》，就食品添加剂的安全性和维护消费者利益方面制订了一系列严格的管理办法，并对食品添加剂安全性进行审查，订出它们的IDA值。食品添加剂法典委员会（ACCF），每年定期召开会议，对食品添加剂制定统一的规格和标准，确定统一的试验方法和评价方法等，对AJECF（食品添加剂联合专家委员会）所通过的各种食品添加剂的标准、安全性评价方法等进行审议和认可，在提交食品法典委员会（CAC）复审后公布。9195年我国颁布了《食品卫生法》，9179年卫生部又颁发了《中华人民共和国国家标准食品添加剂使用卫生标准》（B1926G9670-），其中对食品添加剂的安全管理做了许多严格的规定，以确保食品添加剂食用安全。 三、食品添加剂检测方法 食品添加剂有无机物质和有机物质，其测定方法和其它分析—样，首先应设法将被分析物质从复杂的混合物中分离出来，达到分离与富集待测物质的目的，以利于下一步的测定。常用的分离手段有蒸馏法、溶剂萃取法、沉淀分离法、色层分离法、掩蔽法等。样品分离后再针对待测物质的物理、化学性质选择适当的分析方法。常用的分析方法有容量法、分光光度法、薄层层析法和高效液相色谱法等。 第二节 几种甜味剂的检测 甜味剂是指赋予食品甜味的食品添加剂，按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂；以其营养价值可分为营养型和非营养型甜味剂。我国经全国食品添加剂标准化技术委员会审定，经卫生部批准实施的BG 620796-19国家卫生使用标准规定的甜味剂有糖精、甜蜜素、甜味素(阿斯巴甜)、甜菊苷、甘草、安赛蜜KA(糖)、阿力甜、异麦芽酮糖、麦芽糖醇、山梨醇、木糖醇、乳糖醇及三氯蔗糖等共51种。下面介绍几种甜味剂的测定方法。 一、糖精钠的检测 糖精是应用较为广泛的人工合成甜味剂。其学名为邻-磺酰苯甲酰亚胺，分子式为CHOSN，其结构式如右图。糖精为无色到白色结晶或白色晶状粉末，在水753中溶解度很低，易溶于乙醇、乙醚、氯仿、碳酸钠水溶液及稀氨水中。对热不稳定，长时间加热失去甜味。因糖精难溶于水，故食品生产中常用其钠盐，即糖精钠。糖精钠为无色结晶，无臭或微有香气，浓度低时呈甜味，浓度高时有苦味。易溶于水，不溶于乙醚，氯仿等有机溶剂。其热稳定性与糖精类似但较糖精要好，其甜度为蔗糖的200～007倍。 糖精钠被摄入人体后，不能被吸收利用，不分解，不供给热能，大部分从尿中排出而且不损害肾功能。其致癌作用一直有争议，尚未有确切结论，考虑到人体的安全性，7199年OAF／OHW公布，将其IDA值定为50g~g/km体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》 BG7209661~9规定，糖精钠可用于饮料、酱菜类、复合调味料、蜜饯、配制酒、雪糕、冰淇淋、冰棍、糕点、饼干、面包等，以糖精计，最大使用量为0．k1gg5/。汽水只允许用0g08.／gk；浓缩果汁可按浓缩倍数的80％加入。瓜子，1．2kgg/。话梅、陈皮，
5．gg0/k。 糖精钠测定方法有多种，有高效液相色谱法、酚磺酞比色法、薄层色谱法、紫外分光光度法，此外还有纳氏比色法、离子选择性电极法等。 （一）高效液相色谱法 1．原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪。经反相色谱分离后，以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性，以其峰面积求出样液中被测物质的含量。计算公式如下： m×10001糖精钠含量（g/kg或g/L）= V1m××1000 2V2 式中： m──进样体积中糖精钠的质量，gm； 1 m──样品质量，g； 2 V──样品稀释总体积，Lm； 1V──进样体积，Lm。 22．色谱条件 检测器：紫外检测器，波长203µm，灵敏度0．SF2UA； 色谱柱：WCY-G 4．mm6×250mm，1u0m不锈钢柱，18 或其他型号 C柱 ； 18图12-1苯甲酸、山梨酸 、 流动相：甲醇+0．ol/L20m乙酸铵溶液（55+9）； 糖精钠高效液相色谱图 流速：1．inL0/m； 1-苯甲酸 2-山梨酸 3-糖精钠 进样量：10µL。 4.说明与讨论 （1）本方法为国家标准分析方法（/-），适用于各类食品中糖精钠含量的测定。取样量为L,1 0m进样量为01µL时，最低检出限量为。另外，本方法可同时测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量，其高效液相色谱图如图112-。 （2）汽水和配制酒类要微热搅拌除去二氧化碳和乙醇，再用氨水（1:1）调pH值约为7，加水定容，经0．45µm滤膜过滤；饮料、果汁类用氨水（1:1）调pH值约为7，加水定容，离心沉淀，上清液经0．45µm滤膜过滤。 （二）酚磺酞比色法 1.原理 样品经除去蛋白质、果胶、二氧化碳、酒精等，在酸性条件下用乙醚提取，分离糖精钠，然后与酚和硫酸在157℃作用生成酚磺酞，再与氢氧化钠反应产生红色化合物。其反应式为：
测定吸光度值，与标准系列比较定量，按下面公式计算样品中糖精钠含量。 2.说明与讨论 （1）糖精易溶于乙醚，而糖精钠难溶于乙醚，为了便于乙醚提取，使糖精钠转化成糖精，样品溶液需进行酸化处理。 （2）为防止用乙醚萃取时发生乳化，可在样品溶液中加入CuSO和HOaN，沉淀蛋白质；对于富含脂肪4的样品，可先在碱性条件用乙醚萃取脂肪，然后酸化，再用乙醚提取糖精。 （3）因酒精既可溶于乙醚，又可溶于水，当用乙醚萃取时易乳化，分层不清，故含酒精的饮料应先加热挥去酒精；对含CO的饮料，应先除去CO，否则将影响样液体积。 22（4）本法受温度影响较大，要使糖精充分与酚在硫酸作用下生成酚磺酞，应严格控制在157土2℃温度下反应2h。 (三)薄层色谱法 1.原理 在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取，挥去乙醚后，用乙醇溶解残留物。点样于硅胶452FG薄层板或聚酰胺薄层板上，展开后喷显色剂显色，再与标准比较。进行定性和半定量测定。在实验条件下糖精的R值为30.。计算公式如下： f 式中 x－样品中糖精钠的含量,g/kg或g/L； m1－测定用样液中糖精钠的质量，mg； m2－样品质量（体积），g(mL)；
V1－样品提取液残留物加入乙醇的体积，mL； V2－点样液体积，mL。 2.说明与讨论 （1）本方法为国家标准分析方法，适用于各类食品中糖精钠含量的测定。取样量为10mL, 进样量为10µL时，最低检出限量为；另外可同时测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸、环已基氨基磺酸的含量，用聚酰胺薄层板，用展开剂异丙醇-浓氨水-无水乙醇（20︰1︰1）展开时，糖精钠的比移值，环已基氨基磺酸为，苯甲酸为，山梨酸为。 （2）聚酰胺薄层板的制备：称取ｇ聚酰胺粉，加可溶性淀粉，加约14mL水研磨均匀合适为止，立即倒入涂布器内制成面积为5cm×20cm，厚度为的薄层板。室温干燥后，于80℃干燥1h，取出，置于干燥器中保存、备用。聚酰胺薄层板的烘干温度不能高于80℃，否则聚酰胺变色。 （3）硅胶GF254薄层板的制备：称取ｇ硅胶GF254，加 % CMC-Na溶液与小研钵中研匀，立即倒入涂布器内制成面积为5cm×20cm，厚度为的薄层板，稍干后，于110℃活化1h，取出，置于干燥器中保存、备用。 （4）在薄层板下端2cm的基线上用微量注射器点样，点样量应估计其中糖精的含量为～。硅胶GF254薄层板用展开剂苯-乙酸乙酯-乙酸（12︰7︰3）进行展开；聚酰胺薄层板用展开剂异丙醇-浓氨水-无水乙醇（20︰1︰1）展开。展开完毕，取出在空气中挥干，喷显色剂，显色剂为%溴甲酚紫的50%乙醇溶液（pH=8），其斑点呈黄色，背景呈蓝色。 （5）其它说明与讨论见酚磺酞比色法。 （四）其他方法 1. 离子选择性电极法 糖精选择电极是以季铵盐所制CVP薄膜为感应膜的电极，它和作为参比电极的饱和甘汞电极配合使用，可以测定食品中糖精钠含量。当测定温度、溶液总离子强度和溶液接界电位等条件一致时，测得电位遵守能斯特方程式，电位差随溶液中糖精离子的活度改变而变化，被测溶液中糖精钠含量在002.～Lg/1m范围内时，电位值与糖精离子浓度的负对数成直接关系。 该法为卫生部推荐的参考方法。对苯甲酸的浓度为200～g/k01g0m时无干扰；苯甲酸的浓度为50～g/05k0gm，糖精钠的含量在100～g/k5g01m范围内，约有3%～01%的正误差，水杨酸和羟基苯甲酸酯堆苯法的测定有严重影响。 2.紫外分光光度法 样品经处理后，在酸性条件下用乙醚提取食品中的糖精钠，然后挥去乙醚，用乙醇溶解残留物。点样于硅胶24F5G薄层板或聚酰胺薄层板上，展开完毕后，硅胶2F5G4板可直接在波长5n24m紫外灯下观察糖精钠的荧光条状斑。如用聚酰胺板，挥干后喷显色剂，斑点成黄色，背景为蓝色。把斑点连同硅胶2FG54或聚酰胺刮入小烧杯中。同时刮一块与样品条状大小相同的空白薄层板，置于另一烧杯中做对照，经薄层分离后，溶于碳酸氢钠溶液中，经离心分离后，取上清液于波长20m7n下测定吸光度，与标准比较定量。此法操作简单，精度高，可测定微量的糖精。 3..纳氏比色法 利用糖精的溶解特性，先在碱性条件下用水溶解、浸取，再在酸性条件下用乙醚萃取，然后挥干乙醚，残渣在强酸性条件下加热水解，使糖精成为铵盐，与纳氏试剂作用生成一种黄色化合物，该化合物颜色深浅与糖精的含量成正比，可比色定量。此法操作简单，精度高，但干扰物质多。 4.荧光法 从样品中提取出糖精，在硫酸酸性条件下用高锰酸钾将干扰成分除去，于激发波长7n27m，发射波长 401nm测定荧光强度，与标准比较定量。本法检测下限低，可测定微量的糖精，但干扰因素多，有待进—步完善。 5气相色谱法 糖精难挥发，必须首先和甲基化试剂(碘化甲烷、重氮甲烷等)进行反应生成甲基糖精，然后用气相色谱法测定。 此法检测下限为1 0g/gkm，回收率和重现性都很好。 二、其他几种重要甜味剂的检测
（一）环己氨基磺酸钠的检测 环己基氨基磺酸钠商品名为甜蜜素，是人工合成的非营养型甜味素，为白色针状、片状结晶或结晶性粉末，无臭，味甜，稀释溶液的甜度约为蔗糖的03倍，对酸、碱、光、热稳定。摄食环己氨基磺酸钠后约40％从尿中排出，60％从粪便中排出。对其致癌作用引起了世界各国的争议，至今都没有达成一致看法。9149年OHW/OAF对DAI值规定为g/kg1m1~0体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》B G6~6291079规定环己氨基磺酸钠可用于酱菜、调味酱油、配制酒、糕点、饼干、面包、雪糕、冰淇淋、冰棍、饮料等，最大使用量为0．g/5kg6；蜜饯，1．0kgg/；陈皮、话梅、话李、杨梅干，8．gg0/k。 1．原理 在酸性介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性定量。按下式计算： A×10×100010A环己基氨磺酸钠含量（g/kg）== m×V×1000mV 式中： m──样品质量，g； V──进样体积，µL； A──测定用试样中环己基氨基磺酸钠的含量，µg； 10──正己烷加入量，Lm。 2．色谱条件 色谱柱：不锈钢柱，长m2，内径3mm； 固定相：osrbo Chrm WAWMDCS 01080-目，涂以 10%SE-30； 温度：柱温08℃；气化室105℃；检测器105℃； 流速：氮气04 L/inmm；氢气3 0iLn/mm；空气300 iL/nmm。 3.说明与讨论 （1）含二氧化碳的样品需经加热除去，含酒精的样品加氢氧化钠溶液调至碱性，于沸水浴中加热以除去酒精。 （2）环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠的反应必须在冰浴中进行。 （二）乙酰磺胺酸钾的检测 乙酰磺胺酸钾又名安赛蜜，对光、热（225℃）均稳定，甜感持续时间长，味感优于糖精钠。经动物毒性试验证明，本品是安全的。AOF／ OHW于1997年规定其IDA值为g/k0g5~1m体重。乙酰磺胺酸钾主要用于：果脯、奶类饮品、水果类甜点、果酱、口香糖、浓缩果蔬饮料、酒类、蛋类甜食、减肥营养配方、啤酒和麦乳精饮料等。 1．原理 样品中乙酰磺胺酸钾经高效液相反相柱C分离后，以保留时间定性、峰高或峰面积定量。按下式计81算： c×1000 乙酰磺胺酸钾含量（g/kg或g/L）=V2 m××1000V1 式中： c──由标准曲线上查得进样液中乙酰磺胺酸钾的含量，g/Lm； m──样品质量，g； V──样品稀释液总体积，Lm； 1V──CLPH测定时进样的体积，Lm。 22.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为24m1n； 分析柱：大连化物所生产的4．m6m×10m5m，粒度5µ m，Spherisorb C柱； 81流动相：0．ol2/0Lm硫酸铵（704～Lm008）+甲醇（170～L105m）+乙腈（09～L05m）+1 0%HOS（L1m）； 24流速：0．inL7/m。
3.说明与讨论 （1）本方法可同时测定乙酰磺胺酸钾、糖精钠、咖啡因、天门冬酰苯丙氨酸甲酯，检出限为 Lg/m。 (2) 样品须温热，搅拌除去二氧化碳或超声脱气。通过微孔滤膜过滤。 （三）山梨糖醇的检测 山梨糖醇的甜度与蔗糖相近。易溶于水，稳定性高，不易与氨基酸、蛋白质等发生褐变反应。我国和OHW/OAF对IDA值均未作特殊规定。我国允许在冷饮类、糕点、浓果汁、饼干、面包、酱菜类和糖果中按正常生产需要使用。 1．原理 用水或乙醇溶液从样品中提取山梨糖醇，用减压浓缩方法将水分全部除去后，制备乙酰化山梨糖醇，用乙醚萃取乙酰化山梨糖醇，浓缩至干，用丙酮定容后进行气相色谱分析。以保留时间定性、峰高或峰面积定量。 2. 乙酰化山梨糖醇衍生物的制备 准确吸取样品溶液和山梨糖醇标准溶液各L10m，放入50Lm浓缩器中，准确加入 L5mLg4/mm木糖醇作为内标液，在60℃水浴上减压浓缩，除去水分，然后加入L14m无水吡啶和L7m无水乙醇，在60～70℃水浴上激烈振摇，使残渣溶解，放置过夜。加水L20m后，用L10m水定量转移到分液漏斗中，用L5m0、L30m、30Lm乙醚分3次萃取，合并全部乙醚层，用L200m．ol/LH1mOS洗2次，再用L20m水洗1次，24乙醚层加入无水硫酸钠，放置h1。将此液过滤，残渣用Lm05乙醚分数次洗涤，将滤液和洗液合并于圆底烧瓶中，减压浓缩除去乙醚，向残渣中加丙酮使其溶解，准确加至L1m0。 3.色谱条件 检测器：氢焰电离检测器； 色谱柱：玻璃柱，内径为3mm，长度为2m；内装涂以6-E0X（3%）的06～08目硅烷化处理过的硅藻土担体； 温度：柱温从105℃到202℃以6℃in/m速度升温；检测器为520℃； 载气：氮气，inL/4m0m。 第三节 几种常用的防腐剂的检测 防腐剂是能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的的一类物质总称。防腐剂使用简单。可使食品在常温下及简易保藏条件下短期贮藏，在现阶段尚有—定作用，随着食品保藏新工艺、新设备的不断完善，防腐剂将逐步减少使用，甚至不用。目前，我国许可使用的品种有：苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钠、丙酸钙、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、脱氢醋酸等。 一、苯甲酸钠和山梨酸钾的检测 苯甲酸又名安息香酸。为白色有丝光的鳞片或针状结晶，熔点 212℃，沸点294．2℃。010℃开始升华。在酸性条件下可随水蒸汽蒸馏。微溶于水。易溶于氯仿、丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂。化学性质较稳定。苯甲酸钠为白色颗粒或结晶性粉末，无臭或微有安息香气味，在空气中稳定，易溶于水和乙醇，难溶于有机溶剂，其水溶液呈弱碱性（pH值约为8），在酸性条件下（p2H．5~4）能转化为苯甲酸。 在酸性条件下苯甲酸及苯甲酸钠防腐效果较好，适宜用于偏酸的食品（p H4．5~5）。苯甲酸进入人体后，大部分与甘氨酸结合形成无害的马尿酸。其余部分与葡萄糖醛酸结合生成苯甲酸葡萄糖醛酸甙从尿中排出，不在人体内积累。苯甲酸的毒性较小，9619年OHW/OAF限定苯甲酸及盐的IDA值以苯甲酸计为g/0k~g5m体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》B G9621907~6规定碳酸饮料的最大使用量为0．2kgg/；低盐酱菜、酱类、蜜饯、食醋、果酱（不包括罐头）、果汁饮料、塑料桶装浓缩果疏汁最大限量以苯甲酸计为g/2kg。 山梨酸又名花揪酸，为无色、无嗅的针状结晶，熔点143℃，沸点282℃。山梨酸难溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，在酸性条件下可随水蒸汽蒸馏，化学性质稳定。山梨酸钾易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成山梨酸。山梨酸及其钾盐也是用于酸性食品的防腐剂，适合于在p5H～6以下使用。它是通过与霉菌、酵母菌酶系统中的巯基结合而达到抑菌作用。但对厌氧芽孢杆菌、乳酸菌无效。山梨酸是一种直链不饱和脂肪酸，可参与体内正常代谢，并被同化而产生CO和水，几乎对人体没有毒性，2
是一种比苯甲酸更安全的防腐剂。OHW/OAF联合食品添加剂专家委员会9619年提出的山梨酸和山梨酸钾的IDA值以山梨酸计为g/~k20g5m体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》B G~6291079规定，山梨酸和山梨酸钾可用于肉、鱼、禽类制品，最大限量为0．/k7gg05。水果、蔬菜保鲜及碳酸饮料为0．2kgg/；胶原蛋白肠衣、低盐果酱、酱类、蜜饯、果汁饮料、果冻为0．kgg/5；果酒为0．6kgg/；塑料桶装浓缩果疏汁、软糖、鱼干制品、即食豆制食品、糕点、面包、即食海蛰、乳酸菌饮料等为1．kgg/0。 （一）气相色谱法 1．原理 样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，用带氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较定量。测出苯甲酸、山梨酸量后，再分别乘以适当的相对分子质量比，求出苯甲酸钠，山梨酸钾量。按下式计算： m×10001苯甲酸含量（g/kg或g/L）= 5V2m×××10002 25V1 式中： x──样品中苯甲酸或山梨酸的含量，kgg/； m──测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，µg； 1m──样品的质量，g； 2V──加入丙酮的体积，Lm； 1V──测定时进样的体积，Lm。 22.色谱条件 检测器：氢火焰离子化检测器； 色谱柱：内径m3m，长2m玻璃柱，内装涂以5%（/mm）E DSG+1%（/mm）HOP固定液的60～08目osorbC hrom WAW。 34流速：载气为氮气，in5L 0/m温度：进样口203℃，检测器203℃，柱温107℃。 图12-2苯甲酸、山梨酸 3说明与讨论 气相色谱图 （1）本法为国家标准方法，可同时测定食品中苯甲酸和山梨酸的含量，山梨酸保留时间为137秒，苯甲酸保留时间为386秒。如图21-所示。适用于酱油、果汁、果酱。最低检出限为1gu，用于色谱分析的样品为g1时，最低检出浓度为gg/1km。 （2）样品溶液的制备：称取一定量事先混合均匀的样品，置于L25m带塞量筒中，加0．L5m盐酸（1︰1）酸化，用L15m、L10m乙醚提取2次，每次振摇in1m，将上层乙醚提取液吸入另一个L2m5带塞量筒中。合并乙醚提取液。用L3m氯化钠酸性溶液（g4/0L）洗涤2次，静止in15m，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入L25m容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取L5m乙醚提取液于L10m带塞刻度试管中，置40℃水浴上挥干，加入L2m丙酮溶解残渣，备用。 （3）通过无水硫酸钠层过滤后的乙醚提取液应达到去除水分的目的，否则乙醚提取液在40℃挥去乙醚后如仍残留水分会影响测定结果。这时必须将残留水分挥干，但会吸出极少量白色氯化钠，当出现此情况时，应搅动残留的无机盐后加入石油醚-乙醚（3︰1）振摇，取上清液进样，否则氯化钠覆盖苯甲酸和山梨酸，时 （二）高效液相色谱法 1.原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。按下式计算： m×10001苯甲酸含量（g/kg或g/L）= V2m××1000 2V1
式中： m──进样体积中苯甲酸的质量，gm； m──样品质量，g； 12V──样品稀释总体积，Lm； V──进样体积，Lm。 122.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为20m3n，灵敏度为0．SF2UA； 色谱柱：WYG－C 4．6×m5501mµm，或其他型号C柱； 1881流动相：甲醇+乙醇铵溶液（0．ol2/0Lm）（955+）； 流速：1．inL0/m；进样量：10µL。 4.说明与讨论 （1）本法为国家标准分析方法，可同时测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，适用于酱油、果汁、果酱。山梨酸灵敏波长为245nm，在此波长测苯甲酸和糖精钠的灵敏度较低，苯甲酸和糖精钠的灵敏波长为245nm，为照顾三种被测组分灵敏度，方法采用203nm。（2）含二氧化碳的样品需经加热除去，含酒精的样品加氢氧化钠溶液调至碱性，于沸水浴中加热以除去酒精。 （3）被测溶液pH对测定和色谱住使用寿命均有影响，pH>8或pH <2时，影响被测组分的保留时间，对仪器有腐蚀作用。苯甲酸和山梨酸的测定以中性为宜。 （4）测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，也可以用oM icr KAP-C1N0 4×30m0m柱，流动相可用甲醇-水。 （5）对共存物进行干扰试验表明：蔗糖在m2n30处无吸收，柠檬酸吸收很少，在此色谱条件下，咖啡因和人工色素不被洗脱，因此这些共存物质不影响苯甲酸、山梨酸和糖精钠的定性、定量分析。 （三）薄层色谱法 1原理 样品酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸。将样品提取液浓缩，点于聚酰胺薄层板上，展开。显色后，根据薄层板上苯甲酸，山梨酸的比移值，与标准比较定性，并可进行概略定量。计算公式如下： 式中 x―样品中苯甲酸或山梨酸的含量,g/kg； m―测定用样品液中苯甲酸或山梨酸的质量，gm；m―样品质量，g； 12V―加入乙醇的体积，Lm； V―测定时点样的体积， mL； 1210―测定时吸取液乙醚提取液的休积，Lm； 25―样品乙醚提取总体积 ,mL。 2.说明与讨论 （1）本法为国家标准分析方法，可同时测定食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的含量，适用于酱油、果汁、果酱。本方法灵敏度高，但操作繁琐，重现性差。 （2）样品中如含有CO、酒精时应先加热除去，富含脂肪和蛋白质的样品应除去脂肪和蛋白质，以防用2乙醚提取时发生乳化，除去的方法同食品中糖精钠的测定。 （3）样品处理时，酸化的目的是使苯甲酸钠、山梨酸钠转变为苯甲酸或山梨酸，便于乙醚提取。 （4）其它说明与讨论见薄层色谱法测定食品中糖精钠的含量。 (四)紫外分分光度法测定苯甲酸 1．原理 样品中苯甲酸在酸性溶液中可以随水蒸气蒸馏出来，与样品中非挥发性成分分离，然后用重铬酸钾溶液和硫酸溶液进行激烈氧化，使除苯甲酸以外的其它有机物氧化分解，将此氧化后的溶液再次蒸馏，用碱液吸收苯甲酸，第二次所得的蒸馏液中基本不含除苯甲酸以外的其它杂质。根据苯甲酸钠在25m2n有最大吸收，故测定吸光度可计算出苯甲酸含量。计算公式如下：
2.说明与讨论 （1）样品处理方法为：称取均匀的样品10．0g，置于L205m蒸馏瓶中，加磷酸L1m，无水硫酸钠2g0，水L70m，玻璃珠3粒进行蒸馏。用预先加有L05m．ol1m／L氢氧化钠的L50m容量瓶接收馏出液，当蒸馏液收集到L45m时，停止蒸馏，用少量水洗涤冷凝器，最后用水稀释到刻度。吸取蒸馏液L2m5，置于另一个L205m蒸馏瓶中，加入o1310/m／L重铬酸钾溶液L25m，ol2m／L硫酸溶液6．Lm5，连接冷凝装置，水浴上加热10分钟，冷却，取下蒸馏瓶，加入磷酸lLm，无水硫酸钠20g，水L04m，玻璃珠3粒，按上述方法进行第二次蒸馏，收集馏出液，最后用水稀释到刻度。 （2）根据样品中苯甲酸含量，取第二次蒸馏液5～L20m，用0．ol01m／L氢氧化钠定容，以0．ol/0L1m氢氧化钠作为对照液，于252nm处测定吸收度。 （3）用Lol1/5Lm氢氧化钠代替L1m磷酸进行第一次蒸馏，按上述样品处理方法作空白试验，测定空白溶液的吸光度。 二、其他防腐剂的检测 （一）食品中对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的检测 对羟基苯甲酸乙酯又名尼泊金乙酯及尼泊金丙酯。对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯均为苯甲酸的衍生物，分别由对羟基苯甲酸与乙醇和丙醇以硫酸为触媒酯化而成。都是结晶性粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦，灼麻。在水中难溶，但易溶于丙酮、乙醇。因其是酯类，不易受pH的影响。在8p4H~内防腐效果很好。 摄食后在胃肠中能迅速完全吸收，并水解成对羟基苯甲酸而从尿中排出，不在体内蓄积。其毒性低于苯甲酸，而高于山梨酸。OAF／WHO联合食品添加剂专家委员会于4199年规定对羟基苯甲酸乙酯与丙酯的IDA值均为g/k10g0~m体重。我国《食品添加剂使用卫生标准》B G62619709~规定对羟基苯甲酸乙酯与丙酯可使用于果蔬保鲜，最大使用量（以对羟基苯甲酸计）为0．20g/g1k/；食醋0．k1gg0/；碳酸饮料、蛋黄馅0．gg0/k2；果汁饮料、果酱（不包括罐头）、酱油等为0．g2g/5k；糕点馅为0．/kgg5。 1．原理 样品中的对羟基苯甲酸酯类，用乙腈提取后，经过滤后进液相色谱仪进行测定，与标准比较定性、定量。对羟基苯甲酸甲酯、丙酯保留时间为4．inm2、7．in6m。计算公式如下： c×251000对羟基苯甲酸酯含量（g/kg）=× m×10001000 式中： c──样品溶液的浓度，µLmg/； m──样品质量，g； 25──样品溶液的体积，Lm。 2样品溶液的制备 称取约20g的样品，打碎，准确称取2g样品于L15m具塞离心管中，加入L5m乙腈，塞上塞子，振摇30s后，于in05r0/m离心in5m，将上清液转至L25m容量瓶中，重复操作3次，用乙腈稀释至刻度。用1．0µm滤膜过滤，供色谱测定。 3.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为24m5n；灵敏度为0．SF6U1A； 色谱柱： kapadnoB-U C 3c0m×4．6mm（内径）； 81流动相：乙腈+水（5+45）；
流速：1．in/5mm。 （二）食品中脱氢醋酸的检测 脱氢醋酸及其钠盐属于广谱防腐剂，特别对霉菌和酵母的抑制能力强，为苯甲酸钠的20~1倍。该类防腐剂能迅速而完全地被人体组织所吸收，进入人体后即分散于血浆和许多器官中，可抑制体内多种氧化酶的活性。日本3719年曾报道，该类防腐剂有导致肾结石等问题，因此其安全性受到怀疑。目前日本已经限制使用该类防腐剂。欧共体也禁止使用。我国年生产能力约200吨，主要用于饲料。但有时也用于袋装酱菜防腐，且防腐作用很强，用0．02％浓度约06天无霉变。脱氢乙酸的IDA值未作规定。 1．原理 样品中脱氢乙酸加热溶解后，离心分离，经过滤后直接进液相色谱仪中分离测定，与标准品比较定量。 2．样品溶液的制备 称取人造奶油1g，放入带塞刻度离心管中，加水L40m，加温使试样溶解，强烈振摇，加水L5m0，混匀，在离心机上约in0/30r0m，离心in5m，取一部分水层用滤纸过滤，取滤液L40m，用滤膜（0．45µm）过滤，供色谱测定用。 3.色谱条件 检测器：紫外检测器，波长为25m2n，0．S0F2UA； 色谱柱：4．8mm×50mm，粒径5µm，Unisil Q C柱； 81 流动相：0．ol/0L3m乙酸钠乙酸缓冲液+甲醇溶液（7+3）； 流速：0．inL8/m。 本方法脱氢乙酸 的检出限为gg/，平均回收率为.947%，相对标准差为616.%。 第四节 发色剂的检测 发色剂又名护色剂或呈色剂。是一些能够使肉与肉制品呈现良好色泽的物质。最常用的是硝酸盐和亚硝酸盐。亚硝酸盐和硝酸盐添加在制品中后转化为亚硝酸，亚硝酸易分解出亚硝基)ON(，生成的亚硝基会很快与肌红蛋白反应生成鲜艳的、亮红色的亚硝基肌红蛋白b)MO(N，亚硝基肌红蛋白遇热后，放出琉基HS-)(，变成了具有鲜红色的亚硝基血色原，从而赋予食品鲜艳的红色。同时，亚硝酸盐对抑制微生物的增殖有一定作用。与食盐并用可增加抑菌，对肉毒梭状芽抱杆菌有特殊抑制作用。亚硝酸盐和硝酸盐作为食品添加剂，过多地使用对人体产生毒害作用。亚硝酸盐与仲胺反应生成具有致癌作用的亚硝胺。过多地摄入亚硝酸盐会引起正常血红蛋白(二价铁)转变成正铁血红蛋白(三价铁)而失去携氧功能，导致组织缺氧。以亚硝酸钠计0IDA～0．gm2／kg，以硝酸钠计0IDA～g/kg5m。我国卫生标准规定：亚硝酸钠、硝酸钠的使用限于肉类制品及肉类罐头中，最大使用量：硝酸钠为0．5g／kg，亚硝酸钠为0．1g5／gk，残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不超过0．5g0／kg，肉制品不超过0．0g3／gk。 硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法很多，公认的测定法为格里斯试剂比色法测亚硝酸盐含量，镉柱法测硝酸盐含量。其它还有气相色谱法、荧光法和离子选择性电极法等。 一、亚硝酸盐的检测 (一)格里斯试剂比色法 1．原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与1--N萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大吸收波长为5n50m。反应式如下：
测定吸光度与标准比较定量。计算公式如下： m×10002亚硝酸盐含量（mg/kg)= V1m××1000 1V2 式中： m──样品质量，g； 1m──测定用样液中亚硝酸盐的含量，µg； 2 V──样品处理液总体积，Lm； 1V──测定用样液体积，Lm。 22.说明于讨论 （1）本方法为国家标准方法（9/36091BT395-0G.），适用于食品中亚硝酸盐的测定，最低检出限为gg/1km。 （2）本实验用水应为重蒸馏水，以减少误差。 （3）样品处理方法为：称取约10．0g0（粮食取5g）经绞碎混匀样品，置于绞肉机中，加L07m水和L1m2氢氧化钠溶液（2/0Lg），混匀，用氢氧化钠溶液（2/0Lg）将样品的pH值调至8，定量转移至L200m容量瓶中加入L1m0硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～L5m氢氧化钠，混匀，置06℃水浴中加热in10m，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀，放置0．5h，用滤纸过滤，弃去初滤液L20m，收集滤液备用。同时作试剂空白试验。 （4）此法用于油脂多的样品时，可通过冷却使脂肪凝固后再把它滤去，或用撇去法分开萃取液上层脂肪；对有色的样品，如红烧的肉类，因其色素影响比色测定，应在硫酸锌沉淀蛋白质后，取其滤液6 0Lm于L010m容量瓶中，加氢氧化铝乳液定容，然后过滤取其无色透明滤液进行比色测定。若一次加氢氧化铝乳脱色效果不好，可进行二次，甚至三次加氢氧化铝乳脱色，直至萃取液为无色透明滤液再进行比色测定。 （5）1--N萘基乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。 (二)示波极谱法 1．原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8-羟基喹啉偶合形成橙色染料，该偶氮染料在汞电极上还原产生电流，电流与亚硝酸盐的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。计算公式如下： 式中x——样品中亚硝酸盐的含量，g／kg m——测定用样液中亚硝酸盐的质量，gu; 1 V——样品溶液的总体积，L; m3
V——测定用样液的体积，L; m4 m一一样品质量，g 22．说明与讨论 （1）8-羟基喹啉溶液配制方法为： 称取0．205 g8-羟基喹啉，加L04m．ol1m／LHCl和少量水溶解，移至L205m容量瓶稀释至刻度。 2()样品处理方法为：称取5． 00g经绞碎混匀的样品(午餐肉，火腿肠可称10．00～ 20g00).，置于L50m烧杯中，加21．L5m硼砂饱和液，搅拌均匀，以07℃的水L300m将样品洗入Lm050容量瓶中，于沸水浴中加热in15m，取出后冷却至室温，然后一面转动，一面加入Lm5亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入L5m乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。加水定溶，摇匀，放置in30m，除去上层脂肪，清液用滤纸过滤，弃去初滤液L5m0，滤液备用。 (3)显色过程应严格控制条件。方法为：吸取一定体积的亚硝酸钠标准溶液、样品处理液和试剂空白液，分别置于L1m0容量瓶(或比色管)中。于各容量瓶(或比色管)中分别加入 ．olm01／ATDEL溶液，1． L50m8g／L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静止3～in4m后各加入1．Llg00m／L8-羟基喹啉溶液和0．L55m％氨水，用水稀释至刻度，混匀，静止10～in1m5。 （4）在示波极谱仪上采用三电极体系进行测定，以滴汞电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极。测定参考条件为：原点电位调节在—0．2V；倍率为0．1； 电极开关拨至三电极、导数档；测量开关拨至阴极。然后将三电极插入电解池中，每隔7s仪器自行扫描一次，在荧光屏上记录—0．5V左右的极谱波高。本法为/中的第二法，相对偏差≤01％。 (三)荧光法 亚硝酸盐与过量的对氨基苯磺酸起重氮化反应，剩余的对氨基苯磺酸与荧光胺作用，生成稳定的荧光团和无荧光的水解产物。在激发波长为463nm，荧光波长为49n5m下，其荧光强度与对氨基苯磺酸的量成正比。对氨基苯磺酸的原始量减去重氮化后过剩的对氨基苯磺酸的量，即为与亚硝酸盐发生重氮化反应的对氨基苯磺酸的量，进而可计算出亚硝酸盐的含量。 本法不受检液本身的颜色或混浊干扰，也不受样品稀释度的影响。但操作较为复杂。 二、硝酸盐的检测 （一）镉柱法 1.原理：样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使硝酸根离子还原成亚硝酸根离子。反应如下： ——在镉柱中，镉定量地将ON还原成ON： 32—— dC十ON OCd十ON 32镉柱经使用后用稀盐酸除去表面的氧化镉可重新使用： dOC十2HCl dCCl十H O22在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与1-N萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。计算公式如下： （m−m）××100012硝酸盐含量（mg/kg）=图12-3 镉柱装置图 m×（VV）×1000211.分液漏斗 2.橡皮塞 3.玻璃棉 4.海面状镉5. 镉柱玻璃管 6.出液毛细管 式中： m──样品的质量，g； m──经镉粉还原后测得亚硝酸钠的质量，µ g； 1m──直接测得亚硝酸盐的质量，µg； 2
v──样品处理液总体积，Lm； 1 v──测定用样液体积，Lm。 21．32──亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数 2.镉柱 （1）海绵状镉粉的制备：将L050m硫酸镉溶液中，投入足够的锌棒经4~3h，当其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾斜法多次洗涤，然后移入粉碎机中，加L500m水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取2400~目之间的部分，置试剂瓶中，用水封盖保存，备用。 （2）镉柱的制备：如图231-。取L5m2酸式滴定管数支，向柱底压入m1c高玻璃棉作垫，上置一小漏斗，将新配制的镉粉带水加入柱内，边装边轻轻敲击柱，排除柱内空气，加镉粉至180~cm高，上面用c1m高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。当镉柱填装好后，先用 /5L2mlCH洗涤，再以水洗两次，每次L5m2，调节柱流速至iLn5/3m~m。镉柱不用时用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。 (3)镉柱还原效率的测定：先加L25m氯化铵缓冲液于柱中，至液面接近海绵镉时，吸取2．Lm0硝酸钠标准溶液（10µLg/m），经镉柱还原，控制流速iLn3/~m5m，用L50m容量瓶接收。加入L5m氯化铵缓冲溶液，液面接近海绵镉时，加入L51m水洗柱，还原液与洗液一并流入L50m容量瓶中。加L60m%5乙酸，L10m显色剂，加水稀释至刻度，混匀暗处放置in25m。用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于波长505nm处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率（如镉柱还原率小于9%5，应经盐酸浸泡活化处理）。 m× 还原效率（%）=×10020 式中： m──20µg硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，µg； 20──硝酸盐的质量，µg； 1．32──亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。 3.说明与讨论 （1）本方法为国家标准方法（9/36091BT395-0G.），适用于食品中硝酸盐的测定，最低检出限为g/。 （2）在制取海绵状镉和装填镉柱时最好在水中进行，勿使镉粒暴露于空气中以免氧化。镉柱每次使用完毕后，应先以L025m． ol1/mLlCH洗涤，再以水洗2次，每次L25m，最后用水覆盖镉柱。 （3）为保证硝酸盐测定结果准确，镉柱还原效率应当经常检查。镉柱维护得当，使用一年效能尚无显著变化。 （4）在沉淀蛋白质时，硫酸锌溶液的用量不宜过多。否则，在经镉柱还原时，由于加 5m Lp9H．6～9．7氯化铵缓冲液而生成)HOnZ(白色沉淀，堵塞镉柱，影响测定。 2（5）镉是有害的元素之一，再制作海绵状镉或处理镉柱时，其废弃液中含有大量的镉，不要将这些有害的镉放入下水道污染水源和农田，要经过处理之后再放入下水道。另外，不要用手直接接触镉，同时不要弄到皮肤上，一旦接触，立即用水冲洗。 （6）其它说明同亚硝酸盐的检测。 (二)离子选择性电极法 ——25 在0．olm1／L硫酸钾介质中，用硫酸银除去氯离子干扰，硝酸根离子浓度在01～8×10 olm／L之间，电位值和硝酸根浓度负对数呈直线关系，由此求出样品溶液中硝酸盐含量。测定时取切碎混匀样品10．0～02．0g，用0．olm1／L硫酸钾溶液磨匀后，移入L10m0容量瓶中，用／L硫酸钾溶液定容，过滤。取滤液L40m置另—小烧杯中，插入电极，在搅拌下读取稳定电位，由标准曲线求出硝酸根含量。 此法亚硝酸盐含量占硝酸盐含量的03％～04％时，不影响硝酸盐的测定，如超过这个比例，可加入一定量硝酸盐标准溶液，以提高硝酸盐水平。溶液有颜色或混浊不影响测定。 (三)气相色谱法 1.原理 用硫酸在低于95℃时，硝酸根可与苯作用生成硝基苯。然后用气相色谱法分析该生成物，以-2氯萘为
内标物，给出一定的峰值和保留时间，据此可推算出样液中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。 2.说明与讨论 （1）该方法优点是避免了使用致癌物质萘胺类的化合物，有色物质也不影响测定，可测gg/k10m以下的硝基苯，回收率达59～99％。 （2）严格控制硝酸根与苯的反应。可采用下面的方法：按上面镉柱法处理样品，取L30m样品处理液和L20m苯于分液漏斗中，充分振摇后，静置，分层，分出水层，收集于L100m三角瓶中，加 L10m苯。滴加L58%0m的硫酸，滴加速度以苯刚刚沸腾或将要沸腾为宜，令反应in5m。然后将全部混合物移入分液漏斗中，用碳酸钠和水洗苯层，收集苯层。 （3）本方法还可用高锰酸钾将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，测定亚硝酸盐含量。 第五节 漂白剂——二氧化硫及亚硫酸盐的检测 漂白剂是指可使食品中有色物质经化学作用分解转变为无色物质，或使其褪色的食品添加剂。有还原型漂白剂和氧化型漂白剂两类。还原型漂白剂有：二氧化硫、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、低亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等，氧化型漂白剂有：过氧化氢、次氯酸等。使用时，有单一使用，也有混合使用。我国使用的大都是以亚硫酸类化合物为主的还原型漂白剂。它们通过所产生的二氧化硫的还原作用, 来抑制、破坏食品的变色因子，使食品褪色或免于发生褐变。一般在食品的加工过程中要求漂白剂除对食品的色泽有一定作用外，对食品的品质、营养价值及保存期均不应有不良的改变。 目前，在我国食品行业中，使用较多的是二氧化硫和亚硫酸盐。两者本身并没有什么营养价值，也非食品中不可缺少成分，而且还有一定的腐蚀性，对人体健康也有一定影响，因此在食品中添加应加以限制。9149年OAF／OHW规定了亚硫酸盐的DAI值为0~0．g/kg7m体重。并要求在控制使用量的同时还应严格控制OS的残留量。我国《食品添加剂使用卫生标准》GB 76902169~规定，亚硫酸盐可使用于葡萄酒、2果酒，用量为0．g/5kg2，残留量（以二氧化硫计）不得超过0．kgg/5。最大使用量：蜜饯、葡萄糖、食糖、冰糖、糖果、液体葡萄糖、竹笋、蘑菇及蘑菇罐头为0．~40．kg/0g6，薯类淀粉为0．k2gg0/；残留量（以二氧化硫计）：竹笋、蘑菇及蘑菇罐头不得超过0．gg4/k0，液体葡萄糖不得超过0．kgg/2，蜜饯、葡萄、黑加仑浓缩汁不得超过0．gg/5k0，薯类淀粉不得超过0．g0g/3k。 测定二氧化硫和亚硫酸盐的方法有：盐酸副玫瑰苯胺比色法、滴定法、碘量法、高效液相色谱法和极谱法等，其中常用的是前两种方法。 一、盐酸副玫瑰苯胺法 （一）原理 亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色络合物。反应如下： 2-+gHaNlC＋OS＋H O[lgHCOS]＋2H＋Cl2a N422232-+ [lgHCOS]＋OHCH＋2HgHlC＋OH－CH－OS H23223 聚玫瑰红甲基磺酸（紫红色）
于波长50m5n处有最大吸收峰，且在一定范围内其色泽深浅与亚硫酸盐含量成正比，故可比较定量。计算公式如下： m×10001二氧化硫含量（g/kg）= m×V100×1000×1000 式中： V──测定用样液的体重体积，Lm； m──测定用样液中二氧化硫的含量，µg； 1m──样品质量，g。 （二）说明与讨论 1.本方法为国家标准分析法/-中的第一法，适用于食品中亚硫酸盐残留量的测定，最低检出浓度为g/kg1m。 2.颜色较深样品，需用活性炭脱色。 3.样品中加入四氯汞钠吸收液以后，溶液中的二氧化硫含量在24小时之内稳定，测定需在24小时内进行。 4.亚硫酸易与食品中的醛(乙醛)、酮(酮戊乙酸、丙酮酸)及糖(葡萄糖、单糖)等结合，形成结合态亚硫酸，样品处理时加入氢氧化钠可使结合态亚硫酸释放出来。 5.亚硝酸对反应有干扰，加入氨基磺酸铵是为了分解亚硝酸，反应式为： ONH十HNOSHN HNOSH十N↑十H O222444226.盐酸副玫瑰苯胺加入盐酸调节成黄色，必须放置过夜后使用， 以空白管不显色为宜，否则需重新用盐酸调节。 7.盐酸副玫瑰苯胺中盐酸用量对显色有影响，加入量多，显色浅，加入量少，显色深，对测定结果有较明显的影响，因此需严格控制。 8.显色反应的最适温度为02～52℃，温度低，灵敏度低，因此样品管和标准管应在相同温度条件下进行。 9.对于饼干、粉丝等固体样品处理方法是：称取5．0～10．0g研磨均匀的样品，以少量水湿润并移入L100m容量瓶中，然后加入L20m四氯化汞钠吸收液，浸泡4h以上，若上层溶液不澄清，可加入亚铁氰化钾溶液及乙酸锌溶液各2．L5m，最后用水稀释至L100m刻度，过滤后收集滤液。 1 0.二氧化硫标准溶液的浓度随放置时间的延长逐渐降低，因此临用必须标定其浓度。 二、蒸馏法 (一)原理 在密闭容器中对样品进行酸化并加热蒸馏，以释放出其中的二氧化硫，释放物用乙酸铅溶液吸收。吸收后用浓盐酸酸化，再以碘标准溶液滴定，根据所消耗的碘标准溶液量计算出样品中二氧化硫含量。计算公式如下： 式中 x——样品中二氧化硫总含量，g／gk； V——滴定样品所用碘标准滴定溶液的体积，Lm； 1 V——滴定试剂空白所用碘标准滴定溶液的体积，Lm； 2 nr——样品质量，g； 0．302——每毫摩OS的质量，g／olmm。 2 01.——滴定时所用碘标准溶液的浓度，ol/Lm。 （二）测定方法 固体样品用刀切或剪刀剪成碎末后混匀，称取约5．0g0均匀样品(样品量可视含量高低而定)。液体样品可直接吸取5．0～01．L0m样品，置于5L00m圆底蒸馏烧瓶中。将称好的样品置入圆底蒸馏烧瓶中，加入I205m水，装上冷凝装置，冷凝管下端应插入碘量瓶中的L25m乙酸铅(208／1)吸收液中，然后在蒸馏瓶中加入L10m盐酸1(十1)，立即盖塞，加热蒸馏。当蒸馏液约2L00m时，使冷凝管下端离开液面，
再蒸馏inlm。用少量蒸馏水冲洗插入乙酸铅溶液的装置部分。 向取下的碘量瓶中依次加人L10m浓盐酸、Llm淀粉指示液g01(／L)。摇匀之后用碘标准滴定溶液0(．ol01m／L)滴定至变蓝，且在3s0内不褪色为止。在检测样品的同时要做空白试验。 本法为9105B36/90G4T.-中的第二法，适用于色酒、葡萄糖糖浆及果脯。 三、离子色谱法 （一）原理 试样中的亚硫酸盐在磷酸酸性条件下，于90℃水浴中通氮曝气分离，收集在三乙醇胺溶液中，取一定体积的样品溶液和空白溶液，分别注入离子色谱内测定亚硫酸的峰高，根据预先用标准溶液0(．1—0．u4g／Lm二氧化硫)作成标准曲线，计算样品中亚硫酸含量。计算公式如下： 式中x——样品中二氧化硫含量，g／kg； nr——进样体积中二氧化硫质量，ug； l m——样品质量，g； 10——试样溶液体积，Lm； 0．1——进样体积，Lm。 （二）说明与讨论 1. 本方法适用于食品中残留亚硫酸盐和天然亚硫酸盐的测定。亚硫酸在0．10～4．0ug／10L0u范围内呈线性关系，最小检出量为0．ug2／g。在红葡萄酒、糖豆、蜜饯樱桃、豆酱、冷冻虾、玉米粉等样品中，添加二氧化硫至gu10／g、10g0u／g，依次测定回收率为98％～019．0％。对1gu／Lm二氧化硫标准溶液测定01次，相对标准偏差为0．44％。 ———22. gC0l10m、OS、ON、甲酸、乙酸、乙醇，g10m甲醛、糖醛、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、43——2甲硫醇钠、丙烯基异硫氰酸盐及0．gS1m对测定无干扰。ON、乙醛、苯甲醛有严重负干扰，二氧化氮2干扰可用氨基磺酸铵消除，醛类干扰用2，PN4-D消除。 3. 试验溶液制备：取01．L00m吸收液，加入A吸收管内，取L25m，PN4D-溶液加到联结二氧化硫捕集装置的B吸收管内。称取1．0～5．g0样品(固体样品切成长m2m以下)，放入已通氮脱气in1m0的L40m磷酸1(十4)和L1m氨基磺酸铵溶液的曝气瓶内。立即接好捕集装置。曝气瓶于90℃水浴中以L080m／inm流速通氮气i4n0m，所得吸收液即为试验溶液。用蒸馏水代替样品同上操作，得到的吸收液为空白试验溶液。测定前如A吸收管内的吸收液不足L01m时，应加吸收液补足至L10m。 第六节 食用合成色素的检测 食用色素是以食品着色、改善食品的色泽为目的的食品添加剂。可分为食用天然色素和食用合成色素两大类。天然色素是从一些动、植物组织中提取的，其安全性高，但稳定性差，着色能力差。难以调出任意的色泽，且资源较短缺，目前还不能满足食品工业的需要；合成色素是用有机物合成的，主要来源于煤焦油及其副产品，资源十分丰富。合成色素具有稳定性好、色泽鲜艳、附着力强、能调出任意色泽等优点，因而得到广泛应用，但由于许多合成色素本身或其代谢产物具有一定的毒性，致泻性与致癌性，因此必须对合成色素的使用范围及用量须加以限制，确保其使用的安全性。 食用合成色素种类多，国际上允许使用的有03多种，我国允许使用的主要有苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、诱惑红、玫瑰红、柠檬黄、日落黄、亮蓝、靛蓝、牢固绿等。目前，在食品行业中使用单元色素已较少，需使用复合色素方可达到较满意的色泽，因而给其分析测定带来了一定困难。 合成色素的测定方法主要有薄层层析法和高效液相色谱法。 一、薄层层析法 （一）原理 在酸性条件下，用聚酰胺吸附水溶性合成色素，而与天然色素，蛋白质、脂肪、淀粉等物质分离。然
后在碱性条件下，用适当的溶液将其解吸，再用薄层层析法进行分离鉴别，与标准比较定性、定量。计算公式如下： c×1000 色素含量（g/L或g/kg）=V 2m×1000V 1式中： c──测定用样液中色素含量，gm； m──样品质量（或体积），g或Lm； V──样品解吸后样液总体积，Lm； 1V──样液点板体积，Lm。 2（二）说明与讨论 1.本法为国家标准分析方法9105B36/90G5T.-中的第二法，最低检出量为5u0g，点样量为1 g，样品最低检出浓度约为g/k5g0m。 2.样品处理时，对含CO的饮料需加热排除CO；果酒、配制酒要加热排出乙醇；淀粉、软糖、硬糖、22蜜饯等用水加热溶解，用20%柠檬酸溶液调pH至4左右；奶糖用乙醇－氨溶液溶解，水浴上加热浓缩，立即用1∶01硫酸调至微酸性，再加0%1钨酸钠溶液使蛋白质沉淀，过滤，收集滤液；蛋糕首先脱水、脱脂，再用乙醇-氨溶液直至提取完全，然后按处理奶糖的方法提取色素、沉淀蛋白质和收集滤液。 3. 处理过的样液加热至70℃之后，加入0．5～1．0g聚酰胺粉，并充分混匀，然后用2%0柠檬酸溶液调pH至4左右，使色素吸附完全，因为聚酰胺粉在偏酸性4Hp(～6)条件下对色素吸附力较强。如溶液中仍有颜色，可再加入少量的聚酰胺粉。如样品色素浓度太高，要用水适当稀释，因为在浓溶液中，色素钠盐的钠离子不容易解离，不利于聚酰胺粉吸附。 4. 样液中的色素被聚酰胺粉吸附后，全部转入G垂融漏斗或玻璃漏斗中过滤，当用热水洗涤聚酰胺3粉以便除去可溶性杂质时，要求用经20%柠檬酸调节p4H的70℃水反复洗涤，防止吸附的色素被洗脱下来，使定量结果偏低。若含天然色素，可再用甲醇-甲酸洗涤至无色，再用70℃水洗涤至中性，洗涤过程中必须充分搅拌。 5.用乙醇-氨溶液分次解吸全部色素，收集全部解吸液，水浴驱氨。若是单元色，用水定容至L50m，用分光光度计比色；若为混合色，将解吸液水浴浓缩至L2m左右，转入L5m容量瓶中，用5%0乙醇洗涤、定容。在进行蒸发浓缩时，要控制水浴温度在07～08℃，使其缓慢蒸发，勿溅出皿外，另外，要经常摇动蒸发皿，防止色素干结在蒸发皿的壁上。 6.采用聚酰胺粉薄层板进行定性、定量分析，用点样管吸取浓缩定容后的样液0．Lm5，在离底边2cm处从左至右点成与底边平行的条状，在板的右边点2µL色素标准溶液。在点样时最好用吹风机边点边吹干，在原线上点，直至点完一定量。另外，点样线缝宽不得超过m2m。 7.苋菜红与胭脂红用甲醇-乙二胺-氨水（10＋3＋2）展开剂；靛蓝、亮蓝用甲醇-氨水-乙醇（5＋1＋01）展开剂；柠檬黄与其它色素用柠檬酸钠溶液（25g/L）-氨水-乙醇（8＋1＋2）展开剂。取适量展开剂倒入展开槽中，将薄层板放入展开，待色素明显分开后，取出晾干，与标准色斑比较其比移值，确定色素种类。在展开之前，展开剂在缸中应预先平衡l小时，使缸内蒸汽压饱和，不至于出现边缘效应。 8层析用的溶剂系统，不可以使用或存放太久，否则浓度和极性都起变化，影响分离效果，最好两天换一次，以保证分离效果。 9. .分别吸取一定体积的色素标准溶液，置于Lm01带塞比色管中，加水至刻度。在特定波长处（胭脂红501nm，苋菜红50m2n，柠檬黄43n0m，日落黄428nm，亮蓝672nm，靛蓝6m2n0）测定吸光度。绘制标准曲线。 10将薄层层析板上的条状色斑剪下，用刀刮下移入漏斗中，用乙醇-氨溶液解吸色素，少量多次至解吸液为无色，收集解吸液于蒸发皿中水浴驱氨后转入L10m比色管中，用水定容。于上述波长处测定吸光度，在标准曲线上查得色素含量。 二、高效液相色谱法 （一）原理 合成色素在酸性条件下用聚酰胺粉吸附或用液-液分配提取，然后制成样液（水溶液），注入高效液相
色谱仪，经反相色谱分离，以保留时间和峰面积进行定性和定量。计算公式如下： 式中 c——进样体积中色素的含量，gm； V——样品稀释总体积，Lm； 1V——进样体积，Lm； 2m——样品质量，g。 （二）色谱条件 1.检测器：2V5U4nm，； 2.色谱柱：C-GWY 106m45×.02mμm不锈钢柱； 18图12-4八种色素高效液相色谱图 3.流动相：甲醇o-l0/.L02m乙酸铵溶液（p=H4）； 1-新红 2-柠檬黄 3-苋菜红 4-靛蓝 5-胭脂红 6-日落黄 7-亮蓝 8-赤藓红 4.梯度洗脱：甲醇：20～5%3，in5m； 35～98%，inm5；98%继续in6m； 5.流速：iLn/1mm。 （三）说明与讨论 1.本法为6T1950B3/09G5.-中的第一法，样品处理同薄层色谱法。 2.色素提取有聚酰胺粉吸附法和液-液分配法。样品不含赤藓红时，用聚酰胺粉吸附法。含赤藓红时，用液-液分配法。 3.聚酰胺粉吸附法同薄层色谱法中，只是定容之后需经405.μ滤膜过滤。液-液分配法是将制备好的样液移入分液漏斗中，加入L2m盐酸，5%三正辛胺正丁醇溶液10～L20m，充分振摇提取，静置，分取有机相，重复2～3次，合并有机相，然后用饱和硫酸钠液洗2～3次，每次8～L10m，将有机相转入蒸发皿中，水浴加热浓缩至L10m左右，再转入分液漏斗中，加L60m正己烷，混匀，加2%氨水提取2～3次，每次L5m左右，合并氨水层（含水溶性酸性合成色素），再用正己烷洗2～3次，分取氨水层。用乙醇调至中性，然后水浴加热蒸发至近干，用水转入L5m容量瓶中，定容，经μ滤膜过滤。取色素标准溶液10μL注入高效液相色谱仪中，经分析得出色谱图，再取色素提取液10μL注入高效液相色谱仪测定，根据Rt值定性，外标法定量。8种色素的色谱图如图412-。 4. 用高效液相色谱仪测定时，测定一个样品后，将流动相中甲醇浓度恢复至2%0，使之稳定in02m后，再开始测定第二个样品。 思 考 题 1. 说明薄层色谱法测定食品中糖精钠的原理及操作要点。 2. 气相色谱法测定食品中苯甲酸和山梨酸时，制备样品溶液时为什么要进行酸化处理。 3. 说明紫外光谱法测定食品中苯甲酸的原理及提取过程。 4. 简要说明格里斯试剂比色法测定亚硝酸盐的原理及方法。 5. 制备镉柱时应注意什么，镉柱还原效率如何测定。 6. 如何标定二氧化硫溶液浓度，标定时应注意什么。 7. 盐酸副玫瑰苯胺法测定食品中亚硫酸盐时，加入四氯汞钠溶液的作用是什么。 8. 测定食品中合成色素时，样品溶液为什么要用02%柠檬酸调pH至4。 9. 如何洗脱被聚酰胺粉吸附的色素，洗脱时应注意什么。 （许牡丹）
第十三章 食品中限量元素的测定 第一节 概述 存在于食物中的各种元素，从营养的角度，可分为必需元素、非必需元素和有害元素三类。从人体对其需要量而言，每日膳食需要量在100mg以上的，称为常量元素，如钙、磷、镁、钾、钠、氯、硫等。另一类在代谢上同样重要，但含量相对较少，常称为微量元素。按照1990年FAO/WHO国际组织专家委员会的新定义，微量元素按照其生物学作用分为：（1）人体必需微量元素，共有8种：碘、锌、硒、铁、铜、钼、铬、钴。（2）可能必需的元素共有5种：锰、硅、硼、钒、镍。（3）具有潜在毒性，但低剂量时可能是人体必需的元素7种：氟、铅、镉、汞、砷、铝和锡。微量元素在机体组织中的作用浓度很低，往往以百万分之一（ppm）或十亿分之一（ppb）甚至更低来描述，故需要从食物中摄取的量也很低。微量元素的浓度与功能形式常严格局限在一定的范围之内，而且有的元素的这个范围相当窄。微量元素在这特定的范围内可以使组织的结构与功能的完整性得到维持，当其含量低于机体需要的量时，组织功能会减弱或不健全，甚至会受到损害并处于不健康的状态之中。但如果含量高于这一特定范围，则可能导致不同程度的毒性反应，严重的可以引起死亡。从含量过低到过高的限量有的元素比较宽，有的却很窄，例如硒，其正常需要量到中毒量之间相差不到十倍。人体对硒的每日安全摄入量为50～200μg，如低于50μg会导致心肌炎、克山病等疾病，并诱发免疫功能低下和老年性白内障的发生；但如果摄入量在200～1000μg之间则会导致中毒，急性中毒症状表现为厌食、运动障碍、气短、呼吸衰竭，慢性中毒症状表现为视力减退、肝坏死和肾充血等症状；如果每日摄入量超过1mg则可导致死亡。微量元素的功能形式、化学价态与化学形式也非常重要。例如铬，其正六价状态对人体的毒害很大，只有适量的正三价铬对人体才是有益的。 无论是人体必需的微量元素还是有害元素，在食品卫生要求中都有一定的限量规定，从食品分析的角度，我们统称为限量元素。我国食品卫生标准中对这类元素的含量有严格的规定（见表13－1）有些元素，目前虽暂未指定标准，一般都持谨慎态度，可参考我国颁布的《生活饮用水卫生标准》（GB5749－85），其中对无机元素的限量要求列于表13－2中。 食品中限量元素的检测方法，主要有原子吸收分光光度计法、溶剂萃取比色法、离子选择电极法和荧光光度法等。食物中常见的矿物质约有20余种，本章着重介绍食物中常见的或食物卫生标准规定检验的限量元素。 1
表13－1食物中几种元素的限量卫生标准 元素 食品品种 指标（mg/Kg） 汞 粮食（成品粮） ≤ GB2762-1994 薯类（土豆、白薯）蔬菜、水果、牛乳 ≤ 肉、蛋（去壳） ≤ 鱼、其他水产品 ≤其中甲基汞≤ 砷（以As计） 粮食 ≤ GB14935－1994 海水鱼（鲜重计） ≤ 贝类、甲壳类、其他海类产品 ≤ 铅（以Ph计） 粮食 ≤ GB14935－1994 豆类 ≤ 蔬菜、水果、蛋类 ≤ 肉类、鱼虾类 ≤ 食盐、味精、酱油、食醋、酱腌菜 ≤ 镉（以Cd计） 大米 ≤ GB15201－1994 面粉 ≤ 蔬菜、杂粮（玉米、小米、高梁、薯类）蛋≤ 水果 ≤ 肉、鱼 ≤ 铁（以Fe计） 食用油、植物性罐头食品 ≤20 GB15200－1994 果汁饮料、果酱 ≤15 酱油、动物性罐头食品 ≤70 啤酒 ≤5 硒（以Se计） 粮食（成品粮）、豆类及制品 ≤ GB13105－1991 肉类（畜、禽）、蛋类 ≤ 鱼类 ≤ 肾 ≤ 奶粉 ≤ 锗？ 2
硒（以Se计） 粮食（成品粮）、豆类及制品 ≤ GB13105－1991 蔬菜（包括薯类） ≤ 水果 ≤ 肉类（畜、禽）、蛋类 ≤ 鲜奶类 ≤ 鱼类 ≤ 肾 ≤ 奶粉 ≤ 铬（以Cr计） 粮食、豆类、肉类（包括肝、肾）、蛋类 ≤ 薯类、蔬菜、水果 ≤ 鱼贝类、奶粉 ≤ 乳类（鲜） ≤ 铝（以Al计） 蒸制面制食品（干重计） GB15202－1994 油炸面制食品（干重计） ≤100 烘烤面制食品（干重计） 表13－2 《生活饮用水卫生标准》中无机元素限量标准 项目 标准（mg/l） 项目 标准（mg/l）项目 标准（mg/l） 铁 砷 铬（六价） 锰 硒 铅 铜 汞 银 锌 镉 第二节 元素的提取与分离 食品中的无机元素，一般常与有机物质结合，以金属有机化合物的形式存在于食品中，在测定无机元素之前，必须先破坏有机物质，释放出被测组分，称之为有机物破坏法（参见第二章第二节）。破坏有机物后得到的样液中，除含有待测元素外，通常还会有多种其他元素。这些共存元素有的会干扰测定，故有时需要进一步分离或浓缩，处理的方法应根据最后所采用的测定方法而定。 本节主要介绍金属鳌合物的溶剂萃取法 一、鳌合萃取原理 金属离子先与鳌合剂生成金属鳌合物，然后利用与水不相溶的有机溶剂同试液一起振荡，金属鳌合物进入有机相，另一些组分仍留在水相中，从而达到提取分离的目的，这个方法称为液－液溶剂萃取法。 萃取的方法可以有使用分液漏斗的常规液－液萃取法，连续液－液萃取法，逆流萃取法等。其中连续萃取法可以处理较低分配系数的萃取操作，使用溶剂较少，获得较高的效率。图 13－1为一种典型的连续液－液萃取器的结构图，使用比水重的有机溶剂进行萃取。进行适当改进，也可以使用比水轻的有机溶剂。 3
图13－1 连续液-液萃取装置结构示意图 1－萃取溶剂收集器；2－气态溶剂；3－萃取溶剂；4－冷凝器； 5－萃取液；6－溶剂返回管；7－萃取溶剂返回到收集器 二、鳌合反应与亲水性 当金属离子与可提供二个或二个以上配位键的络合剂起反应，生成二个或二个以上环状结构的络合物，称为鳌合物。鳌合物的环通常为五元环或六元环，结构比较稳定。例如, ＋2Ni与丁二酮肟在碱性介质中起反应，生成四个环状结构的鳌合物，其中二个环为五元环，二个为六元环： H ┉ ╲ CH O O CH 33 ╲ ↑ │ ╱ C═N N═C CH─C═NOH ╲ 32++ Ni + 2 │ Ni + 2HCH─C═NOH ╲ 3 C═N N═C ╱ │ ↓ ╲ CHO O CH 3 3 ╲ ┉ H 按照鳌合物中提供的配价键原子的类型，常有“OO型”、“NN型”、“NO型”、“SO型” 4
和“SN型”等，上例为“NN型”。 金属离子在未起鳌合反应之前，受水分子极性的作用，电离成为带电荷的亲水性离子，－3+2+2+并进一步结合成为水合离子，如Al(HO)，Zn(HO)，Ni(HO),Fe(HO)Cl等，它们易2626222溶于水而难溶于有机溶剂，这种性质称为亲水性。为了从水溶液中萃取某种金属离子，就必须设法脱去水合离子中的水分子，并中和所带的电荷，使之变成极性很弱的可溶于有机溶剂的化合物，也就是说，将亲水性的离子变成疏水性的化合物。选择适当的金属鳌合剂，可将金属离子变成疏水性的金属鳌合物。 水分子是偶极分子，水分子之间以氢键相互缔合。物质对氢键的作用能力或形成氢键的能力，是它的亲水性强弱的重要标志。一般无机盐类的亲水性之所以很强，是因为它们的离子能拆开水分子之间的氢键，形成水合离子并溶于水中。含有氧原子的基团，如醇、醛、酮和羧酸等，大多也有亲水性，因为氧原子的电负性强，可与水分子中的氧原子形成氢键： R H－O－H ╲ ┊ C ═ O ╱ ┊ R′ H─O─H 因此，分子量不大的醇、醛、酮和羧酸等可溶于水。 氮原子的电负性较氧小（；），也能与水分子形成氢键： H R－N……H－O H H 因此低分子量的胺类可溶于水。 硫原子的电负性较氧弱很多（S ）,形成氢键的能力也弱得多，因此，当含氧的有机化合物中的氧原子被硫置换后，它在水中的溶解度会降低。 烷烃和芳烃等有机化合物不能形成氢键，它们在水中的溶解度很小；烷烃的链越长，芳烃的环越多，它们在水中的溶解度越小。因此，这类基团通常称为疏水基团。 物质亲水性强弱的规律，可简单概括如下： 1. 凡是离子都有亲水性； 2. 物质含亲水基团越多，其亲水性越强。常见的亲水基团有：－OH，－SOH，－NH，22NH等； 3. 物质含疏水基团越多，分子量越大，其疏水性越强。常见的疏水基团有：烷基如－CH、CH等，卤代烷基，芳香基如苯基、萘基等。 3252+Ni与丁二酮肟的反应，形成鳌合物后，分子中有－CH等疏水基团，因此可被CHCI33等有机溶剂萃取。但分子中又有氧原子，又具有一定的亲水性，浓度很稀时也可溶于水中，故在分析时，也可直接比色测定。 CCl、CHCl是常用的非极性溶剂，根据“相似相溶”规则，是常用的非极性化合物抽43提剂。 三、萃取分离的基本原理 1. 分配系数 设物质A在萃取过程中分配在不互溶的水相和有机相中，在一定温度下，当分配达到平衡时，物质A在两相中活度比保持恒定，可用下式表示： 5
P=a有/a水 DA,A,浓度很稀时，可以用浓度代替活度。 K=[A]有/[A]水 D式中，K称为分配系数。 D2. 分配比 在分析工作中，常遇到溶质在水相和有机相中具有多种存在形式，此时分配系数就不适用。可用溶质在有机相中的各种存在形式的总浓度C有与在水相中的各种存在形式的总浓度C水之比来表示，成为分配比： D=c有/c水 3. 萃取百分率 在实际工作中，也常用萃取百分率E来表示萃取的完全程度。萃取百分率是物质被萃取到有机相中的百分率： E=[被萃取物质在有机相中的总量/被萃取物质的总量]×100% E与D的关系为： E=[D/（D+V水/V有）]×100% 式中V水、V有分别表示水相和有机相的体积。 由上式可见，E的大小，取决于分配比D和体积比V水/V有的大小。 四、萃取平衡与条件 1. 常用的鳌合剂 金属离子与鳌合剂的阴离子结合而行成中性鳌合物分子，选择合适的萃取剂和控制一定的萃取条件，一般都能达到完全萃取的要求，在分析化学中得到了广泛的应用。 目前已得到实际应用的鳌合剂已达100多种，在食品分析中应用最普遍的有二硫腙（HOZ），二乙基二硫代氨基甲酸钠（NaDDTC），丁二酮肟，铜铁试剂（N－亚硝基苯胲铵，CUP）等。它们所生成的金属鳌合物都相当稳定，难溶于水而易溶于有机溶剂，很多都带有可直接比色的颜色，故用于金属离子的测定十分简便。 2. 金属鳌合物的萃取平衡 以三氯甲烷萃取二硫腙锌为例，其反应为： CHCH65 65 │ │ CH─NH─NH NH─N N═N 65╲ ╱ ╲ ╲ 2++ 2 C═S + Zn → S═C Zn C═S + 2H╱ ╲ ╲ ╱ CH─N═N N═N N─NH 65 │ │ CHCH 65 65 简写为： ＋＋2Zn水＋2HD有=(ZnD)有＋2H水 zZ2＋2(1)Zn离子（水相）与螯合剂HD（代表二硫腙，溶于CHCl中）作用，生成不溶于z3＋水而溶于CHCl的螯合物ZnDz及两个H，反应达到平衡时，则： 32＋＋222K＝[ZnDz]有[ H]水/[ Zn]水[HDz]有（13－1） Zn2 6
K为萃取平衡常数。其值取决于：(a)HD在两相中的分配系数P；(b)HD在水相中的离ZnzHDzz解常数K；(c)螯合物ZnDz的稳定常数KDz；(d)螯合物ZnDz在两相中的分配系数HDz2Zn22PDz。 Zn2(2)HD在水相和有机相（CHCl）中进行分配： z3P=[HD]有/[HD]水 （13－2） HDzZZ (3)HD在水相中离解： Z＋-HD水＝H水＋D水zE ＋- K＝[ H]水[D]水/[HD]水 （13－3） HDzZZ -上式中[D]水表示水相中的螯合剂阴离子浓度。 Z＋2-(4)在水相中，Zn离子与螯合剂阴离子D生成可萃取的螯合物： Z＋2-Zn水＋2D水=(ZnDz)水z2 ＋－22KDz=[ZnDz]水/[ Zn]水[D]水（13－4） Zn22E (5)ZnDz在两相中的分配： 2PDz=[ZnDz]有/[ZnDz]水 （13－5） Zn222＋＋22假定：在有机相（CHCl）中Zn仅以金属螯合物ZnDz的形式存在，在水相中Zn32不发生其他络合、水解、聚合等反应；在反应平衡方程式中，可用浓度代替活度。将式（13－2），（13－3），（13－4），（13－5）代入式（13－1）中，并经整理可得： 2K= PK(KHDz/ P) （13－6） ZnZnDz2 ZnDz22HDz2如ZnD在水相中的浓度(ZnD)水很小而可忽略不计，则： Z2Z2＋2D=[ZnDz]/[ Zn] 代入（13－1）式中， Zn2 得： ＋22K= D[ H]水/[HD]水 （13－7） ZnZnZ合并式（13－6），（13－7），可得： ＋222 D= P·K(K/P)·[DH]有/[ H]水 （13－8） ZnZnDz2ZnDz2HDzHDzz推广到一般，以P代表螯合剂HA在两相中的分配系数；K代表HA在水相中的离HAHA解常数；K代表螯合物MAn的稳定常数；P代表MAn在两相中的分配系数，则： cc＋nnnD＝PK(K/P)·[HA]有/[ H]水 （13－9） MccHAHA如果萃取剂浓度[HA]有保持恒定，金属的分配比只是pH的函数。 3. 影响分配比值的几个因素 （1）鳌合剂的影响 由式（13—9）可见，如果鳌合剂与金属离子生成的鳌合物越稳定，即Kc越大，则分配比D也越大，萃取效率就越高。因此应选用能与被测离子生成稳定常数较大的鳌合物的鳌合剂。此外，P愈小，Pc愈大，也可得到较大的D值。一般来说，鳌合剂含疏水基团HA越多，亲水基团越少，萃取效率越高。离解常数K较大的鳌合剂比离解常数较小的鳌合HA剂有利。 （2）PH的影响 +溶液的PH值越大，即[H]越小，越有利于萃取。但溶液的酸度太低时，金属离子可能发生水解反应，或引起其他干扰，反而对萃取不利，因此必须正确地控制溶液的酸度，还可2+提高鳌合剂对金属离子的选择性，从而达到分步萃取。例如萃取Zn时，最适宜的PH值范围是～10，溶液的PH值太低，难以生成ZnDz鳌合物，PH值太高，则形成Zn(OH)，22都将降低萃取效率。 （3）萃取溶剂的选择 从方程式（13－9）可见，溶剂只对两个常数值——鳌合物和鳌合剂的分配系数Pc和nP有影响。当其他条件相同时，如改变溶剂，则金属的分配比D主要取决于Pc和PHAMHA 7
的比值。一般来说，有机溶剂的改变，都会使这两个分配比沿着同一个方向改变。如果Pcn的改变较P小，D值则会降低。可以根据鳌合物的结构，选择结构相似的溶剂，使得金HAM属鳌合物在溶剂中有较大的溶解度。例如含烷基的鳌合物可用卤代烷烃（如CHCl，CCl34等）作萃取溶剂；含芳香基的鳌合物可用芳香烃（如苯，甲苯等）作萃取溶剂。 溶剂对萃取是否适合，主要取决于它们的物理性质和化学性质。一般尽量采用惰性溶剂，若采用含氧的活性溶剂，可能发生副反应而发生干扰。 萃取溶剂的相对密度与水溶液的差别要大，粘度要小，这样才便于分层。此外，萃取溶剂还应无毒，无特殊气味，挥发性小。 表13－3为一些金属鳌合物在CHCl和CCl中的溶解度。有的作者认为，在实际萃取34中，如果没有必要选用含氧溶剂的的话，一般都愿选用CCl作为萃取溶剂。这是因为CCl44在水中的溶解度很低（ 2034表13－3 某些金属鳌合物在lCHC和lCC中的溶解度 34金属鳌合物 在CHCl中的溶解度在CCl中的溶解度 34 （mol/L） （mol/L） －－45二硫腙Pb ×10 ×10 －－23二硫腙Zn ×10 ×10 －28－羟基喹啉Al ×10 －28－羟基喹啉Fe(3) ×10 －－34 8－羟基喹啉Cu(2) ×10 ×10铜铁试剂Al ～ 二乙基二硫代氨基甲酸 较大。只有当鳌合物在CCl中溶解度不大时，才选用CHCl。因为CHCl较CCl极性较大，4334有与配位体形成氢键的倾向，常常对鳌合物有较大的溶解度。 4.干扰离子的消除 （1）控制酸度 控制适当的酸度，可以做到选择地只萃取一种离子，或连续萃取几种离子，使它们相2+3+2+2+2+互分离。例如在含有Hg，Bi，Pb，Cd的溶液中，用二硫腙－CCl4萃取Hg，若控制3+2+2+2+溶液的PH值为1，则Bi、Pb、Cd不被萃取；若要萃取Pb，可先将溶液的pH值调至+＋3+24～5，将Hg，Bi先萃取除去，再将PH值调至9～10，将Pb萃取出来。 （2）使用掩蔽剂 2+这是在鳌合反应中使用最普遍的一种方法。例如在上述溶液中萃取Pb，可用KCN掩＋22+蔽Zn、Cu等离子；用柠檬酸铵络合钙、镁、铝、铁等离子。又如用二硫腙－CCl萃取4+2+3+Ag时，控制溶液的PH值为4～5，加入EDTA，则除Hg、Au外，许多金属离子都不被萃取。 第三节 几种金属离子含量的测定 一、原子吸收分光光度法 自1954年世界上第一台原子吸收分光光度计问世以来，它的研制与应用得到了飞速发展。已广泛用于地质、冶金、环境保护、食品卫生检测等多种部门的许多领域。由于该法具有其它方法难以比拟的独到优点，故在最新颁布的国家标准食品卫生检测方法中，常被列作第一法。 （一） 基本原理 原子吸收光谱法是基于基态自由原子对特定波长光吸收的一种测量方法，它的基本原理是将光源辐射出的待测元素的特征光谱通过样品的蒸汽时，被蒸汽中待测元素的基态原子所 8
吸收，在一定范围与条件下，入射光被吸收而减弱的程度与样品中待测元素的含量呈正相关，由此可得出样品中待测元素的含量。 （二） 仪器的结构及性能 1.仪器的组成 原子吸收分光光度计由四个基本单元系统构成，即光源系统、原子化系统、分光系统和检测系统。光源系统主要产生待测元素的特征谱线，一般采用空心阴极灯；原子化系统主要用于产生待测元素的原子蒸汽；分光系统可以分出通过火焰的光线中待测元素的谱线；检测系统则把光信号转换成电信号，经调制、放大、处理，最后输出结果。 （1）光源 光源的作用是发射待测元素的特征谱线（一般是共振线）。半宽小、高强度、低背景的光源是取得良好分析效果的基础。目前最常用的光源是空心阴极灯（HCl）(图13－2)和无极放电灯(EDL)(图13－3)。空心阴极灯的阴极由高纯待测金属制成，当在外加电源作用下放电时，阴极受到巨大能量的作用产生出窄而强的该元素特征谱线，由灯头前面的石英窗射出。市面上可买到大约40种金属元素的空心阴极灯。对于易挥发元素，如As和Se的分析，一般采用无极放电灯（EDL），它是由一个密封的石应管组成，内含待测元素或其盐，以氩气作填充气，当受到放电线圈产生的射频场作用时，产生的能量使元素蒸发和激发而产生该元素的特征谱线。EDL产生的射线往往比HCl强。该灯除用于As、Se分析外，有时也用于Cd、Hg、Pb和Sb的分析。 图13－2空心阴极灯结构图 图13－3无机放电灯结构图 1－阴极，2－石英窗，3－气体（Ar或 1－焊接管，2－石英池， Ne），4－空心阴极，5－玻璃封套 3－He或Ar气， 4－待测元素化合物 此外，还有二极管激光器光源和高压氙弧灯光源也被一些仪器制造商所采用。前者不能测定大于620nm波长的谱线而受到一定限制，后者产生的是连续光，因而在选择上有较大的灵活性。 （2）原子化器 原子化器的作用是将样品中的元素转化为自由态原子蒸气，并处于基态。自由原子必须位于光源与色散系统的光路上。理想的原子化器将使样品完全原子化，通常应用的有火焰原子化器、电热原子化器（石墨炉）和氢化物原子化器三种类型。 火焰原子化器包括雾化器、雾化室和燃烧器三个部分。样品溶液经雾化器喷成细雾状，进入雾化室经撞击球的作用后形成稳定的小雾滴，借助于助燃气可使溶液样品形成气溶胶，然后气溶胶与燃气混合，点火引起燃烧，最终获得一个稳定火焰吸收层。常用的火焰有空气－乙炔和氧化亚氮（NO）－乙炔火焰。燃烧器通常为一条5～10cm的缝槽状，燃烧时可获2得平层火焰。此设计可避免由于高盐浓度带来的背景。 电热原子化器（ETA）是采用电热难溶材料（石墨）作为原子化器，样品在其中高温熔融，可获得瞬态自由原子。ETA的优点是自由原子滞留时间较长、加热时间短、操作简单、成本低、抗氧化能力强、使用寿命长等。样品在石墨管中经干燥、灰化、原子化，而后被测 9
定。 对于一些挥发性物质，常采用冷原子吸收装置（如测汞仪），氢化物原子吸收等。此外还有钽舟、钨舟、镍杯原子化器等。 （3）分光系统 分光系统包括单色器和外光路两部分，其核心部件为单色器，包括入射狭缝、准直光镜色散元件、成像物镜和出口狭缝等。国内外仪器普遍采用光栅作为色散元件。 仪器的光路系统有单光束和双光束两种类型，后者可以消除由于光源不稳定引起的漂移，并可降低信噪比。 （4）检测器 检测系统包括检测器、放大器和读数显示器等。光电倍增管使用最普遍，光二极管（约有60多个光二极管）是一种新型的固体检测器，正被一些新型仪器所采用。 （三）铁、铜、锰、镁、锌的测定 我国国家标准规定了食物中这五种金属含量的测定方法均采用原子吸收分光光度法（详见GB12396-90，GB/-1996，GB/-1996）。样品用湿法消化（硝酸、高氯酸4：1混合液）制成试样溶液，按照仪器说明书，调节仪器狭缝，空气及乙炔的流量、灯头高度、元素空心阴极灯电流等参数至最佳状态。表13－4为测定时操作参数，供参考。 表13－4 铁、铜、锰、锌、镁原子吸收分光光度法测定参数 元素 波长（nm） 狭缝（nm）火焰类型 标准工作液浓度范围（ug/ml） 铁 空气－乙炔 ～ 铜 空气－乙炔 ～ 锰 空气－乙炔 ～ 镁 空气－乙炔 ～ 锌 空气－乙炔 ～ 以标准曲线法进行定量计算： X=[(C－C)v×f×100]/[m×1000] 0式中：X－样品中元素的含量，mg/100g；C－测定用样品中元素的浓度（由标准曲线查出），ug/ml；C－试剂空白液中元素的浓度（由标准曲线查出），ug/mL；v－样品定容体积，mL；0f－稀释倍数；m－样品质量，g；100/1000－折算成每百克样品中元素的含量，以mg计。 本法中，以上元素的最低检测限分别为：铁 ug/mL，锰 ug/mL，铜 ug/mL，锌 ug/ml，镁 ug/ml。 （四）铅、镉、铬的测定（石墨炉原子化法） 由于火焰原子化法的原子化程度较低，且被火焰气体大量稀释，对于要求灵敏度较高的一些重金属含量测定，石墨炉原子化法是理想的选择。 目前食品中铅的测定方法很多，比较普遍应用的方法有石墨炉原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、二硫腙比色法、氢化物原子荧光光谱法、示波极谱法等。其中石墨炉原子吸收光谱法是目前国际上通用的方法，被大多数国家所采用，我国国标法（GB/-1996）中选用该法作为铅测定方法的第一法。火焰原子吸收光谱法[铅在一定PH条件下与二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）形成金属鳌合物后用4－甲基戊酮－2萃取分离]、二硫腙比色法、示波极普法因方法繁杂、分析时间长而较少使用。氢化物原子荧光光谱法灵敏度虽高，但不是铅的特异性高的方法。镉、铬也因同样道理，均选用石墨炉原子化法作为该元素测定方法的第一法（详见GB/－1996，GB/T14962-1994）。 样品经消解（可选用干法灰化、压力消解法、常压湿法消化、微波消解法中的任何一种方法）后，制成供试样液，按照仪器说明书，调节有关参数至最佳状态，以标准曲线法进行定量计算。背景校正为氘灯或塞曼效应。表13－5为三种元素的测定参考条件。 10
表13－5 铅、铬、镉无火焰原子吸收法测定参数 元波长 狭缝 灯电流 干燥温度(℃)灰化温度(℃)与原子化温度(℃) 素 (nm) (nm) (mA) 与时间(s) 时间(s) 与时间(s) 铅 ～ 5~7 120，20 450，15～20 1700～2300，4～5镉 ~ 8~10 120，20 350，15～20 1700～2300，4～5铬 ~ 8~10 110，40 1000，30 2800，5 （五）最佳条件选择 原子吸收法具有灵敏度高，选择性好的优点，但在应用中也受到了许多因素的制约，除了仪器本身的性能影响之外，操作条件的选择也非常重要，只有选择合适的测定参数，使仪器处于最佳工作状态，才能得出优良的分析结果。实际操作时，应根据仪器说明书，以及下列条件，选择合适的测定参数。 1． 火焰原子化法 最适条件的选择包括： （1）燃气、助燃气种类、流量和它们间的比值：不同的元素有其最适宜的火焰温度和火焰的氧化还原性质。改变它们，灵敏度及干扰因素的干扰程度就发生改变。电离电位低的元素，可使用温度较低的空气――煤气火焰；而电离电位高的元素，宜用高温火焰（如NO2－乙炔焰）。火焰的氧化还原性质决定于助燃气/燃气流量比，它对元素的原子化也有影响。空气乙炔火焰特别适用于形成非难熔氧化物的一些元素测定，如Ca、Cr、Fe、Co、Ni、Mg、Mo、Sr等。NO－CH火焰则适用于形成难熔氧化物的一些元素的测定，如Al、Si、Ta、222Ti、V、Zr等。 经有机溶剂萃取的样液，因溶剂本身也是燃料，故助燃气/燃气的比例不同于水溶液，需作适当调整。 （2）光路与灯头的距离：样品进入火焰后，随着气流由下往上快速通过时，进行一系列复杂的反应。蒸发、裂解为基态原子，吸收、电离、激发、复合为分子等。因此在火焰的＋6不同部位，有不同的基态原子浓度，灵敏度和干扰程度也各不相同。如Cr在还原火焰中，光路通过灯头上4mm的吸光值为灯头上1mm的1/3。有机溶剂和水溶液的适宜高度也不同，一般前者较后者要小。 （3）溶液提升量：负压大，溶液提升量大，且雾化率高，进入火焰的样品也多，可提高灵敏度。但也会造成降低火焰温度，和因空气流量大而稀释了火焰中的原子蒸气浓度，灵敏度反而下降。因此，选择适宜的溶液提升量是必要的。 2． 石墨炉原子化法 最适条件的选择包括： （1）干燥温度和时间：干燥温度应根据溶剂或样品中液态组分的沸点来选择，一般应稍高于溶剂的沸点。对稀的水溶液可在100～130℃之间。所选择的温度应使溶液不产生沸腾但可较快蒸发掉，以免样品飞溅，导致分析精确度降低。干燥时间取决于样品体积的大小，一般情况下，10μL用15秒，20μL用20秒，50μL用40秒，100μL用60秒。超过100μL者，宜分次进样干燥，但灰化时间也应适当增加。 （2）灰化温度和时间：灰化的目的是为了在原子化前将比待测元素容易挥发的样品基体挥发除去。确定最佳灰化温度和时间应考虑到：尽量除去样品基体，保证待测元素不受损失。如若遇到样品基体比待测元素易于挥发或在同一温度下挥发，可通过背景校正或选择合适的溶剂来处理样品。 （3）原子化温度和时间：原子化温度取决于待测元素和样品基体的挥发程度，最佳的原子化温度是能给出最大吸收信号的最低温度；最佳原子化时间是尽可能选取较短的时间，但仍能使原子化完全。原子化温度最高一般为2800℃为限，可通过实验办法确定。为了获 11
得一个峰态自由原子，升温应尽量快，进入冷却期时为了清除残留物质，可以加大电流使石墨炉达3000℃。 二、溶剂萃取比色法 前面介绍了样品消化液中金属离子可用鳌合溶剂萃取法进行提取与分离的原理。如果选择合适的鳌合剂，控制一定的萃取条件（如适当的pH值和掩蔽剂），所生成的金属鳌合物是有颜色的，则可以吸取有机相直接进行比色测定，这个方法称为溶剂萃取比色法。该法具有较高的灵敏度和选择性，设备简单，至今仍被选作国标法中金属离子含量测定的第二法或第三法（如铅、铜、锌、镉、汞等）。缺点是工作量大，耗用试剂、溶剂较多。 (一） 二硫腙比色法测定铅、锌、汞的含量 1.二硫腙的性质 二硫腙（Dithizone），又名打萨腙，二苯硫腙等，学名二苯基硫卡巴腙（Diphenyl thiocarbazone）在有机相中有两种互变异构型式： CH─NH─NH CH─NH─N 6565╲ ‖ C═S C─SH╱ ╱ CH─N═N CH─N═N 6565 (a)酮式 （b）烯醇式 二硫腙为紫黑色结晶粉末，可溶于CHCl及CCl中。溶液呈绿色，但浓度大时为两34色性（光通过时为红色，反射光呈绿色）；不溶于水，又不溶于酸，微溶于乙醇，可溶于氨碱性水溶液。 3+2+二硫腙在有氧化剂（例如Fe、Cu等）存在，日光照射下都易氧化为二苯硫卡巴二腙： CH─NH─NH CH─N═N 6565╲ ╲ 氧化物 C═S C═S日光，温度╱ ╱ CH─N═N CH─N═N 6565 此氧化物不溶于酸性或碱性水溶液，但溶于CHCl或CCl中，呈黄色至棕色。不与金34属起鳌合反应。市售的二硫腙中常含有此化合物，故使用时必需精制纯化。 2.二硫腙与金属离子的反应 ＋二硫腙含有活泼的H，能以一元酸或二元酸的形式与金属离子反应。当它分子中有1＋个H被金属离子所取代时，形成单取代二硫腙盐（primary dithizonate），大多数金属离子与二硫腙的反应生成单取代二硫腙盐。只有在碱性溶液中或二硫腙用量不足时才可能生成二取代二硫腙盐。 有人认为二硫腙盐，特别是二代二硫腙盐的结构是不确定的，即使是单取代二硫腙盐，由于金属不同，二硫腙盐的结构也不相同。 12
二硫腙盐的萃取性能主要决定于水相中的pH值和二硫腙试剂的浓度。稳定性较高的二硫腙盐，如Pt，Pd，Au，Ag，Hg，Cu等的二硫腙盐，可从强酸性溶液中萃取；Bi、Zn、In、Sn等的二硫腙盐则可以从微酸性溶液中萃取；而Co、Ni、Pb和Cd等的二硫腙盐只能从中性或碱性溶液中萃取。 ＋3Fe在碱性溶液中（含柠檬酸或酒石酸盐），能氧化二硫腙，特别是在含氰化物的碱性溶液更易氧化（生成高铁氰化物氧化二硫腙）。铜在碱性溶液中也氧化二硫腙。若于水溶液中加入还原剂盐酸羟胺，则可在相当大的程度上阻止氧化作用。 二硫腙可与许多金属离子起反应，故其选择性不高，但可以通过控制适当的pH值和应用掩蔽剂来提高它的选择性。常用的掩蔽剂有：EDTA，硫氰化物，氰化物，柠檬酸盐和酒石酸盐等。 金属离子的含量与二硫腙的用量有关。为使金属离子萃取完全，二硫腙的用量常常过量，需要过量的程度又与溶液的pH值有关，在较低pH值的情况下，二硫腙的用量一般过量较多。 铅与二硫腙的反应是在碱性溶液（pH8－10）中进行，如用氯仿作溶剂，则有较多的二硫腙留在氯仿中，可用氰化钾的氨性溶液洗去过多的二硫腙；若用四氯化碳溶液，因二硫腙的溶解性比在氯仿中约小30倍，相对来说易留在碱性水相，故有机相中残留的二硫腙很少。汞是在比较强的酸性溶液中萃取，必须用较强的碱溶液洗去过多的二硫腙。锌与银的测定，必须控制二硫腙在较低的浓度下进行萃取。镉是在较强碱性溶液中萃取，过多的二硫腙留在水相。 二硫腙与不同的金属离子所生成的金属鳌合物颜色从紫红色到橙黄色不等，当有机相中过量的二硫腙很少时进行比色测定，近似于单色法；一般的情况下有机相中都有过量的二硫腙，此时的比色测定称为混色法，故要求二硫腙使用液的浓度都很低，一般在％～％（W/V）。 3.铅含量的测定 （1）原理 样品经消化后，在－9时，铅离子与二硫腙生成红色络合物，可被CHCl等有机3溶剂萃取，颜色的深浅与铅离子浓度成正比。加入盐酸羟胺、氰化钾、柠檬酸铵等，防止铁、铜、锌等离子干扰，与标准系列比较定量。 （2）测定步骤 称取适量样品，用硝酸－硫酸法消化，或灰化后用硝酸溶液溶解，定容至50mL，吸取消化液和同量的试剂空白溶液，分别置于分液漏斗中，各加水至20mL。 吸取，，，，，铅标准使用液（相当0、1、2、3、4、5μg铅），分别置于125μL分液漏斗中，各加1％硝酸溶液至20mL。 于样品消化液、试剂空白液和铅标准液中各加柠檬酸铵溶液（200g/l），盐酸羟胺溶液（200g/l）和2滴酚红指示液，用氨水（1＋1）调至红色，再各加氰化钾溶液（100g/L），混匀。各加二硫腙使用液，剧烈振摇1min，静置分层后，三氯甲烷层经脱面滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷调节至零点，于波长510nm处测吸光度，各点减去零管吸收值后，绘制标准曲线或计算一元回归方程。 （3）计算 X=[(m1-m0)]×1000/[(m2×V2/V1)×1000] 式中：X－样品中铅的含量，mg/Kg或mg/L； m－测定用样品消化液中铅的质量，μg； 1 13
m－试剂空白中铅的质量，μg； 0 m－样品质量（体积），g（mL）； 2 V－样品消化液的总体积，mL； 1 V－测定用样品消化液体积，mL。 2（4）讨论 ①本实验所用玻璃仪器均采用10％～20％硝酸溶液浸泡过夜，用自来水反复冲洗，最后用去离子水冲洗干净。 ②柠檬酸铵是一种在广泛pH范围内有较强络合能力的掩蔽剂。它的主要作用是络合钙、镁、铅、铁等离子防止在碱性溶液中形成氢氧化物沉淀。 ③盐酸羟胺作为还原剂，保护二硫腙不被高价金属离子、过氧化物等所氧化，防止溶＋3液中Fe与氰化物生成赤血盐。 ④氰化物是较强的配位体，可掩蔽铜、锌等多种金属的干扰，同时也能提高pH值使之稳定在9左右。有剧毒！ ⑤本法选自GB/－1996中的第二法。用于铅含量测定的除了原子吸收分光光度法外，还有吡啶偶氮间苯二酚（PAR）法、催化极谱法、氢化物发生原子荧光光谱法等。 4．锌含量的测定 （1）原理 样品经消化后，在~时，锌离子与二硫腙形成紫红色络合物，溶于四氯化碳，加入硫代硫酸钠，可防止铜、汞、铅、铋、银和镉等离子干扰，与标准系列比较定量。 （2）测定步骤 吸取~定容的消化液和相同量的试剂空白液，分别置于125mL分液漏斗中，各加水至10mL。吸取、、、、、，锌标准溶液（相当0、1、2、3、4、5μg锌），分别置于125mL分液漏斗中，各加水至10mL。 于上述各分液漏斗中各加1滴甲基橙指示液，用氨水调至由红变篮，再各加5mL乙酸－乙酸钠缓冲液（2mol/L）及1mL硫代硫酸钠溶液（250g/L）混匀后，各加二硫腙－四氯化碳溶液（ （3）计算 X=[(m-m)×1000]/[m×V/V×1000] 10221式中：X－样品中锌的含量，mg/kg或mg/L；m—测定用样品消化液中锌含量，ug；m－10试剂空白液中锌的含量，ug；m－样品质量（体积），g(mL)；V－样品消化液的总体积，21mL；V－测定用消化液的体积，mL。 2（4）讨论 ①加入硫代硫酸钠除了掩蔽干扰离子外，还有还原作用，可保护二硫腙不被氧化，但也能与锌离子结合，故各管中加入量应一致。 2-②萃取时振荡时间必须充分，以保证锌离子由[Zn(SO)]转变为二硫腙－锌鳌合物，232且要求各管的振摇时间（不少于4min）、强度、次数一致。 ③本法选自GB/－1996之第三法，该标准的第一法为原子吸收分光光度法（见本节之一），第二法也为双硫腙比色法，所不同的是在第二法中，样品消化液中锌鳌合物经多次萃取后全部转移入溶剂相，再用 2+④此外还有吡啶偶氮萘酚（PAN）法，在PH5～11下，Zn与PAN生成红色鳌合物， 14
用CHCl萃取比色（560nm），但灵敏度不及二硫腙比色法。催化极谱法也可以达到较高灵3敏度（最低检出量为），但应用不普遍。 5．汞含量的测定 （1）原理 样品经消化后，汞离子在酸性溶液中可与二硫腙生成橙红色络合物，溶于三氯甲烷，与标准序列比较定量。 （2）测定步骤 样品用硝酸－硫酸消化法消化，煮沸除去二氧化氮后，再加高锰酸钾溶液至呈紫红色，然后加盐酸羟胺溶液（200g/L）使紫色褪去，加2滴麝香草酚兰指示液，滴加氨水至橙黄色（PH1~2），转移入125mL分液漏斗中。 吸取、、、、、、、汞标准使用液（ 于样品消化液、试剂空白液及汞标准液的各分液漏斗中加二硫腙使用液，剧烈振摇2min，静置分层后，将三氯甲烷经脱脂棉过滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷调节零点，在波长490nm处测吸光度，标准管吸光度减去零管吸光度，绘制标准曲线。 （3）计算 X=[(m－m)×1000]/[m×1000] 102式中：X－样品中汞的含量，mg/kg；m－样品消化液中汞的含量，ug；m－试剂空白液中10汞的含量，ug；m－样品质量，g。 2（4）讨论 ①汞与二硫腙的络合能力很强，在此酸性条件下，其余金属离子都不产生干扰。 ②用盐酸羟胺还原高锰酸钾时，会产生大量氯气与氮氧化物，操作时应不时摇动，并放置20min，使其逸放。 ③本法选自GB/－1996中的第二法，第一法为冷原子吸收光谱法（测汞仪法）。汞能在常温下蒸发为汞原子蒸气，对波长为的共振线有剧烈的吸收。冷蒸气技术仅适于汞，该法有很高的灵敏度和专一性，故称之为测汞仪法。该法除了原子化方法不同外，其余均与其它金属测定原理相同。样品经用压力消解法、回流消化法或五氧化二钒消化法消＋2化，有机汞转变为无机汞，在强酸强氧化剂条件下，无机汞以Hg形式存在，当加入足够2+的氯化亚锡时，Hg被还原为汞原子，导入测汞仪，用冷原子吸收测定生成的汞蒸气。其余方法应用较少。 （二）其他比色法测定锡、铜的含量 前面介绍了用二硫腙作为金属鳌合剂测定一些金属离子的应用例子。对于有些金属离子，还可选用专用性更强的鳌合剂进行反应，可以获得更好的效果。 1．锡含量的测定 （1）原理 样品经消化后，在弱酸性介质中四价锡离子与苯芴酮形成微溶性橙红色络合物，在保护性胶体存在下与标准系列比较定量，反应如下： 15
苯芴酮 橙红色络合物 （2）测定步骤 样品用硝酸－硫酸法消化，吸取～样品消化液和同量的试剂空白液分别置于25mL比色管中。吸取、、、、、锡标准使用液（相当0、、、、、锡），分别置于25mL比色管中。于上述各管中各加酒石酸溶液（100g/L）及1滴酚酞指示液，混匀，各加氨水（1＋1）中和至淡红色，加3mL硫酸（1＋9）、1mL动物胶溶液（5g/L）及抗坏血酸溶液（10g/L），再加水至25mL，混匀，再各加2mL苯芴铜溶液（ 后，用2cm比色杯以水调节零点，于波长490nm处测吸光度，标准各点减去零管吸光值后，绘制标准曲线或计算直线回归方程，样品吸光度与标准曲线比较或代入方程求出含量。 （3）计算 X=[(m1-m0)]/[(m2×1000)] 式中：X－样品中锡的含量，mg/Kg；m－测定用样品消化液中锡的质量，μg；m－样品质12量，g；m－试剂空白液中锡的含量，ug；V－样品消化液的总体积，mL；V－测定用样012品消化液的体积，mL。 （4）讨论 ①在PH1左右的酸性介质中，锡与苯芴铜反应成一种微溶的配合物，锡的浓度低时，配合物以溶胶的形式存在于溶液中，在有动物胶存在下，此红色胶体能长时间稳定，可用于比色测定。由于显色反应比较缓慢，故应放置一段时间后比色。天冷时可置37℃恒温箱中30min后再比色。 ②反应液的PH值对呈色影响较大，故标准液和样品液都先用氨水调至中性后再加其他试剂，以使PH值一致。 ③本法选自GB/-1996，最低检出浓度为2 mg/kg。此外还有乐精比色法、邻苯二酚紫法、二硫酚法和碘滴定法等。其中碘滴定法被认为是常量法中的经典法。其原理是：＋4样品消化后，在酸性条件下加氧化剂（如氯酸钾溶液）煮沸，低价锡全部转化为Sn，在＋＋42CO气体保护下，用铝粉将Sn全部还原为Sn，然后以淀粉溶液为指示剂，用标准碘溶2＋＋24液滴定，Sn被碘氧化为Sn，由所消耗碘的摩尔数计算出溶液中锡的含量。 也可用原子吸收光谱法，锡的吸收波长为。 2．铜含量的测定 （1）原理 样品经消化后，在碱性溶液中（PH9~11）铜离子与二乙基二硫代氨基甲酸钠（NaDDTC）生成棕黄色络合物，溶于四氯化碳，与标准系列比较定量。 二乙基二硫代氨基甲酸钠（Sodium diethyl dithiocaxbamate 简称NaDDTC），是最常用的氨荒酸盐中的一种，可与多种金属离子起络合反应，其金属鳌合物一般都不溶于水，易溶于有机溶剂，与金属离子的反应式如下： CH S S CH 2525╲ ∥ ╱ ╲ ╱ N─C Na C─N 16
╱ ╲ ╱ ∥ ╲ CHS S CH 25 25 NaDDC为白色晶体，在酸性溶液中易缓慢分解，生成乙二胺及二硫化碳，而在碱性溶液中则相当稳定。 （2）测定步骤 样品用硝酸－硫酸法消化或干法灰化，吸取消化液和同量的试剂空白液，分别置于125mL分液漏斗中，加水稀释至20mL。吸取、、、、、铜标准使用液（相当0、5、10、15、25ug铜），分别置于125mL分液漏斗中，各加稀硫酸（1＋17）至20mL。于上述各分液漏斗中，各加5mL柠檬酸铵—乙二胺四乙酸二钠溶液（200g+50g/L）和3滴酚红指示液，混匀，用氨水（1＋1）调至红色。各加2mL铜试剂溶液和 mL四氯化碳，剧烈振摇2min，静置分层后，四氯化碳经脱脂棉滤入2cm比色杯中，以四氯化碳调节零点，于波长440nm处测吸光度，标准各点吸光值减去零管吸光值后，绘制标准曲线或计算直线回归方程，样品吸光值与曲线比较或代入方程求得含量。 （3）计算 X=[(m-m)×1000]/[m×V/V×1000] 10221式中：x－样品中铜含量，mg/kg或mg/L；m—测定用样品消化液中铜的质量，ug；m－试10剂空白液中铜的质量，ug；m－样品质量（体积），g（mL）；V－样品消化液的总体积，21mL；V－测定用样品消化液体积，mL。 2(4)讨论 ①一般含量不高的铅、锌、铁、锡、汞等金属离子对铜的测定无干扰。但若铁的含量超过铜含量的50倍时，铁络合物的棕色可掩盖铜络合物的颜色，镍、钴、锰等有干扰，这些干扰离子均可用柠檬酸铵、乙二胺四乙酸二钠络合物掩蔽。 ②本法选自GB/－1996中的第二法。此法最低检测浓度为 第四节 砷、硒、氟的测定 一、砷的测定 （一）银盐法 1.原理 样品经消化后，以碘化钾、氯化亚锡将高价砷还原为三价砷，然后与锌粒和酸产生的新生态氢生成砷化氢，通过用乙酸铅溶液浸泡的棉花去除硫化氢的干扰，然后与溶于三乙醇胺——三氯甲烷的二乙基二硫代氨基甲酸银(AgDDC)作用，生成棕红色胶态银，比色定量。反应式如下： HAsO+2KI+2HCl=HAsO+I+2KCl+HO 343322HAsO+SnCl+2HCl=HAsO+SnCl+HO 3423342HAsO+3Zn+6HCl=AsH+3ZnCl+3HO 33322砷化氢被Ag-DDC溶液吸收，并且在有机碱（三乙醇胺）存在下，生成棕红色胶态银： AsH+6Ag(DDC)=+3HDDC +3NR+3HDDC=6Ag+AS(DDC)+3(NRH)(DDC) 33332．测定步骤 17
样品用硫酸－高氯酸－硝酸法消化或硝酸－硫酸法消化，消化液加适量水煮沸，除尽残余的硝酸后定容至50mL或100mL，控制定容后的溶液每10mL相当于1g样品，相当加入硫酸量1mL。样品也可用灰化法处理，加氧化镁和硝酸镁助灰化，残渣用6mol/L盐酸溶解后定容，控制定容后的溶液每10mL相当于1g样品，相当于加入盐酸量（中和需要量除外）。 吸取一定量的硝酸－高氯酸－硫酸或硝酸－硫酸消化后的定容液（相当于5g样品）及同量的试剂空白液，分别置于150mL锥形瓶中，补加硫酸至总量为5mL，加水至50～55mL。吸取，，，，，砷标准液（相当0，2，4，6，8，10ug砷），分别置于150mL锥形瓶中，加水至40mL，再加10mL硫酸（1＋1）。 对于干法消化的定容溶液（相当于5g样品），试剂空白液以及砷标准系列溶液，分别置于150mL锥形瓶中，加水至，再加浓盐酸。 于样品消化液、试剂空白液及砷标准溶液中各加3mL碘化钾溶液150g/L，酸性氯化亚锡溶液，混匀，静置15min。各加入3g锌粒，立即分别塞上装有乙酸铅棉花的导气管，并使管尖端插入盛有4mLAgDDC溶液的离心管液面下(如图13－4)，在常温下反应45min后，取下离心管，加氯仿补足至4mL，用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长520nm处测吸光度，绘制标准曲线。 3．计算 X=[m－m]×1000/[m×V/V×1000] 10221式中：x——样品中砷的含量，mg/kg或mg/L； m——测定用样品消化液中砷的质量，ug； 1 m——试剂空白液中砷的质量，ug； 0 m——样品质量（体积），g(mL)； 2 V——样品消化液的总体积，mL； 1 V——测定用样品消化液的体积，mL。 24．讨论 （1）砷化氢的吸收液由AgDDC、有机碱和溶剂组成，原先的方法是将AgDDC溶于吡啶中，吡啶既是溶剂又是有机碱，它具有沸点高、灵敏度和重现性好、配置方便等优点，不少标准方法仍推荐使用。但由于毒性及恶臭的原因，也有许多改良的报导，例如用生物碱（如马钱子碱、士的年、奎宁、麻黄素等）或其他有机碱（三乙胺、三乙醇胺等）的氯仿溶液作为吸收液。 （2）酸的用量对结果有影响，还受锌粒的规格、大小的影响，锌粒也不宜太细，以免反应太激烈。 （3）反应温度最好在25℃左右为宜，防止反应过激或过缓。 （4）氯化亚锡除起还原作用，可将As5+还原为As3+，并还原反应中生成的碘外，还可在锌粒表面沉积锡层，抑制氢气的生成速度，以及抑制某些元素的干扰，如锑的干扰等。 （5）本法选自GB/－1996中的第一法。最低检出浓度为 （二）砷斑法（古蔡氏法） 1.原理 样品经消化后，以碘化钾、氯化亚锡将高价砷还原为三价砷，然后与锌粒和酸产生的新生态氢生成砷化氢，再与溴化汞试纸生成黄色至橙色的色斑，与标准砷斑比较定量。 AsH+3HgBr→As(HgBr)+3HBr 3232As(HgBr)+AsH→3AsH(HgBr)（黄褐色） 332As(HgBr)+AsH→3HBr+AsHg（黄色） 33232．测定步骤 18
样品消化同银盐法，吸取一定量的样品消化后定容的溶液及同量的试剂空白液分别置于测砷瓶中（图13－5），加5ml碘化钾溶液（150g/l），5滴酸性氯化亚锡溶液及5ml盐酸（样品如用湿法消化，则要减去样品中硫酸毫升数），再加适量水至35ml。 吸取，，砷标准溶液（相当0，，砷），分别置于测砷瓶中，各加5mL碘化钾溶液（150g/L），5滴酸性氯化亚锡溶液及5mL盐酸，各加水至35mL。 于以上各测砷瓶中各加3g锌粒，立即塞上预先装有乙酸铅棉花及溴化汞试纸的测砷管（如图13－5），于25℃放置1h，取出溴化汞试纸，将样品及试剂空白与标准砷斑比较。 图13－4 银盐法测砷装置 图13－5 砷斑法测砷装置 1－150mL锥形瓶；2－导气管 1－锥形瓶；2－橡皮塞；3－测砷管； 3－乙酸铅棉花；4－10mL刻度离心管 4－管口；5－玻璃帽 4．计算 同银盐法。 5．讨论 （1）HS对本法有干扰，遇溴化汞试纸亦会产生色斑。乙酸铅棉花应松紧合适，能顺2利透过气体又能除尽HS。 2（2）锑、磷等都能使溴化汞试纸显色，鉴别方法是采用氨蒸熏黄色斑，如果先变黑再褪去为砷，不变时为磷，变黑时为锑。 （3）同一批测定用的溴化汞试纸的纸质必须一致，否则因疏密不同而影响色斑深度。制作时应避免手接触到纸，晾干后贮于棕色试剂瓶内。 （4）本法选自GB/-1996中的第二法，最低检出浓度为 （三）其他方法 砷钼蓝法曾获得广泛的应用，砷经萃取分离（三氯化砷在8—12molHCl介质中被萃取进入四氯化碳、氯仿或苯中）后，用硝酸将其氧化为正五价，在适宜的酸性条件下与钼酸铵溶液（内含％钼酸铵和％的硫酸联氨，后者起还原剂作用），反应生成砷钼杂多酸，随即被还原为砷钼蓝，可在水相中或萃取进入丁醇溶剂中于730nm处测吸光度。 ＋2，3－二硫基丙基黄酸砷（5）和碱性染料（如结晶紫，耐尔蓝A等）也可生成离子缔合物，可用来测定砷。 无火焰原子吸收分光光度法是一个较新的测砷方法，它具有操作简便，灵敏度高（最低检测量为）的优点。其原理是：食品中的砷经硫酸、硝酸消化为五价砷，用碘化＋5+3钾－抗坏血酸使As还原为As，再经硼氢化钾溶液还原为砷化氢，随即被氮气导入石英原子化器中被原子化，然后在光路中测定砷原子对砷空心阴极灯发射的谱线的吸收，用标准曲线法测定含量。测定条件可参考表13－6。 19
表13－6 测砷的无焰原子吸收法条件 波长（nm） 石英管炉电压（V）140 狭缝宽度（nm） N流量（L/min） 1 2灯功率（w） N压力（Mpa） 2用示波极谱法测定砷的含量也可获得满意的结果：在碘化氨硫酸溶液中，样液中的三价砷在含有一定量碲的条件下，于电位约处（对饱和电极）产生尖锐的对称波，其峰值电流与砷浓度成正比，用标准曲线法定量。 二、硒的测定 （一）荧光法 1．原理 在PH约的溶液中，2，3－二氨基萘（2，3－diaminonaphthalene，简称DAN）选择性的与四价硒离子反应，生成4，5－苯并芘硒脑（4，5－benzopiaselenol）绿色荧光物质，用环己烷萃取，其荧光强度与硒含量成正比。反应式如下 2．测定步骤 称取适量样品（含硒量约为～）于磨口三角瓶中，加入10mL去硒硫酸溶液（5＋95），样品湿润后，再加20mL混合酸液放置过夜，次日于砂浴上逐渐加热，溶液颜色6+由激烈反应至无色、产生白烟、淡黄色至终点。必要时可补加10mL（1＋9）盐酸，使Se4+全部还原为Se。 于样品消化液中加20mLEDTA混合液，用氨水（1＋1）或盐酸调至淡红橙色（~）。以下步骤在暗室中进行。加3mLDAN试剂，混匀，至沸水浴中煮5min，取出立即冷却，加3mL环己烷，振摇4min，将全部溶液移入分液漏斗，待分层后弃去水层，环己烷层转入带塞试管中，小心勿使混入水滴，于激发光波长376nm，发射光波长520nm处测荧光强度。 硒标准曲线绘制：准确吸收硒标准使用液（ 3．计算 x=[（F－F）×m]/[（F－F）×m] 101202式中：x－样品中硒含量，ug/g；F－样品管荧光读数；F－标准管荧光读数；F－空白120管荧光读数；m－标准管中硒含量，ug；m－试样质量，g。 124．讨论 （1）测定中所用的环己烷不得有荧光物质，不纯时可重蒸后使用。 （2）市售硫酸一般都含有硒，可用氢溴酸除硒。 （3）本法选自GB/T12399-1996中的第一法。检出限为3ng。也可用氢化物原子荧光光谱法（第二法）：样品经酸加热消化后，在6mol/L盐酸介质中，将样品中的6价硒还原成4价硒，用硼氢化钠（NaBH）或KBH作还原剂，将四价硒在盐酸介质中还原成硒化氢（SeH），442由载气（氩气）带入原子化器中进行原子化，在硒特制空心阴极灯照射下发出特征波长荧光，其荧光强度与硒含量成正比，与标准系列比较定量。该法准确度、精密度高，快速简便，但需原子荧光光度计，普及度不高。 20
（4）其他方法还有：在酸性介质中，一些芳香族邻二胺也可与四价硒起显色反应而用于测定硒，如邻苯二胺、4－二甲氨基－1，2－苯二胺、4－甲基－邻苯二胺等。 二硫腙也曾被用于测硒的灵敏的分光光度法，也可作为硒的萃取分离供原子吸收分光光度法。 三、氟含量的测定 （一）扩散－氟试剂比色法 1．原理 食品中氟化物在扩散盒内与酸作用，产生氟化氢气体，经扩散被氢氧化钠吸收。氟离子与镧（Ⅲ）、氟试剂（茜素氨羧络合剂）在适宜PH下生成蓝色三元络合物，颜色随氟离子浓度的增大而加深，用或不用含胺类有机溶剂提取，与标准系列比较定量。 2．测定步骤 （1）扩散单色法 对于谷物、蔬菜、水果等样品，称取可食部分干燥、粉碎、过筛（40目）。对于含脂肪高，不易粉碎过筛的样品，如花生、肥肉，含糖分高的果实等，需碱化后（固定氟）灰化。 取塑料扩散盒若干个[盒内径，深2cm，盖内壁顶部光滑，并带有凸起的圈（盛放氢氧化钠吸收液用），盖紧后不漏气。]，分别于盒盖中央加 称取～处理后的样品（或相当同量样品的灰分）于塑料盒内，加4mL水使呈均匀分布状 。另取6个塑料盒分别加0、、、、、氟标准溶液（相当0，1，2，4，6，8ug氟），补加水至4mL。分别于各盒中加入4mL硫酸银－硫酸溶液（20g/L）。立即盖紧，轻轻摇匀（切勿将酸溅在盖上），置55℃恒温箱内保温20h。 将盒取出，取下盒盖，分别用20mL水少量多次将盒盖内氢氧化钠薄膜溶解，并转移入100mL分液漏斗中。 分别于分液漏斗中加茜素氨羧络合剂溶液，缓冲液，丙酮，硝酸镧溶液，水，混匀，放置10min。各加入二乙基苯胺－异戊醇溶液（5＋100），振摇2min，待分层后弃去水层，将有机层过滤于10mL带塞比色管中。用1cm比色杯于580nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。 （2）扩散复色法 样品处理，以及氟的扩散、吸收同（1）法。保温20h后，将盒取出，取下盒盖，分别用10mL水分次将盒盖内氢氧化钠薄膜溶解并定量转移入25mL带塞比色管中。分别于比色管中加茜素氨羧络合剂溶液，缓冲液，丙酮，硝酸镧溶液，再加水至刻度，混匀，放置20min，以3cm比色杯于580nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。 3．计算 x=[A×1000]/[m×1000] 式中：x——样品中氟的含量，mg/kg； A——测定用样品中氟的质量，ug； m——样品的质量，g。 4．讨论 （1）茜素氨羧络合剂又名茜素络合酮（Alizarin Complexone,M=），是微溶于水的姜黄色粉末，在水溶液中随PH值的改变而产生不同的颜色。在～时，它与镧盐生成红色螯合物，又与氟离子生成蓝色三元络合物。此反应是本法的基础，反应式如下： 21
3+3+2+2+2+2+2+（2）Al、Fe、Pb、Cu、Zn、Ni、Co及草酸、柠檬酸、酒石酸盐都有干扰，氯化物、硫酸盐、高氯酸盐大量存在时也能引起干扰，故氟化氢经分离后才能测定。本法采用扩散法分离，也能采用蒸馏法分离：样品灰化后在硫酸酸性下蒸馏分离，蒸出的氟化氢被氢氧化钠溶液吸收，再与氟试剂、硝酸镧作用。 （3）PH值对三元络合物的颜色有影响（随pH值升高而变深），一般推荐pH值～。缓冲液中的乙酸盐可催化此三元络合物的生成。 （4）在水介质中，镧－茜素氨羧－氟的络合物不稳定，如若加入能与水混合的有机溶剂，如乙腈、丙酮、异丙醇、甲醇则可以克服，实验证明加入丙酮或乙腈十几分钟后显色即达到稳定，且24小时内恒定不变。 （5）所生成的氟三元络合物在有机碱存在下可以从弱酸溶液中萃取，被推荐的萃取剂有：二乙基胺－异戊醇，三乙胺－戊醇，二辛胺－异丁醇等。 （6）本法选自GB/－1996中的第一法。最低检出浓度为 （二）氟离子选择电极法 1．原理 氟离子选择电极的氟化镧单晶膜对氟离子产生选择性的对数影响，氟电极和饱和甘汞电极在被测试液中，电位差可随溶液中氟离子活度的变化而改变，电位变化规律符合奈斯特(Nernst)方程式。 氟电极与甘汞电极在溶液中组成一对电化学电池。利用电动势与离子活度的线性关系可直接求出样品溶液中氟离子的浓度。 2．测定步骤 称取粉碎过40目筛的样品，置于50mL容量瓶中，加10mL盐酸（1＋11），密闭浸泡提取1h（不时轻轻摇动），应尽量避免样品粘于瓶壁上。提取后加25mL总离子强度调节缓冲液，加水至刻度，混匀备用。 吸取0，，，，氟标准使用液（相当0，1，2，5，10ug氟），分别置于50mL容量瓶中，于各容量瓶中分别加入25mL总离子强度调节缓冲液，10mL盐酸（1＋11），加水至刻度，混匀备用。 将氟电极和甘汞电极与测量仪器（精密酸度计或离子计）的负端和正端相联接。电极插入盛有水的25mL塑料杯中，在电磁搅拌下读取平衡电位值，更换2～3次水，待电位值平 22
衡后，即可进行样液与氟标准液的电位测定。 以电极电位为纵坐标，氟离子浓度为横坐标，在半对数座标纸上绘制标准曲线。 3．计算 x=[A×V×1000]/[m×1000] 式中：x——样品氟的含量，mg/kg； A——测定用样液中氟的浓度，ug/mL； m——样品质量，g； V——样液总体积，mL。 4．讨论 （1）氟化镧（LaF）单晶膜电极的半电池与饱和甘汞电极的半电池组成一个完整的电3化学电池： 氟电极的组成，其内充溶液和分析溶液是同一电解质（氟化物）组成，仅有浓度的差异，放在此体系中，氟化镧单晶膜电位可以看成为浓差电位，其大小与离子活度的关系遵守Nernst方程式： －E=E－（RT/F）logC 0 F－(2)Nerllst方程式中的C为氟离子活度。在稀溶液中，离子间距离较大，相互间作用力F影响很小，故浓度与活度可看作相等。但溶液中其他离子的存在有影响，活度与浓度之差，决定于溶液的“总离子强度”，并且与它成正比。为使得活度与浓度之差有一固定值，故加入“总离子强度调节缓冲液”加以调节。 （3）加入“总离子强度调节缓冲”还有以下作用： ① 对PH值有缓冲作用，使PH值保持在～； －② 其中所含的柠檬酸根可络合被测液中的铝和铁，使F从铁、铝的氟络和物中释放出来。 －－6③ 使离子反应速度加快，如10mol/LF在纯水中平衡时间需1小时，加入离子调节剂后在10分钟之内即可达到平衡，加快了平衡速度。 ④ 被测溶液的PH值对氟离子活度和浓度有影响。通常在氟离子含量较低时，理想的－－－2PH范围为5～6。PH低于4时，氟开始形成HF而降低了F的活度。PH大于7时，OH－－对F有干扰，且氟化镧单晶在碱性溶液中会释放出F： －－LaF(固)＋3OH＝La(OH)(固)＋3F 33 ⑤ 本法选自GB/－1996中的第三法，本法不适用于脂肪含量高而又未经灰化的样品。 （三）其他方法 锆与许多有机试剂，如茜素红S（又名茜素磺酸钠，CHOSNa·HO），铬菁R（搔14772洛菁R，CHOS），对磺基苯偶氮变色酸（SPADNS，CHNOSNa），二甲酚橙等，2318916921133生成有色配合物，当有氟离子时，氟离子与锆形成更为稳定的无色氟化锆配合物，从而使溶液褪色。由颜色的减少而测出氟离子的含量。 同样的原理也可利用钍与一些有机试剂生成有色配合物而测定氟化物，这些有机试剂如茜素红S，苯基荧光酮，二甲酚橙，试钍灵I，络天青S(CAS)等。 -9离子色谱法可测出微量的氟离子（10级），检测中的阴离子经过阴离子交换柱被分离，各种离子的保留时间取决于离子对树脂的亲和力、淋洗液、柱长和流速，用电导检测器测量电导率，可同时测量卤素离子，硝酸盐、亚硝酸盐、硫酸盐、硝酸盐等阴离子的含量。 23
思考题： 1、 常见食品中限量元素的含量范围及其测定意义。 2、 测定食品中限量元素时为什么需要分离和浓缩？鳌合溶剂萃取分离的原理是什么？ 3、 影响金属鳌合物萃取平衡的因素有哪些？如何消除干扰金属离子的影响？ 4、 原子吸收分光光度计的工作原理是什么？其组成主要有哪些基本单元？ 5、 原子吸收法中原子化器的作用是什么？有些什么类型？如何选用？ 6、 介绍二硫腙的性质及其与金属离子的反应。 7、 砷的测定主要有哪些方法，砷斑法的基本原理是什么？ （张水华） 24
第十四章 食品中有害物质的检测 第一节 概论 一、有害物质与有毒物质的概念 在食品的安全检测方面, 我们常常会碰到“有害物质”与“有毒物质”的概念。那么什么是“有害物质”？在自然界所有的物质中, 当某物质或含有该物质的物质被按其原来的用途正常使用时, 若因该物质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭受破坏时, 则称该物质为有害物质。从对机体健康影响的角度可将有害物质分为普通有害物质、有毒物质、致癌物和危险物。那么什么又是“有毒物质”呢？一般的定义为凡是以小剂量进入机体, 通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质。根据这一定义可知, 有毒物质是相对的, 剂量决定着一种成分是否有毒, 因而, 一般有毒物质的毒性分级也是以中毒剂量作为基准的。参考 表 14-1。 表14-1 毒物毒性分级 毒性分级 大白鼠一次口服半数致死人一次性致死量（g/kg） 量 （LD mg/kg） 50 剧毒 < 1 < 高毒1~~ 中等毒 50~500 ~ 低毒500~~15 微毒 >5000 > 15 二、 食品中有害物质的种类与来源 食品中有害物质可分为三类：一是生物性有害物质, 如黄曲霉、李斯特菌、口蹄疫致病菌等；二是化学性有害物质, 如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金属、放射性元素等；三是物理性有害物质, 如金属屑、石子、动物排泄物等。这些有害物质的主要来源有：不当地使用农药、兽药, 包括施药过量、施药期不当或使用被禁药物；来自加工、贮藏或运输中的污染, 如操作不卫生、杀菌不合要求或贮藏方法不当等；来自特定食品加工工艺, 如肉类薰烤、蔬菜腌制等；来自包装材料中的有害物质，某些有害物质可能移溶到被包装的食品中；来自环境污染物，如二恶英、多氯联苯等；以及来自食品原料中固有的天然有毒物质。 三、 加强食品中有害物质检测的必要性 我国是农产品生产总量第一的农业大国, 增加农民收入的关键在于大力发展农产品的深加工, 而农产品深加工的关键是食品加工。我国加入世贸组织（WTO）后, 每年有大量农产食品进出口贸易。加入世贸组织要求履行世贸组织的“贸易技术壁垒协议（TBT）”和“实施卫生与动植物检疫措施协议（SPS）”, 这使食品安全卫生方面的壁垒日益突出, 给我国农水产品的出口造成严重影响。另一方面, 随着社会的发展人们越来越关心自身健康, 对食品安全性的要求越来越高, 使得世界各国不断降低食品中有害物质的最高残留限量(MRL）的数值, 这对检测水平提出了新的要求。 第二节 食品中有害物质常用的检测方法 一、薄层色谱法 (Thin rayelaphoygraotmrch） （一）薄层色谱的原理 1
薄层色谱法属于色谱法的一种, 色谱法(chromatography, 简称色谱)最初是一种分离技术, 是依靠不同的被分离物质在固定相和流动相二者间的分配系数的不同而使混合物达到分离的技术。依靠该技术所得到的谱图（pattern）称为色谱图（chromatogram）。 薄层色谱的原理是将吸附剂涂布于诸如玻璃板、铝薄板等固相支持物, 经干燥后形成薄层板, 当点有样品的薄层板被放入盛有流动相的层析缸中时, 在流动相沿固定相（即吸附剂）移动的过程中,样品中不同的组分受到来自固定相和流动相的作用力不同,致使各组分的在固定相上迁移的速率不同, 从而使得各组分被分开。被分离的各组分在薄层板上形成不同的斑点, 斑点的位置常用比移值(Rf)来表示： Rf ＝ 斑点中心到原点中心距离／展开剂前沿到原点中心距离 在一定的色谱条件下, 物质的Rf值是一定的, 因此可以用Rf值进行定性分析。 （二）常用的固定相： 薄层分析中常用的固定相有硅胶、氧化铝、纤维素、硅藻土、氢氧化钙、硫酸钙等, 其中最常用的是硅胶, 包括普通硅胶和改性硅胶。普通硅胶的表面是极性硅醇基（－Si－OH）, 能与极性化合物和可极化的化合物形成氢键而表现出吸附性能。改性硅胶是采用化学方法, 将有机分子以共价键连接到硅胶表面的硅醇基上, 键合的有机分子带有－CN、－NH3或－(OH) 等极性基团的称为正相键合, 一般用于分离非极性或极性较小物质；键合的有机分子2带有十八烷基、辛烷基或乙基等非极性基团的称为反相键合, 一般用于分离极性较大的物质。其工作原理如图 14-1。 流动相: 正己烷 流动相: 乙氰/水 C-iS-O-iSHOiS81 的极性较大非极物性质物质HOHOiS-iS-O-iSHCHC()HC 22613HOiS HCH3 固定相: 普通硅胶 流动相:C改性硅胶接近性非物极质18HCHC33 的极性较小HO物质 图14-1. 正相色谱（左）与反相色谱（右）的工作原理图 （三）常用的有机溶剂： 对于有机溶剂而言, 介电常数大则极性大, 其在正相色谱中的洗脱能力强。表14-2中列出了几种常用溶剂的介电常数及其在正相色谱中的相对洗脱能力。由于介电常数与溶剂的纯度有很大的关系, 因此采用高纯度的溶剂是提高实验结果可重复性的基础。在实际操作中, 使用混合溶剂的机会比使用单一溶剂的机会要多得多。 （四）吸附剂的活度级别与吸附力、含水量及Rf值的关系 物质之所以能在吸附剂（以硅胶、氧化铝或正相键合硅胶为例）的薄层上分离，是因为吸附剂的表面及其孔隙的表面存在许多活性点，被吸附物质（极性或可极化的物质）的量及被吸附的牢固程度在其它条件一定的条件下取决于活性点的强度（单位面积的表面能量）及数目（单位质量的表面积），单位质量吸附剂所含活性点的数目越多、活性点的强度越大，则吸附剂的活度越高，即，对物质（极性或可极化的物质）的吸附能力越强，被吸附物质的Rf值就越小。当此类吸附剂的含水量增加时，吸附剂的活性点被水中羟基占据的数目增多，因此，自由活性点减少，吸附剂的活度变小，吸附力也变小，于是被吸附物质的Rf就变大。因此, 为了使薄层板的水分含量相对一致, 使用对薄板进行活化可以使Rf值具有较好的重 2
现性。 Brockmamnn和Schodder根据氧化铝及硅胶对偶氮苯、苏丹红等染料的Rf值（分以CCl4及CHCl作展开剂）按活度由大到小的顺序将氧化铝及硅胶的活度分为I～V级。活度级别3为I级时表示活度最大，活度级别为V级时活度最小。表14-3列出了薄层吸附剂的活度级别与含水量、吸附力及Rf值的关系。 表14-2 几种常用溶剂的介电常数及其在正相色谱中洗脱能力变化趋势 中文名称 英文名称 介电常数 (25 ℃) 洗脱能力 正己烷 环己烷 Cyclohexane 苯 四氯化碳 carbon tetrachloride 氯仿乙酸乙酯 ethyl acetate 四氢呋喃 Tetrahydrofuran (20 ℃) 二氯乙烷 Dichloroethane 增强正丁醇n-butanol 异丙醇 丙酮Acetone 乙醇 甲醇Methanol 乙氰 (20℃) 水Water 甲酰胺 Formamide 110 (20℃) 表 14-3 硅胶、氧化铝的活度级别与含水量、吸附力及Rf值的关系 含水量（％） 活度级别 吸附力/ Rf值 硅胶 氧化铝 吸附力减弱I -- 值II10 3 增加III 126IV15 10 V 2015 二、气相色谱法 (Gas y) omatographrch（一）气相色谱仪的组成 气相色谱的流动相是气体。按固定相状态的不同, 又可分为气液色谱和气固色谱；按柱内径的粗细可分为填充柱（包括柱内径为3~6 mm的普通柱及柱内径大于9 mm的制备柱）和毛细管柱（柱内径小于 mm）。气相色谱仪如图 14-1所示，由载气、调压系统、进样系统、色谱柱、控温系统、检测器等组成。此处仅简介在现代分析技术中经常应用的毛细管柱气相色谱。 3Rf
图 14-2 气相色谱仪组成示意图 （二）毛细管柱的选择 气相色谱的毛细管柱的内径 ~ mm, 长30～45 m, 材质有铜、不锈钢、玻璃和尼龙。毛细管柱的极性依其内表面所涂固定相的极性有极性、中性和非极性之分。柱的选择主要考虑柱的极性应与待测物的极性相匹配。表14-4介绍了毛细管柱应用于部分危害物检测的范围。另外固定相膜厚、内径及柱长也是应考虑的因素。 表14-4 GC毛细管柱的选择与部分危害物的分析 固定相 极性 应用 二甲基聚硅氧烷 非极性 胺类、烃类、杀虫剂、多氯联苯类、酚类、硫化物、调料和香精 （5%）-二苯基-（95%）-二甲基聚硅氧烷 或 非极性 生物碱、药物、脂肪酸甲酯、氯代化合（5%）-二苯基-（95%）-二甲基亚芳基聚硅氧烷 物痕量分析、半挥发性物质 (6%)-氰丙基苯-(94%)-二甲基聚硅氧烷 弱至中芳氯物、醇类、杀虫剂、挥发性物质 极性 (35%)-二苯基-(65%)-二甲基聚硅氧烷 或 中极性 芳氯物、胺类、杀虫剂 (35%)-二苯基-(65%)-二甲基亚芳基硅氧烷共聚物(14%)-氰丙苯基-(86%)-二甲基聚硅氧烷 中极性 杀虫剂、除草剂、芳氯物 (50%)-二苯基-(50%)-二甲基聚硅氧烷 中极性 药物、乙二醇类、杀虫剂、甾类 (50%)-三氟丙基苯-(50%)-二甲基聚硅氧烷 极性 醛类、含氯有机物、有机磷化合物 (50%)-氰丙基苯-(50%)-二甲基聚硅氧烷 中至极脂肪酸甲酯、醛醇乙酸酯、中性甾醇 性 INNO相(TM)键合聚乙二醇 极性 醇类、游离酸类、芳烃、香精油 键合/交联改性聚乙二醇用于碱性化合物分析 极性 胺类和其他碱性化合物 TPA改性聚乙二醇 极性 酸、醇、醛、酮、腈类、丙烯酸酯类 (50%)-氰丙基-(50%)-二甲基聚硅氧烷 极性 脂肪酸甲酯顺/反同分异构体 4
（三）检测器的选择 检测器用于检测色谱柱流出物组成的变化。常用的GC检测器在食品有害物检测面的应用见表14-5。另外，最近有二种或几种检测器联用的报道，这样可扩大被检测化合物的范围，降低负面的干涉。如采用FID/XSD（卤素检测器）组合的FM-2000 便携式气相色谱可以用一个或两个检测器通道选择性地检测芳香族和含氯化合物,大大提高了选择性和灵敏性。 表14-5 常用的GC检测器在食品有害物检测中的应用 检测器 原理 优点 缺点 氢火焰 当有机物被载气带入, 经火焰离简单,稳定, 适于检测烃类对N、S、P有离子化 子化,正、负离子在电场作用下向有机物的通用检测器 机物响应低 (FID) 两极迁移而形成信号 电子俘获载气通过电离室被β放射源作对多氯联苯、二恶英、金检测器易污(ECD) 用产生基流,当电负性物质俘获属有机物等电负性物质具染 电子时则基流降低,即为ECD对高灵敏度和选择性,适宜 电负性物质的响应 于农药残留分析 氮磷检测器改进了FID,使火焰与铷盐接触,对含N、P有机物响应较淬灭* （NPD） 提高氮磷有机物灵敏度 FID高三个数量级,适宜于 农药残留分析 火焰光度有机物被载气带入，经火焰离子选择性检测器，对含S、P淬灭* (FPD) 化产生特征光谱,经滤光片、光电有机物响应较FID高三个 培增管吸收转变成信号 数量级,适于农残分析 脉冲式火焰独特脉冲火焰改进FPD，原理同对含S、P的农药和有机价格昂贵 光度 (PFPD) FPD 锡等化合物比FPD具有 更高的灵敏度和选择性 *火焰型检测器有易灭火和易淬灭的缺点。前者指进样体积大时引起缺氧产生灭火，后者指选择型检测器当其它杂质较多时，引起被检测的信号减弱或消失。 （四）气相色谱法的注意要点 1． 载气：应是化学惰性气体, 最常用的载气有氦气、氢气、氮气。高纯度的载气对于保护毛细管柱免受伤害是很重要的。对于氦气和氢气的纯度要求达到％～％, 即使采用最高纯度的载气, 也要求通过去氧处理。高纯度的氦气和氢气价格很贵, 因此可以采用普通纯度的气体（%）与串连载气净化器相结合的方式来降低分析成本。氮气不可用于毛细管柱, 只用于填充柱。 应根据检测器的要求来选择载气。 2． 柱端压力差：色谱柱两端的压力差是很重要的。通常色谱柱的出口端压力（p）是1大气压, 而载气入口端的压力（p）一般维持在2~3 个大气压。压力差过大或过小都会降低2物质的分离效率。对于一般的分析工作只采用附于载气钢瓶上的压力调节计就可以, 但对于精细的分析则要求准确的辅助压力计。 3． 柱温控制：好的气相色谱仪有单独的色谱柱加热源。当待测混合物的组分少, 沸程 5
窄时, 直接将柱温升至某一温度（通常为待分离物质中沸点最高物质的沸点的2/3）进行分析。但当待测混合物的组分多, 沸程宽时, 则应当采用程序升温（programmed temperature）, 即, 柱温随着分析时间的增加而呈线性或阶段性增加, 从而使不同沸点的物质在相应的柱温下被分离开, 这样不仅可以缩短分析的时间, 也可以改善峰形, 提高定量分析的准确性。 4． 柱预处理：进样分析之前, 应将柱温升至高出计划最高分析温度20度（但应在色谱柱允许的温度范围内）, 同时通以载气, 载气的流速控制在很小的水平（5-10 mL/min）, 如此预处理色谱柱至少10 h。以防止上次分析柱内残留杂质的干扰。 5． 进样：一般采用气相色谱专用注射器（注射针锐尖, 有别于液相色谱的平头注射器）取气体样品进样~ mL , 液体样品进样1~100 µℓ, 通过预先加热的进样口（injection port）注射到气化室中, 以便液体样品能够迅速气化。先进的仪器其进样口带有单独的加热源。对于采用毛细管柱的气相色谱, 由于毛细管柱的容量仅为零点几个微升的液体样品, 所以需要一个分样器来将上述大量的样品分成两部分, 其中小的部分进入毛细管柱, 而大的部分弃去。对于待测组分含量很少的样品需要选用不分流进样。 6． 检测器的灵敏度：亦称响应值或应答值, 即, 单位变化量的样品进入检测器后所引起的检测信号变化的大小, 用公式可表示为： S ＝ ∆R/∆Q。应当注意检测器的灵敏度与仪器的灵敏度以及分析方法的灵敏度是不同的概念。检测器的灵敏度考察的只是检测器的特性, 仪器的灵敏度考察的是包括检测器在内的整个仪器的特性, 而分析方法的灵敏度考察的是整个仪器及分析条件（如色谱柱、检测器、柱温、流动相等）的加合特性。事实上, 一般所说的灵敏度都是指一定分析条件之下的仪器的灵敏度, 亦即, 某一分析方法的灵敏度。 三、高效液相色谱法（igh Hperformance liquid yaotograpmhrch，HPLC） （一）高效液相色谱仪的组成 高效液相色谱的流动相为液相, 属于柱色谱的一种, 但它不同于经典的采用玻璃柱和重力引流的“慢”而“重复性差”的普通柱色谱, 高效液相色谱采用不锈钢柱及高压促流, 而且填充料的粒径小而均匀, 从而达到了“快”而“重复性好”的高效效果。HPLC柱长～30 cm, 内径1～5 mm, 填充剂粒子的直径3～50 µm。高效液相色谱仪包括贮液瓶、泵、进样阀、色谱柱、检测器及数据处理器等部件, 见图14-3。 常用的高效液相色谱法包括正相色谱、反相色谱、离子对色谱、离子交换色谱、离子色谱、排阻色谱。在这些高效液相色谱法中, 以反相高效液相色谱最常用, 占高效液相色谱法的70％～80％。 图14-3 高效液相色谱仪组成示意图 6
（二）常用的HPLC检测器: 检测器 原理 灵敏度应用范围 紫外可见样品对紫外/可见光的吸＋ 适用于对紫外或可见光有吸收的物质，分光光度 收度与样品的浓度成比例 可用于胺、芳胺、联苯胺、有机酸, 线 性范围宽；可采用梯度流动相 视差折光 样品池与参比池的折光指－ 适用于同流动相折光率不同的样品组数差与色谱流出物中样品分，主要用于糖类化合物的检测，不适的浓度成比例 用于采用梯度流动相的检测 二极管阵原理同UV检测器；工作＋ 适用于有紫外吸收者，应用于农药、不列 (PDA) 方式为在同一时间UV光 稳定极性除草剂、杀菌剂、杀虫剂等 谱峰可经多波长确认 电化学 氧化还原中电子转移形成＋＋ 适用于有还原电位者，可用于测定维生 电动势差 素、无机阴离子等 荧光 利用特定物质发光中荧光＋＋ 适用于能产生荧光或能与产生荧光的 释放进行检测 物质衍生化者。如多环芳烃、氨基甲酸酯、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等的测定。 蒸发激光雾化、加热使流动相蒸发＋＋ 检测挥发性低于所使用流动相的任何光散射 从而测定剩余样品颗粒的物质 （ELSD） 光散射 质谱 不同的物质在一定能量的＋＋ 适用于各种物质的检测，但仪器昂贵 （SIM） 电子轰击下可电离产生不同的离子峰谱 （三）色谱柱的保护 色谱柱是HPLC重要组成部件, 价格较贵, 懂得色谱柱的保护, 不仅可以提高分析的灵敏度及准确度, 而且可以延长柱的使用寿命。一般应从以下几个方面加以保护色谱柱： 1． 溶剂的纯度：有机溶剂要求色谱纯, 水要求三蒸水。 2． 流动相的选择：正相柱不可选用极性溶剂, 反相柱不可选用非极性溶剂。以缓冲溶液为流动相的, 要考虑色谱柱的容许pH值范围。 3． 微膜过滤：无论是流动相还是样品都不可有不溶性的颗粒存在, 因此要求对两者在分析前采用水溶液用或有机溶剂用的微孔滤膜（微孔～ µm）进行过滤。 4． 脱气：流动相在使用时必须经过脱气处理, 可采用超声波与抽真空相结合的办法。一般处理10～20 min, 流动相为水或水所占的比例大时, 脱气时间长些, 流动相为有机溶剂时, 脱气时间短些。 5． 保护柱：保护柱是一个与主色谱柱性能相似的很短的小色谱柱。当保护柱堵塞或污染时, 可以更换一个新的保护柱, 这样可以大大地延长色谱柱的使用寿命。 6． 洗柱：色谱柱易受污染而失活, 需要进行清洗以使之再生, 一个行之有效的方法是采用分析用流动相以 mL/min的流速冲洗一夜。对于正相硅胶柱而言, 先用100 mL 的异丙醇洗柱后, 再用极性减弱的溶剂如丙酮、氯仿最后用正己烷各100 mL, 以 2～4 mL/min 的流速进行清洗。对于反相柱而言, 若清洗前的流动相是缓冲液则先用水清洗, 再用50 mL 7
的甲醇或乙氰清洗。对于用于蛋白分离色谱柱, 其中保留的蛋白质则可以先用100 mL 8 mol/L的尿素水溶液清洗, 再用水清洗。注意, 不要太轻易地抛弃一根柱子。 四、质谱法（ ssaMoypocsrtcepS，SM） (一) 质谱仪的组成 质谱法（MS）是使所研究的混合物或单体在一定的条件下形成气态离子, 然后使气态离子通过依赖电/磁场作用的质量分析器, 使各离子按质荷比大小的不同,依次到达收集器, 并产生信号, 经过检测记录, 即可得到这些离子峰的信息。世界上第一台抛物线质谱仪是由英国人汤姆逊（Thomson）于20世纪10年代研制出来的。 早期的质普法主要是测定原子质量和同位素丰度。自20世纪50年代初期质谱仪进入有机分析领域以来, 质谱技术有了飞速发展, 现今的质谱仪器已汇集了当代先进的电子技术、高真空技术和计算机技术, 质谱已成为食品危害物质分析不可缺少的工具。 如图14-3所示质谱仪由进样系统、离子源系统、质量分析器、检测器及真空系统组成。 进样系统 离子源 质量分析器离子检测器 真空系统 质谱图 图14-4 质谱仪组成示意图 真空系统: 在质谱分析过程中,为了避免离子源灯丝损坏, 离子损失,负反应增多等负面-6-8影响, 质谱仪从离子的产生到离子被检测器捕捉, 系统要求必须保持在10~10 Pa 的高真空状态。 进样系统: 样品在通入离子化室之前必须保证是气态,因此, 进样系统常置于150 ℃的恒温箱中,这一温度对于气体或挥发性强,沸点低的液体样品是合适的,对于难挥发的液体样品,可提高恒温箱的温度,但一般控制在200 ℃以下,以防止一些有机化合物热分解, 热稳定性高的化合物温度可提高到400 ℃。固体样品则需置于固体样品气化瓶中加热气化。样品-2气化后,通过扩散小孔直接进入真空度为10 Pa 的贮气球中,再由细小的铂片漏气孔导入离子化室。 离子源: 是质谱仪的心脏,其作用是使样品分子或原子电离成离子。最常用的离子源有电子轰击离子源, 化学电离, 场电离, 快原子轰击, 二次离子质谱, 场解吸及大气压离子源, 其中, 电子轰击离子源产生的离子流率高,稳定性好,灵敏度高,因而应用最广泛。 质量分析器: 其作用是将离子源来的离子按质荷比的大小进行分离和排列。目前有四种质量分析器: 单聚焦质量分析器, 双聚焦质量分析器, 飞行时间质量分析器以及四极质量分析器,各质量分析器的分离原理请参考相关资料。 离子检测器: 质谱检测器有三种: 照相板, 法拉第环及电子倍增管, 其中,照相板是应用最早的质谱检测器,目前只用在某些无机质谱仪中; 法拉第环检测器方便,廉价,但灵敏度差; 电子倍增管检测器灵敏度高且时间差可以忽略,是现代质谱仪中最常用的检测器。 （二）质谱的表示方法： 在质谱分析中, 质谱的表示方法主要有图形和表格两种形式。图14-5是甲苯的质谱图, 8
表14-7是甲苯的质谱。在质谱图中, 横坐标为质荷比、纵坐标为离子相对丰度, 每个质谱峰表示一种质荷比的离子。 将最强的峰的丰度作为基准峰（100％）, 其他离子峰的丰度采用相对于基准峰丰度的百分比来表示, 质谱峰的丰度与该种离子的含量成正比。根据质谱峰出现的位置,即质荷比,可以进行定性分析；根据质谱峰的丰度可进行定量检测。对于有机化合物可以根据质谱峰的质荷比和相对丰度确定其分子结构。 表14-7 甲苯的质谱表 m/e 相对丰度 （％） m/e 相对丰度 （％） 16 65 11 45 91 100 (基峰) ＋50 92 68 （M） 94 图14-5 甲苯的质谱图 （三）质谱峰的类型： 一种分子的质谱图中一般有许多个质谱峰, 因为在离子源中分子不仅是简单地失去一个电子, 而且化学键也常常断裂而形成带正、负电荷及中性的碎片, 另外分子或离子还可以发生重排。在质谱图中比较重要的质谱峰有分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、重排峰及亚稳离子峰。一种分子的质谱峰受分子结构、离子源的种类、离子源的能量及仪器构造的影响。 1. 分子离子峰与碎片离子峰 ＋一个分子失去一个电子即为分子离子（也称母离子, M）, 在一个化合物的质谱图中分子离子峰是除了同位素峰之外质荷比最大的质普峰, 在质谱的右侧, 其质量即为化合物的分子量M。形成分子离子所需的能量很低, 一般有机分子的电离能在7～15 eV的范围, 而电子轰击源常选用的轰击电子能量为50～80 eV, 因此, 被轰击的分子, 除了形成分子离子外, 尚有足够的能量使化学键断裂, 形成带正、负电荷及中性的碎片粒子, 有机分子也可能获得一个电子而成为阴离子, 但这种几率只有千分之一左右。其中, 带正电的分子离子和碎片离子, 能够到达检测器而被检出,表现在质谱图上为分子离子峰和碎片离子峰；中性粒子不能被磁场加速, 不会有中性粒子的质谱峰；带负电的阴离子, 运动到相反的方向, 在一般的质谱仪中也检查不出来。 9
2. 同位素离子峰 组成有机化合物的元素除了P、I和F外, 其他常见元素如H、C、N、O、S、CI和Br12 等都有天然同位素, 不同元素的天然同位素的丰度是不同的, 如C的丰度是%,13323334C,% ; S的丰度是%, S, %, S, %. 分子离子峰(M)由丰度最大的由同位素元素组成, 若分子中含有比丰度最大的同位素大一个或两个质量单位的一种和几种同+++位素时, 则在质谱图中将会出现分子离子峰的伴峰, 即同位素峰(M＋l), (M＋2), (M+3), +(M+4)。同位素峰的相对丰度比与同位素的丰度比是相当的，因此借用同位素峰的信息可以帮助判断某一元素在化合物中是否存在。 3. 重排离子峰 分子离子裂解时,除简单的断裂外产生碎片离子外,还可能发生原子或原子团的重排,产生比较稳定的重排离子, 形成重排离子峰。 发生重排的基团常常是氢原子,最典型的重排方式是 γ-氢原子转移到羰基氧原子上。可以发生这类重排的化合物有: 含C=O, P=O, S=O基团的化合物, 另外,烯烃类和苯环化合物的分子断裂时也易发生重排。 4. 亚稳离子峰 有些离子在进入接受器之前可能发生碰撞而断裂形成亚稳离子。亚稳离子峰比较容易识别,峰的相对丰度小, 峰钝,比一般质谱峰宽2-5倍, 质荷比通常不是整数。通过亚稳离子峰可以了解离子的断裂部位, 并确定丢失的中性碎片,有助于推断化合物的结构。 五、色谱-质谱联用技术 质谱仪（MS ）具有灵敏度高、定性效果好的特点, 它可以确定化合物的分子量、分子式甚至官能团。但是, 一般的质谱仪只能对单一组分给出良好的定性, 对混合物是无能为力的, 且进行定量分析也较复杂。而色谱仪(气相色谱仪和液相色谱仪)对混合物中各组分的分离和定量有着显著的优势,但严格来说,色谱仪难以做定性分析, 因色谱仪是依靠保留时间来定性的,而同一物质的保留时间在不同的分析条件下常常不同,所以仅用色谱难以进行确切的定性。 因此两者的有效结合可提供一种对复杂化合物最为有效的定性定量分析的方法。色谱和质谱联用的关键问题是如何解决色谱的流出物与质谱相连的接口转换。 目前常用的色谱-质谱连用方法有:气相色谱一质谱联用（GC-MS）, 液相色谱一质谱联用（LC-MS）, 另外还有串联质谱联机（MS-MS）, 毛细管区带电脉一质谱联用（CZE-MS）等等。在此只简单地介绍前两种方法。 （一）气相色谱一质谱联用 气相色谱在常压条件下工作, 流出组分也处于常压, 且带有大量的载气, 而质谱仪则在高真空条件下工作, 流出组分不能直接进人质谱仪, 两者联用时要有接口转换, 以解决常压到真空的过渡并分离载气浓缩被测组分。 图14-6 喷嘴分子分离器原理图 常用的接口是喷嘴分子分离器, 原理图如图14-6所示。其工作原理是基于气体分子量不同, 扩散速度也不同。分子量小的气体, 如色谱流出物中的大量载气氦, 扩散快, 由入口进人低真空室时, 大部分被扩散而分离。进入b入口时, 被测组分的分子量大、扩散慢而浓集, 10
在高真空室, 样品进一步浓集, 至C出口时已除去了载气组分并达到高真空的质谱工作条件。 用于与GC联用的质谱仪中四极质量分离器由于具有较快的扫描速度而应用得比较多。组分从分离器出来经离子源电离后, 位于离子源出口狭缝安装的总离子流检测器检测到离子流信号, 经放大记录后成为色谱图。当某组分出现时, 总离子流检测器发出触发信号, 启动质谱仪开始扫描而获得该组分的质谱图。 气-质联用技术目前已成为食品危害残留物质分析的主要手段之一。然而对于高温下不能汽化或热不稳定的物质仍需要采用高效液相色谱法, 具有高灵敏度和高选择性的液相色谱一质谱技术是近年来农残分析发展最快的手段之一。 （二）液相色谱一质谱联用 同气相色谱一质谱联用相比, 液相色谱和质谱联用的难度大得多。因为液相色谱分离试样时, 用了大量的溶剂作流动相, 如果直接将液相色谱流出物送人质谱仪器,则远远超过质谱仪器真空系统所能承受的范围, 而且还会导致混乱的质谱数据。如何有效地除去流动相而尽可能地少损失或不损失样品是LC-MS联用技术的关键。目前,研究理想的LC-MS接口仍是LC-MS联用技术中颇为热门的难题。 图14-7 传送带式LC-MS接口 传送带式接口是一种较成熟的接口方法。它的结构示意图如图14-7, 它是由一根不锈钢或聚酰亚胺传送带将LC流出物通过加热后, 除去溶剂, 并在送入离子源的端头时通过瞬间加热, 使样品送入离子源电离。剩余样品由清洗带用加热器加热后除去。这种接口对挥发性的非极性溶剂, 传送量可达 mL/min, 但对极性溶剂如水等, 则只能以～ mL/min 的流量送入; 而且这种接口的不锈钢带存在记忆效应与热催化作用; 聚酰亚胺又受温度限制, 因而在使用上也受到很大限制。 最近, 发展了热喷雾接口和离子喷雾接口。在热喷雾接口中, 来自LC的流出液通过不锈钢柱直接进人喷雾器中, 靠高速空气或氮气的喷射变成细雾, 细雾被同轴气体吹入加热器内气化, 再进入大气压下化学电离源(APCI)反应区电离, 样品离子再进人质谱仪分析。热喷雾LC-MS接口的方法可用于热稳定性较好的化合物分析。在离子喷雾接口中, 被分析样品液体进入一个带有高电压的喷雾器, 形成带有高电荷微滴的雾, 当微滴蒸发时, 形成含有一个或多个电荷的离子, 进入质谱可以进行pg级分子完全分析, 这对于只有极少量样品的分析极为重要。 六、酶联免疫吸附剂测定（y emznE dekniL tnebrosonummI, yassAASILE） （一）ASLIE分析法的基本原理 ELISA测定法的实质是采用酶标记的抗体或抗原(或抗抗体)与样品中的抗原或抗体间 11
进行的抗原一抗体反应。该法的优点是：①可以通过颜色来快速做定性结果分析；②特异性强；③灵敏度高；④酶标板上一次可作多份样品检测。 （二）ASLIE标记酶的特点及种类 ELISA检测法中对标记酶的要求很高, 应具备：①纯度高、溶解性高、特异性强、稳定性高；②测定方法应简单、敏感、快速；③与底物作用后会呈现颜色；④与抗体交联后仍保持酶的活性。最常用的是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）, 它广泛存在于植物界, 辣根中的含量尤高。HRP是一种糖蛋白, 由酶蛋白和铁卟啉结合而成, 相对分子质量为40000, 其底物是二氨基联苯胺（DAB）, DAB经酶解可产生棕褐色沉淀物, 因而可用目测或用比色法测定。此外, 还有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶和Beta-D-半乳糖苷酶等可供应用。 （三）ASLIE分析法的类型 ELISA可用于测定抗原, 也可用于测定抗体。常用的是以下三种类型： 1. 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法, 如图14-8所示, 操作步骤 如下。 图14-8 双抗体夹心法 a. 将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质。 b. 加受检标本 使之与固相抗体接触反应一段时间, 让标本中的抗原与固相载体上的 抗体结合, 形成固相免疫复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 c. 加酶标抗体 使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标 抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 d. 加底物 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该 抗原的定性或定量。 根据同样原理, 将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物, 即可用双抗原夹心 法测定标本中的抗体。 2. 间接法 间接法是检测抗体最常用的方法, 如图14-9所示, 其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体, 故称为间接法。操作步骤如下。 图14-9 间接法 12
a. 将特异性抗原与固相载体连接, 形成固相抗原 洗涤除去未结合的抗原及杂质。 b. 加稀释的受检血清, 其中的特异抗体与抗原结合, 形成固相抗原抗体复合物。经洗 涤后, 固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原 结合, 在洗涤过程中被洗去。 c. 加酶标抗抗体 与固相复合物中的抗体结合, 从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤 后, 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。 d．加底物显色 颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原, 可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 3. 竞争法 竞争法可用于测定抗原, 也可用于测定抗体, 如图14-10所示 。以测定抗原为例, 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合, 因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下。 图14-10 竞争法 a. 将特异抗体与固相载体连接, 形成固相抗体, 然后洗涤。 b. 待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液, 使之与固相抗体反应。如受检 标本中无抗原, 则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原, 则与酶标抗 原以同样的机会与固相抗体结合, 竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会, 使酶标 抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原, 保温后, 酶标抗原与固相抗体的结 合可达最充分的量。然后洗涤。 c. 加底物显色 对照管中由于结合的酶标抗原最多, 故颜色最深。对照管颜色深度与 待测管颜色深度之差, 代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡, 表示标本中抗原含量越多。 （四）ASLIE试剂盒 目前ELISA试剂盒已得到广泛宣传。现在市面上关于针对抗生素残留检测的商品化ELISA试剂盒有许多, 例如英国Randox公司、德国r-Biopharm公司、意大利Tecna及美国Idexx公司等的产品。其中在中国使用较多的是英国Randox公司和德国r-BioPharm的产品。英国Randox公司ELISA试剂盒已获AOAC认可, 2001年12月21日国家质量监督检验检疫总局推荐 Randox公司的ELISA试剂盒作为动物激素、抗生素残留的首选筛选试剂。 13
第三节 食品中农药残留及其检测 农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草及其它有害生物, 以及有目的地调节植物、昆虫生长的药物的通称。目前, 全世界实际生产和使用的农药品种有上千种, 其中绝大部分为化学合成农药。按用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、植物生长调节剂和杀鼠药等；按化学成分可分为有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类、苯氧乙酸类、有机锡类等；按药剂的作用方式, 可分为触杀剂、胃毒剂、熏蒸剂、内吸剂、引诱剂、驱避剂、拒食剂、不育剂等。按其毒性可分为高毒、中毒、低毒三类；按杀虫效率可分为高效、中效、低效三类；按农药在植物体内残留时间的长短可分为高残留、中残留和低残留三类。 农药残留是指由于喷施农药后存留在环境和农产品、食品、饲料、药材中的农药及其降解代谢产物, 还包括环境背景中存有的污染物或持久性农药的残留物再次在商品中形成的残留。一般来说, 农药残留量是指农药本体物及其代谢物的残留量的总和, 表示单位为mg／kg。当农药过量或长期施用, 导致食物中农药残存数量超过最大残留限量（MRL）时, 将对人和动物产生不良影响, 或通过食物链对生态系统中其他生物造成毒害。本节主要介绍目前市面上使用比较普遍的几类农药的残留分析, 包括：有机氯类农药、有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药、拟除虫菊酯类农药等的残留分析。 一、有机氯农药残留及其检测 1. 有机氯农药的性质及常见品种 有机氯农药（Organochlorine pesticides, OCPs）是具有杀虫活性的氯代烃的总称。通常, OCPs分为三种主要的类型, 即DDT及其类似物、六六六和环戊二烯衍生物。这三类不同的氯代烃均为神经毒性物质, 脂溶性很强, 不溶或微溶于水, 在生物体内的蓄积具有高度选择性, 多贮存于机体脂肪组织或脂肪多的部位, 在碱性环境中易分解失效。 常见的有机氯农药有滴滴涕,DDT, 六六六 (也称BHC, 工业品是多种异构体的混合物, 其中, 生物活性组分γ-BHC仅占15％左右, 其余均为无效组分), 林丹(lindane, 99％γ-BHC), 氯丹(chlordane), 硫丹(endosulfan), 毒杀芬(camphechlor), 七氯(heptachlor), 艾氏剂(aldrin), 狄氏剂(dieldrin), 异狄氏剂(endrin)等。 由于这类农药具有较高的杀虫活性, 杀虫谱广, 对温血动物的毒性较低, 持续性较长, 加之生产方法简单, 价格低廉, 因此, 这类杀虫剂在世界上相继投入大规模的生产和使用, 其中, “六六六”、DDT等曾经成为红极一时的杀虫剂品种。但, 从20世纪70年代开始, 许多工业化国家相继限用或禁用某些OCPs, 其中主要是DDT、“六六六”及狄氏剂。我国早已停止生产和使用有机氯农药。但由于其性质稳定, 在自然界不易分解, 属高残留品种, 因此在世界许多地方的空气、水域和土壤中仍能够检测出微量OCPs的存在, 并会在相当长时间内继续影响食品的安全性, 危害人类健康。 2. GC-ECD法测定有机氯农药残留 在有机氯农药分析领域, 最为广泛使用的检测技术是气相色谱／电子捕获检测器（GC-ECD）, 它具有灵敏度高、分离效果好、定量准确等特点。此处介绍的方法节录自GB/T 17332-1998,主要适用于粮食、蔬菜等作物中机氯农药残留的检测。 （1）原理 样品中的有机氯农药经石油醚提取, 硅藻土柱层析净化后, 采用气相色谱-电子捕获检测器检测, 根据色谱峰的保留时间定性, 外标法定量。 （2）样品提取 1○ 粮食：称取10 g 粮食试样于三角瓶中, 加入20 mL石油醚, 振荡30 min。 ② 蔬菜：称取20 g样品于三角瓶中, 加入30 mL丙酮和30 mL石油醚, 捣碎、提取2 min, 14
过滤, 向滤液加入100 mL 2％硫酸钠溶液, 摇匀, 静置分层, 下层溶液用 20 mL ⅹ 2 石油醚萃取, 合并三次石油醚萃取液, 过无水硫酸钠层, 浓缩至10 mL。 （3）净化与浓缩 在玻璃层析柱中自下而上依次加入1 cm高无水硫酸钠、5 g 5％灭活弗罗里硅土 (层析用弗罗里硅土于620 ℃灼烧4 h 后备用, 用前140 ℃烘2 h, 趁热加5％水灭活)、1 cm高无水硫酸钠, 轻轻敲实, 先用20 mL 石油醚淋洗柱, 弃去淋洗液, 柱面要留有少量石油醚液, 准确吸取2 mL 提取浓缩液上柱, 用100 mL 石油醚-乙酸乙酯（95 ：5）洗脱, 洗脱液浓缩至小量, 用少量石油醚定容至1 mL, 供GC分析。 （4）测定-色谱条件 色谱柱：石英毛细管柱, mm ⅹ 15 m, 内涂OV-101固定液 温度：180 ℃以5 ℃/min升至230 ℃保持30 min, 进样口及检测器温度为250 ℃。 载气流速：氮气40 mL／min 进样量: 1 µℓ (4) 含量计算: 略。 3. 薄层色谱法测定有机氯农药残留 (1) 原理 食品样品中的有机氯农药 (如六六六及DDT类) 经提取、净化、浓缩、点样后, 在氧化铝薄层上被分离, 用硝酸银显色, 经紫外线照射可生成黑色斑, 与标准品比较可进行定性和半定量。 （2）样品处理 提取、净化及浓缩 均同气相色谱法。 (3) 测定 1○ 薄层板的制备：称取氧化铝 G 9 g, 加 l mL 1％硝酸银溶液及13 mL水于研钵中研磨成糊状, 立即涂布在三块 10 cm ⅹ 20 cm玻璃板上, 薄层厚度 mm, 于 100 ℃烘 h, 置干燥器中, 避光保存。 2○ 点样：在同一薄层板的底端 2 cm处, 用微量注射器或经标定的自制点样微管点3～10 ul的测定液和标准品液。保证至少有4个标准品点, 标准品的点样量为 gµ、 µg、 gµ、 µg, 各点相距 cm 。 3○ 展开剂：丙酮-石油醚＝1 ：99, 体积比 4○ 显色：将展开、晾干的薄层板于通风厨中喷以10 mL1％硝酸银显色剂, 吹干后距紫外灯8 cm 处照射10～20 min, 则六六六、DDT各异构体呈现棕黑色斑点。分别测量六六六、DDT各异构体斑点的Rf值。 5○定性定量分析：对照比较样液斑点与标准斑点的Rf值即可对六六六、滴滴涕等各个异构体进行定性分析。采用目测比较法进行半定量, 即目测样品斑点的大小、颜色深浅, 与一系列相应的标准农药异构体斑点相比较, 进而近似地估测原样品中的含量。 二、 有机磷农药残留及其检测 1. 有机磷农药的特性及种类 有机磷农药（OPPs）是含有C—P键或C—O—P、C—S—P、C—N—P键的有机化合物。在农药方面, 它不但可以作为杀虫剂、杀菌剂, 而且也可以作为除草剂和植物生长调节剂。大部分有机磷农药不溶于水, 而溶于有机溶剂, 在中性和酸性条件下稳定, 不易水解, 在碱性条件下易水解而失效。 目前正式商品化的有机磷农药有上百种。常见的有代表性的或影响较大的有机磷农药有敌敌畏(dichlorvos), 二溴磷(naled), 久效磷(monocrotophos),磷胺(phosphoamidon), 对硫磷 15
(parathion),甲基对硫磷(parathion-methyl),杀螟硫磷(fenitrothion),倍硫磷(fenthion),内吸磷（1059, demeton）, 双硫磷(temephos),毒死蝉(chlorpyrifos)二嗪农(diazinon),辛硫磷(phoxim),氧乐果(omethoate),丙溴磷(profenofos),甲拌磷（3911, phorate）,马拉硫磷(malathion),乐果(dimethoate),甲胺磷(methamidophos),乙酰甲胺磷(acephate),敌百虫(Trichlorfon), 杀虫畏(tetrachlorvinphos),杀螟威( GC3583), 杀螟腈(cyanophos), 异丙胺磷(isofenphos)等。 有机磷杀虫剂由于药效高, 易于被水、酶及微生物所降解, 很少残留毒性等, 因而从20世纪40年代到70年代得到飞速发展, 在世界各地被广泛应用, 有140多种化合物正在或曾被用作农药。但是, 有机磷杀虫剂存在抗性问题, 某些品种存在急性毒性过高和迟发性神经毒性问题。从70年代以后, 有机磷杀虫剂的研究和开发速度大大放慢了, 但在杀虫剂领域, 目前它仍被广泛使用。过量或施用时期不当是造成有机磷农药污染食品的主要原因。有机磷农药主要是抑制生物体内的胆碱脂酶的活性, 导致乙酰胆碱这种传导介质代谢紊乱, 产生迟发性神经毒性, 引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹甚至死亡。 2 有机磷农药的检测 文献中报导的有机磷农残分析方法包括色谱法、波谱法和酶抑制法三大类, 而以色谱法中的GC及HPLC法应用的最多。AOAC在20世纪80年代就对大部分有机磷农药建立了气相色谱分析方法。近年来, AOAC又有近半数的有机磷农药建立了HPLC检测法。 我国食品卫生国家标准GB/T 17331-1998采用的是气相色谱法检测有机磷农残。该法的适用范围是粮食、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留（见后文）的检测, 此处将蔬菜中有机磷农药残留的检测方法的主要内容节录如下。 （1） 原理 样品中残留的有机磷和氨基甲酸酯类农药经有机溶剂提取, 并经液液分配、微型柱净化等步骤除去干扰物质, 采用气相色谱-氮磷检测器（GC-FTD）法检测, 根据色谱峰的保留时间定性, 外标法定量。 （2） 样品提取：称10 g蔬菜试样于三角瓶中, 加入与样品含水量之和约为10 g 的水和20 mL丙酮, 振荡提取30 min 后, 过滤, 取20 mL 滤液于分液漏斗中, （3）净化与浓缩：向分液漏斗中加入40 mL凝结液（5 g 氯化铵＋10 mL 磷酸＋100 mL 水, 用前稀释5倍）和1 g 助滤剂 celite545, 轻摇后放置5 min, 过滤, 滤液加入3 g NaCl, 用约50、50、30 mL二氯甲烷萃取三次, 合并二氯甲烷萃取液, 经无水硫酸钠漏斗过滤, 滤液在35 ℃水浴上浓缩至少量, 用氮气吹干。残渣用少量正己烷溶解, 然后上微型（1 g 硅胶, 正己烷湿法装柱）硅胶层析柱, 依次用4 mL 正己烷-丙酮(7:3), 4 mL 乙酸乙酯, 8 mL 丙酮-乙酸乙酯(1:1), 4 mL 丙酮-甲醇 (1:1)洗脱, 合并洗脱液, 45 ℃下浓缩近干, 用丙酮定容至1 mL, 供GC分析。 （4）测定-色谱条件 色谱柱：石英毛细管柱, mm ⅹ 25 m, 内涂OV-101或 BP5固定液 检测器: 氮磷检测器 温度：140 ℃以5 ℃/min升至185 ℃保持2 min,再以2 ℃/min升至195 ℃继而以10 ℃/min升至235 ℃保持1 min, 进样口温度为240 ℃。 22气流速体：氮气50 mL／min, 氢气 kg/ cm, 空气 kg/ cm, 进样量: 1 µℓ (4) 含量计算: 略。 三、 氨基甲酸酯类农药残留及其检测 1. 氨基甲酸酯类农药的性质及常用品种 氨基甲酸酯类农药, 可视为氨基甲酸的衍生物, 氨基甲酸是极不稳定的, 会自动分解为 16
CO2和HO, 但氨基甲酸的盐和酯均相当稳定, 该类农药通常具有以下通式： 2 R2ROOC－N1 CH3 其中, R几乎都是苯环、稠环、杂环等基团, 其羟基化合物 ROH往往呈弱酸性；R是112氢或者是一个易于被化学或生物方法断裂的基团。大多数氨基甲酸酯类的纯品为无色和白色晶状固体, 易溶于多种有机溶剂中, 但在水中溶解度较小, 只有少数如涕灭威、灭多虫等例外。氨基甲酸酯一般没有腐蚀性, 其储存稳定性很好, 只是在水中能缓慢分解, 提高温度和碱性时分解加快。 常见的氨基甲酸酯农药有甲萘威(carbaryl), 戊氰威(nitrilacarb), 呋喃丹（carbofuran）, 仲丁威（fenobucarb）, 异丙威（isoprocarb）, 速灭威（metolcarb）, 残杀威 （propoxur）, 涕灭威 （aldicarb）, 抗蚜威（pirimicarb）, 灭虫威（methiocarb）, 灭多威 （methomyl）, 恶虫威（bendiocarb）, 硫双灭多威（thiodicarb）, 双甲眯（amitraz）等。 这些氨基甲酸酯农药在农业生产与日常生活中, 主要用作杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀软体动物剂和杀线虫剂等。20世纪70年代以来, 由于有机氯农药受到禁用或限用, 且抗有机磷农药的昆虫品种日益增多, 因而氨基甲酸酯的用量逐年增加, 这就使得氨基甲酸酯的残留情况倍受关注。 2. 氨基甲酸酯类农药残留的测定 GC-ECD法测定氨基甲酸酯类农药残留与本节有机磷农残的测定方法相同,详见GB/T 17331-1998。 四、 拟除虫菊酯类农药残留及其检测 1. 拟除虫菊酯的特性及常用品种 拟除虫菊酯（pyrethroids）是近年来发展较快的一类重要的合成杀虫剂。拟除虫菊酯分子较大, 亲脂性强, 可溶于多种有机溶剂,在水中的溶解度小, 在酸性条件下稳定,在碱性条件下易分解。 拟除虫菊酯具有高效、广谱、低毒和生物降解等特性, 拟除虫菊酯和除虫菊酯杀虫剂在光和土壤微生物的作用下易转变成极性化合物, 不易造成污染。拟除虫菊酯在化学结构上具有共同的特点之一是分子结构中含有数个不对称碳原子, 因而包含多个光学和立体异构体。这些异构体又具有不同的生物活性, 即使同一种拟除虫菊酯, 总酯含量相同, 若包含的异构体的比例不同, 杀虫效果也大不相同。 常见的拟除虫菊酯有烯丙菊酯（allethrin）, 胺菊酯（tetramethrin）, 醚菊酯（ethofenprox）, 苯醚菊酯（phenothrin）, 甲醚菊酯（methothrin）氯菊酯（permethrin）, 氯氰菊酯（cypermethrin）, 溴氰菊酯（deltamethrin）, 氰菊酯（fenpropanate）, 杀螟菊酯（phencyclate）, 氰戊菊酯（fenvalerate）, 氟氰菊酯（flucythrin）, 氟胺氰菊酯（fluvalinate）, 氟氰戊菊酯 （flucythrinate）, 溴氟菊酯（brothrinate）等。 1973年第一个对光稳定的拟除虫菊酯苯——醚菊酯开发成功之后, 溴氰菊酯、氯氰菊酯、杀灭菊酯等优良品种相继问世。目前, 已合成的菊酯数以万计, 迄今已商品化的拟除虫菊酯有近40个品种, 在全世界的杀虫剂销售额中占20％左右。拟除虫菊酯主要应用在农业上, 如防治棉花、蔬菜和果树的食叶和食果害虫, 特别是在有机磷、氨基甲酸酯出现抗药性的情况下, 其优点更为明显。除此之外, 拟除虫菊酯还作为家庭用杀虫剂被广泛应用, 它可防治蚊蝇、蟑螂及牲畜寄生虫等。 2. 拟除虫菊酯的残留的检测 参考本节中有机氯农药残留的检测, 详见 GB/T 17332-1998。 17
第四节 食品中兽药残留及其检测 一、兽药残留的种类与危害 典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是, 随着集约化养殖生产的开展, 一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂, 也属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRLVD）是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位 µg/kg, 以鲜重计）。兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期(是指自停止给药到动物获准屠宰或其动物性产品获准上市的间隔时间)过短, 是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。常见兽药残留的种类如下。 1. 抗生素类药物 多为天然发酵产物, 是临床应用最多的一类抗菌药物, 如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应, 四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等, 极度超敏反应可能导致过敏性休克, 甚至死亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食品, 可损害听力及肾脏功能。 2. 磺胺类药物 主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺眯, 菌得清、新诺明等。近年来, 磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象, 在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后, 药物可不断在体内蓄积。磺胺类药主要以原形及乙酸磺胺的形式经肾脏排出, 在尿中浓度较高, 其溶解度又较低, 尤其当尿液偏酸性时, 可在肾盂、输尿管或膀眈内析出结晶, 产生刺激和阻塞, 造成泌尿系统损伤。引起结晶尿、血尿、管型尿、尿痛、尿少甚至尿闭。 3. 硝基呋喃类药物 主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋喃类残留后, 对人体造成的危害主要是胃肠反应和超敏反应。剂量过大或肾功能不全者, 可引起严重毒性反应, 主要表现为周围神经炎、药热、嗜酸性白细胞增多、溶血性贫血等。长期摄入可引起不可逆性末端神经损害, 如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等, 我国尚未制定硝基呋喃类药物残留检测国家标准。 4. 抗寄生虫类药物 主要用于驱虫或杀虫, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用残留有苯并咪唑类药物的动物性食品, 对人主要的潜在危害是其致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形, 如短肢、兔唇等; 对所有消费者来说, 可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色体畸变, 从而其后代有发生畸形的危险。 5. 激素类药物 主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度, 使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素(包括多种内源性性激素、人工合成的类似性激素的类固醇化合物、人工合成的具有性激素某些特性的非类固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮, 丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。正常情况下, 动物性食品中天然存在的性激素含量是很低的, 因而不会干扰消费者的激素代谢和生理机能。但摄入性激素残留超标的动物性食品, 可能会影响消费者的正常生理机能, 并具有一定的致癌性, 可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。 二、兽药残留检测举例 （一）HPLC法测定肉中四环素族药物残留 1. 原理 样品经提取, 微孔滤膜过滤后直接进样, 用反相色谱分离, 紫外检测器检测, 与标准比 较定量。 18
2. 混合标准溶液：分别吸取 mg/mL土霉素、四环素的稀盐酸溶液各 l mL, mg/mL金霉素水溶液 2 mL, 置10 mL容量瓶中, 加蒸馏水至刻度。此溶液每毫升含土霉素、四环素各 mg , 金霉素 mg, 临用现配。 3. 样品处理 :称取 5 g切碎的肉样（< 5 mm）, 置于 50 mL三角烧瓶中, 加入5％高氯酸 25 mL, 振荡提取10 min, 2000r／min离心3 min, 上清经 µm滤膜过滤, 取10 µℓ 滤液注入HPLC。 4. HPLC条件 检测器：紫外检测器, 波长为355nrn, 色谱柱：ODS C18, 5 µm, mm ⅹ 15 cm, 流动相：乙睛／ mol/L磷酸二氢钠溶液（用 30％硝酸调pH ）= 35/65 (V/V), 流速： mL／min, 柱温：室温。 （二）GC-ECD法测定食品中硝基呋喃唑酮残留 1. 原理 将样品用乙酸乙酯抽提、浓缩后, 溶于异丙醇, 加入稀盐酸, 加热分解, 所得的5-硝基呋喃醛用弗罗里硅柱精制后, 用GC测定。 2．标准溶液及处理: 取纯5-硝基呋喃醛用含内标物七氯（heptachlorodicyclopentadiene）的苯溶液（约10 ng／mL）配成10~1000 gµ/mL的标准溶液。 3. 样品处理 :称取 g切碎均匀的样品, 加入 g氯化钠, 15 mL 2％偏磷酸溶液, 均质。装入 50 mL离心管, 加入 10 mL正己烷, 振荡 2 min后, 3000r／min离心5 min, 弃去上层己烷。下层加入3 ⅹ 10 mL乙酸乙酯, 振摇, 离心, 合并乙酸乙酯层, 浓缩近干, 用10 mL异丙醇溶解残渣, 加入 20 mL l mol/L盐酸, 70 ℃水浴中反应25 min, 立即冷却, 移入分液漏斗中, 用3 ⅹ 15 mL 苯振荡抽提, 浓缩抽提液至约 2 mL, 上弗罗里硅土层析柱, 用30 mL乙酸乙酯-苯（5：95）混合液洗脱。洗脱液浓缩至干, 残渣用内标物七氯的苯溶液（约10 ng／mL）溶解,定容至 mL,供气相色谱分析。 4. GC条件 63检测器：Ni电子捕获检测器, 色谱柱：玻璃柱15 m ⅹ 3 mm, 内填充EGSS-X Chromosorb W， 温度：柱温190 ℃, 进样口温度,190 ℃,检测器为220 ℃。 第五节 食品中霉菌毒素及其检测 一、 霉菌毒素的种类 霉菌是一些丝状真菌的通称, 在自然界分布很广, 几乎无处不有, 主要生长在不通风、阴暗、潮湿和温度较高的环境中。霉菌可非常容易地生长在各种食品上并产生危害性很强的霉菌毒素。目前已知的霉菌素素约有200余种，与食品关系较为密切的霉菌毒素有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉素、岛青霉素、黄天精、桔青霉素、展青霉素、单端孢霉素类、玉米赤霉烯酮、丁烯酸内醋等。已知有五种毒素可引起动物致癌，它们是黄曲霉毒素(B、1G、M)、黄天精、环氯素、杂色曲霉素和展青霉素。 11霉菌污染食品可使食品的食用价值降低，甚至完全不能食用，造成巨大的经济损失。据统计全世界每年平均有2%的谷物由于霉变不能食用。霉菌毒素引起的中毒大多通过被霉菌污染的粮食，油料作物以及发酵食品等引起。霉菌毒素多数有较强的耐热性, 一般的烹调加热方法不能使其破坏。当人体摄入的霉菌毒素量达到一定程度后, 可引起中毒。霉菌中毒往往表现为明显的地方性和季节性，临床表现较为复杂，有急性中毒、慢性中毒以及致癌、致畸和致突变等。食品中常见的几类霉菌毒素如下。 19
1. 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素(aflatoxin, 简写为AFT)是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物。目前已发现的20多种AFT均为二呋喃香豆素的衍生物。根据其在波长365urn紫外光下呈现不同颜色的荧光, 可分成 B (蓝紫色荧光)和 G (黄绿色荧光) 两大组；又根据其Rf值不同, 分为 B, 1B, G, G, M, M等。人及动物摄入黄曲霉毒素B和B后, 在乳汁和尿中可检出其代谢产2121212物黄曲霉毒素M和M。 12黄曲霉毒素在水中的溶解度很低, 易溶解在油和一些有机溶剂中, 如氯仿、甲醇、乙醇等, 但不溶于乙醚、石油醚、已烷。黄曲霉毒素耐热, 100 ℃, 20 h也不能将其全部破坏,在普通烹调加工的温度下破坏很少, 在280 ℃时发生裂解。其结构式都有一内酯环, 内酯环被打开则荧光消失, 毒性消除。在水溶液中, 毒素的内酯环很容易与氧化剂起反应, 特别是与碱性试剂反应, 可部分水解为酚式化合物。 在各种黄曲霉毒素中以黄曲霉毒素B的毒性最强, 污染最广泛。黄曲霉毒素B可诱发11人类肝癌, 对肝癌高发区人们的膳食进行调查发现, 膳食中黄曲霉毒素的污染水平与人类原发性肝癌的发病率呈很强的正相关。因此, 在食品卫生监测中, 主要以黄曲霉毒素B为污染1指标。 世界各国的农产品普遍遭受过黄曲霉毒素的污染, 黄曲霉毒素在食品中的污染大大地超过其他几种霉菌毒素的总和。主要污染的品种是粮油及其制品, 如花生、花生油、玉米、大米及棉籽等。 2. 赭曲霉毒素 赭曲霉毒素是分子结构类似的一组化合物,包括赭曲霉毒素A、B、C、D和α, 是由曲霉属和青霉属的某些菌种的次生代谢产物, 是谷物、大豆、咖啡豆和可可豆的常见污染物, 其中赭曲霉毒素A是该类毒素的代表化合物。赭曲霉毒素A微溶于水, 易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液, 耐热, 稳定性强, 在紫外光下呈绿色荧光。赭曲霉毒素A的毒性较强, 接近黄曲霉毒素B, 主要损伤肾脏。在巴尔干地方性肾病流行地区, 6%～18％人群的血液中能1检出赭曲霉毒素A。1993年国家癌症研究机构认为赭曲霉毒素A同时也是一种具有免疫抑制、神经毒性以及致癌、致畸形的物质。 3. 展青霉毒素 展青霉毒素是多种真菌的有毒代谢产物, 其分子式为CHO, 该物质一方面是一种广883谱的抗生素, 另一方面对小鼠、兔子等试验动物具有较强的毒性。其污染食品和饲料后产生的毒性远大于其抗菌作用。 容易污染食品和饲料并产生展青霉素的真菌主要有桪麻青霉、扩展青霉、棒曲霉、巨大曲霉、雪白丝衣霉等。展青霉素还能够对苹果及其制品造成严重污染, 1989～1990年, 中国预防医学科学院等单位对我国水果制品展青霉素的污染情况进行调查的结果显示：水果制品的原汁、原酱等半成品展青霉素的检出率达％, 含量为18-953 gµ/kg, 水果制品的成品展青霉素的检出率达%,含量为4-262 µg/kg。 高剂量的展青霉素对大鼠的肾及胃肠系统有毒性作用, 也有致癌、致畸形的作用。目前, 已有十几个国家制定了水果及其制品中展青霉素的限量标准。我国GB 14974-1994中规定,苹果和山楂半成品中展青霉素的最高限量标准为 100 gµ/kg, 果汁、果酱、果脯、果酒和糖果类中展青霉素的最高限量标准为 50 gµ/kg, 尚未制定国家标准检测方法。 4. 单端孢霉烯族化合物 单端孢霉烯族化合物是一组由镰刀菌的某些菌种（主要有三线镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、梨孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌）产生的有毒代谢产物。镰刀菌属的菌种广泛分布于自然界, 主要侵害的谷物有玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。到目前为止, 已分离鉴定出148种单端孢霉烯族化合物, 其中污染谷物和饲料的主要有脱氧雪腐镰刀菌烯醇 20
(DON)、雪腐镰刀菌烯醇、二醋酸薰草镰刀菌烯醇、T-2 毒素等。该类化合物为无色结晶, 难溶于水, 溶于有机溶剂, 非常稳定, 在烹饪加工过程中很少被破坏, 紫外光下无荧光。 该组化合物的主要毒性表现在细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌作用。关于单端孢霉烯族化合物造成的食物中毒在国内外已有多起报道, 主要症状是恶心、呕吐、头痛、腹痛、腹泻等。 5. 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮也称F-2毒素。镰刀菌属的多个菌种如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、粉红镰刀菌、半裸镰刀菌、木贼镰刀菌、黄色镰刀菌、茄病镰刀菌、串珠镰刀菌等都可以产生该毒素。这些菌广泛存在于土壤、空气及污染的谷物中，主要污染玉米, 也污染大麦、小麦、燕麦等。玉米的阳性检出率可达45％, 最高含毒量可达2909 mg/kg，小麦的阳性检出率可达20％, 含毒量为～ mg/kg。 玉米赤霉烯酮对动物的急性毒性很小。该化合物具有雌激素样的作用,主要作用于生殖系统, 可引起阴道和乳腺肿胀、流产、畸胎、死胎等。对玉米赤霉烯酮的最高限量很多国家已制定了标准, 如巴西规定玉米中不超过200 µg/kg, 罗马尼亚规定所有食品中不超过30 µg/kg, 我国尚未制定限量。 6. 杂色曲霉素 杂色曲霉素主要是由杂色曲霉、构巢曲霉、皱褶曲霉、黄褐曲霉、四脊曲霉等产生, 主要污染玉米、花生、大米、小麦等谷物。杂色曲霉素与黄曲霉素B相似, 也具有二呋喃杂1氧蒽酮结构, 研究证实杂色曲霉素可以转换为黄曲霉素B。杂色曲霉素的分子式为CHO, 118126淡黄色结晶, 熔点246 ℃, 不溶于水、氢氧化钠或碳酸钠水溶液, 易溶于氯仿、乙氰、苯等有机溶剂。紫外灯下有暗砖红色荧光。 杂色曲霉素是一种毒性很强的肝及肾脏毒素。肝癌高发区居民所食用的食物中杂色曲霉素的污染也较为严重。食品中杂色曲霉素的测定参见GB/T -1996, 该标准采用的是薄层色谱法,喷三氯化铝显色,加热后,紫外光下观察。 7. 棒曲霉素 棒曲霉素主要是由棒曲霉、土曲霉、扩展青霉和寻麻曲霉等霉菌产生的内酯代谢物, 可污染谷物、豆类及水果等, 是食品和饲料的有毒污染物。对许多生物系统都有毒害作用, 小白鼠口服LD为 mg/kg, 也有致畸、致癌作用。我国尚未制定限量或国家级标准测定方50 法。 8. 岛青霉毒素 岛青霉毒素是由岛青霉产生的代谢产物，岛青霉为青霉属。岛青霉类毒素包括黄天精、环氯素、岛青霉毒素、红天精等。并已证实黄天精和环氯素有致癌作用。国外报道的“黄变米”主要含有青霉属，最常分离的霉菌有黄绿青霉、岛青霉、和桔青霉等。“黄变米”是由于稻谷收割后，贮存中含水份过高，被霉菌污染后发生霉变所致，因为霉变呈黄色，故称：黄变米”。 9. 其它霉菌毒素 串珠镰刀菌毒素, 伏马菌素（主要是FB）该两种毒素都可由串珠镰刀菌产生, 二者皆1为水溶性化合物, 都有强烈的毒性；前者主要危害心肌, 后者对不同试验动物表现不同的毒性作用, 对马表现为神经毒性, 对羊表现为肝肾病变, 对猪表现为肺水肿症候等。 3-硝基丙酸是霉变甘蔗中节菱孢霉产生的主要毒性物质, 是储运过程中的甘蔗霉变中毒的优势毒素。变质甘蔗中毒在我国北方地区常有发生, 症状为呕吐、眼球偏侧凝视、阵发性抽搐, 重患者可在1～3天内死亡。 二、 霉菌毒素的检测 由于造成食品污染的霉菌种类很多，不同的霉菌又可产生多种毒素，而且尚有一些毒素 21
是未被认识的，因此，要对各种霉菌毒素都建立检测方法是不切实际的。在此仅就已建立国家标准检测方法的三类霉菌毒素的限量及检测做一下简介。 1. 黄曲霉毒素的检测 我国涉及黄曲霉毒素的限量及检测的国家标准有GB 2761-1981（食品中黄曲霉毒素B1允许量标准）, GB 9676-1988 （牛乳及其制品中黄曲霉毒素M1限量卫生标准）, GB/T 17480-1998（酶联免疫吸附法测定饲料中黄曲霉毒素B）, GB/T -1996 （薄层色谱1法（第一法）/ ELISA（第二法）测定食品中黄曲霉毒素B）, GB/T -1996 （薄层色1谱法（第一法）/微柱筛选法（第二法）测定食品中黄曲霉毒素B、B、G、G）及GB/T -1996（薄层色谱法测定食品中黄曲霉毒素M与B）。 112. 赭曲霉毒素A的检测 关于赭曲霉毒素A的限量标准, 1995年FAO和WHO联合专家委员会推荐赭曲霉毒素A的周摄入量不得超过100 ng/kg体重。目前, 部分国家已制定了食品及饲料中赭曲霉毒素A的限量标准, 我国尚未制定。赭曲霉毒素A的测定参考我国国家标准GB/T 13111-1991 谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定方法。 3. 单端孢霉烯族化合物的检测 我国国家标准GB 16329-1996规定小麦、玉米及其面粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准为≤1000 gµ/kg。谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法参见GB/T -1994 ;T-2毒素的测定方法参考GB/T 14933-1994（小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法)。 第六节 食品中天然有害物质及其检测 第六节 食品中天然有害物质及其检测 人类至今已经发现的食物种类是很丰富的，这是人类在不断地探索自然的过程中而积累的成果。其中包括了绝大多数的不含任何天然有害物质的食物，也包括少数的含有天然有害物质的食物。随着科学技术的发展，人们发现一些原来被认为是安全的食物事实上也含有某种或某些天然有害物质。本节主要介绍一些常见的动物性及植物性天然有害物质及部分有害物质的检测原理，对于具体的检测方法则不作介绍。 一、 常见的动物性天然有害物质 1. 动物肝脏中的毒素 动物肝中主要的毒素是胆酸、牛磺胆酸和脱氧胆酸。它们是中枢神经系统的抑制剂, 其中牛磺胆酸的毒性最强, 脱氧胆酸次之。许多试验研究还发现, 脱氧胆酸对结肠癌、直肠癌的发生有促进作用。猪肝脏中的胆酸含量较少, 一般不会产生明显的毒性作用, 但食用过多或食用时处理不当也会给人体健康产生一定的危害。 动物的肝脏中维生素A的含量都较高, 尤其在鱼类肝脏中含量最多。一般偶尔进食普通动物的肝脏是有益而无害的, 只有当摄入量超过 200万 IU以上时（约相当于30 g比目鱼肝, 200 g 鳖鱼肝, 10 kg牛肝）, 才可引起急性中毒, 表现为前额和眼睛疼痛、眩晕、呕吐及皮肤发红、出现红斑、脱皮等症状。很多研究结果显示, 人每天摄入100 mg（约3000IU）/kg体重维生素A可引起慢性中毒。另一方面, 动物肝脏中可能存在着机体本身代谢产生的毒素和病原体带来的有毒物质, 也对动物肝类食品的安全性构成了潜在的威胁。 2. 河豚毒素 河豚鱼是一种味道鲜美又含剧毒的鱼类。全球有200种左右, 我国有70多种, 广泛分布于各海区。河豚鱼的肝、脾、胃、卵巢、卵子、睾丸、皮肤以及血液均含有毒素, 其中以卵和卵巢的毒性最大, 肝脏次之, 一般品种的河豚鱼肌肉的毒性较低, 但双斑圆鲸鲀、虫纹圆 22
鲀、铅点圆鲀肌肉的毒性较强。毒素含量的大小随着生长水域、品种及季节的不同而不同。河豚鱼中毒是世界上最严重的动物性食物中毒。河豚毒素是一种神经毒素, 剧毒, 河豚毒素的毒性比氰化钠高1000倍。 据统计日本每年由于食用河豚鱼导致中毒的人数多达50人。我国沿海居民也有食用河豚鱼的习惯, 因此每年发生河豚鱼的中毒事件较多, 北方则少见。 我国《水产品卫生管理办法》中严禁餐馆将河豚鱼作为菜肴经营, 也不得流入市场销售, 因此我国没有相关的限量标准, 也尚未制定国家级标准测定方法。目前，实验室检验河豚毒素的方法有生物试验法和化学试验法两种。生物试验法的大致内容是先用1%乙酸酸化的甲醇溶液回流提取，浓缩成膏状，然后用乙醚脱脂，再用少量水溶解，所得溶液用于小白鼠腹腔注射，通过观察小白鼠的中毒症状或出现中毒症状的时间间隔进行定性或定量检测。化学试验法取生物试验法所得的膏状浓缩物溶于浓硫酸中，加入少量重铬酸钾，若呈绿色，则说明有样品中有河豚毒素存在。 3. 岩蛤毒素 蛤的两壳相等, 质地坚厚。蛤的种类很多, 只有少数几种如文蛤、石房蛤等含有有毒物质。目前认为, 这些有毒物质源于一些属于膝勾藻科的藻类, 如涡鞭毛藻, 当此种藻类大量繁殖时, 可形成“赤潮”。海洋软体动物, 包括蛤类, 摄食了这类海藻后, 海藻所含的岩蛤毒素及膝勾藻毒素在中肠腺以无毒的结合态大量蓄积, 当人体摄食此类蛤肉后, 毒素被释放出来, 引起中毒。岩蛤毒素对小鼠的经口LD 为 mg/kg。 1 mg岩蛤毒素即可使人中度50中毒。 4. 螺类毒素 螺的种类很多, 绝大多数食用安全性较高, 但少数种类如接缝香螺、间肋香螺、油螺、节棘骨螺及蛎敌荔枝螺等含有四甲胺, 骨螺毒素, 千里酰胆碱、丙烯酰胆碱等有毒物质。 5. 组胺 组胺分子式为CHN, 属于生物碱, 溶于水及乙醇。组胺中毒, 国内外均有报道, 大多593是由于食用不新鲜或腐败变质的鱼类引起的。一般认为，成人摄入100 mg的组胺就有可能引起中毒。组胺是由鱼体内的游离组氨酸在鱼的存放过程中经脱羧而形成的, 比如金枪鱼及沙丁鱼在7 ℃储藏96 h 可产生组胺大约~ mg/g, 温度升高时则组胺形成的更多。鱼体中的组胺被水或极性有机溶剂提取后，在弱碱条件下，能与偶氮试剂反应生成橙色物质，利用这一点，可以对组胺进行定性或定量检测。 二、常见的植物性天然毒素 1. 氰苷：氰苷进入体内水解后产生HCN, 从而具有较强的毒性。含有氰苷的食源性植物有木薯、豆类以及一些果树的种子如杏仁、桃仁、枇杷仁及亚麻仁等。氰化物在酸性条件下可产生HCN气体，HCN可使苦味酸试纸显红色，据此可对含有氰苷的物质进行定性检测。 2. 红细胞凝集素：是一类对红细胞具有凝集作用的蛋白质, 多为糖蛋白。含有红细胞凝集素的食源性植物有蓖麻、豆类及花生的种子中。不同植源性的红细胞凝集素其毒性是不同的, 以蓖麻凝集素的毒性最强, 其对小鼠的LD 为 mg/kg。 红细胞凝集素比较耐热, 80 50℃数小时不能使之失活, 100 ℃, 需经过1 h 可完全破坏其活性。 3. 皂甙：也称皂素, 很多豆科植物如黄豆、菜豆、蚕豆等不仅含有红细胞凝集素、氰苷, 还含有有毒的皂甙。其中菜豆中毒是天然食物中毒中较常见的。菜豆中的毒皂甙对消化道粘膜有强烈的刺激作用。 4. 龙葵碱：又名茄碱、马铃薯毒素、龙葵毒素, 不溶于水, 能溶于乙醇, 与稀酸共热可发生分解。龙葵碱广泛存在于马铃薯、番茄及茄子的茄科植物中。马铃薯中龙葵碱的含量一般在％～ ％, 且随着储存时间的增加而渐增, 发芽的马铃薯其幼芽及芽眼部分的含量可高达%～%。人摄入 g～ g龙葵碱即可引起中毒。 23
5. 秋水仙碱：是鲜黄花菜（也称金针菜）中的一种生物碱, 其本身无毒, 但当它进入人体后会转化成一种剧毒物质, 二秋水仙碱, 后者对胃肠道、泌尿系统、神经系统等具有毒性。成人一次摄入 mg～ mg秋水仙碱可引起中毒, 摄入3 mg～20 mg可致死。食用鲜黄花菜时一定要用开水焯, 浸泡后, 再经充分烹饪, 以防中毒。食用干黄花菜较安全。 6. 棉酚：系萘的衍生物, 分子式为CHO, 在结构上有醛、稀醇及醌式三种同分异构30308体。溶于中等极性的有机溶剂, 不溶于水及已烷等。棉酚对心、肝、肾及神经系统、生殖系统均有毒性。棉酚在棉子中的含量为％～%, 冷榨棉子油中可高达1％～％, 因此不可食用冷榨棉子油或毛棉子油。 7. 毒蘑菇：毒蘑菇所含有的有毒成分可分为生物碱类、肽类及其它化合物, 根据中毒的症状可分为胃肠毒素、神经精神毒素、血液毒素、原浆毒素和其它毒素五类。 第七节 食品中源于包装材料的有害物质及其检测 一、主要的食品包装材料及其有害物的种类 食品包装的主要目的是保护食品质量和卫生, 不损失原始成分和营养, 方便贮运, 促进 销售, 提高货架期和商品价值。现代包装技术无疑可大大延长食品的保存期, 延长食品的新鲜度, 提高食品的美观性和商品价值。但是, 由于包装材料直接和食物接触, 很多材料成分可迁移到食品中, 造成食品污染。表14-8 列出几种主要包装材料中可能存在的并可能迁移到食品种的有害成分。 二、 食品包装材料中有害物质检测 我国国家标准GBT 17409 中规定了食品包装材料及其制品的浸泡试验方法通则, 详述了各种包装材料及其制品理化检验时, 样品预处理方法。有关包装材料及其制品的卫生检验方法我国已制定了一系列的标准, 详见GB/T ~72-1996、 GB/T 13120-1996、GB/T 15205-1996 及GB/T 17338-1998等。 第八节 食品加工过程中形成的有害物质及其检测 一、食品加工过程中形成的有害物质 烟熏、油炸、焙烤、腌制等加工技术, 在改善食品的外观和质地, 增加风味, 延长保存期, 钝化有毒物质（如酶抑制剂、红细胞凝集素）以及提高食品的可利用度等方面发挥了很大作用, 但随之还产生了一些有害物质, 相应的食品存在着严重的安全性问题, 对人体健康可产生很大的危害。例如, 在习惯吃熏鱼的冰岛、芬兰和挪威等国家, 胃癌的发病率非常高。我国胃癌和食管癌高发区的居民也有喜食烟熏肉和腌制蔬菜的习惯。在这几类食品加工过程 表14-8 主要的食品包装材料及其有害物的种类 包装材料类别 包装材质 可能污染物 备注 聚乙烯（PE） 单体乙烯, 低聚乙不宜盛装油脂； 烯, 增塑剂、稳定其再生品不可作食品包装材料 剂 聚丙烯（PP） 增塑剂、稳定剂 可包装各种食品, 其再生品不可作食品包装材料热塑性塑料 聚苯乙烯（PS） 常残留有苯乙烯、FDA规定用于食品包装的该材乙苯、甲苯、异丙料苯乙烯含量小于1％ 苯等挥发性物质 聚氯乙烯（PVC） 单体氯乙烯、增塑氯乙烯有麻醉、致癌、致畸作剂、稳定剂 用 24
三聚氰胺（蜜胺） 甲醛 我国暂定此两材料中甲醛含 脲醛树脂（电玉） 甲醛 量不得超过30 mg/L水浸泡液热固性塑料 酚醛树脂 甲醛、苯酚 不宜与包装食品直接接触； 正在被其它材料取代 丙烯腈共聚塑料 聚丙烯腈-丁乙烯 丙烯腈 CAC提出食品中丙烯腈应小于聚丙烯腈-苯乙烯 丙烯腈 mg/kg 橡胶 天然橡胶/合成橡胶单体/促进剂、抗老促进剂：金属氧化物, 乌洛托 化剂、填充剂 品, 抗老化剂：酚及芳香胺类 填充剂：炭黑 （含苯并芘） 纸类 普通纸/托蜡纸/玻造纸原料中的农荧光增白剂及石蜡中的多氯联璃纸 残, 回收纸中的油苯是致癌剂 墨, 荧光增白剂/石蜡/CS2 无机包装材料 铁、铝、不锈钢/ 铅、铬、镍、铝、检测方法等请参考本书第13玻璃/搪瓷、陶瓷 锡/铅、钠、钴、铜章 /瓷釉或陶釉中含有的铅、铬、锑等中形成的有害物质主要可分为三类：N-亚硝基化合物、多环芳烃和杂环胺。本节主要简介N-亚硝基化合物和多环芳烃中的苯并[α]芘。 1. N-亚硝基化合物 N-亚硝基化合物(NOC)是一大类有机化合物, 根据其化学结构, 可分为两类：一类为亚硝胺, 另一类为N-亚硝酰胺。低分子量的亚硝胺在常温下为黄色油状液体, 高分子质量的为固体。二甲基亚硝胺可溶于水及有机溶剂, 其他亚硝胺只能溶于有机溶剂。亚硝胺在通常条件下, 不易水解、氧化, 化学性质稳定。N-亚硝酰胺的化学性质较活泼, 在酸性条件下可分解为相应的酰胺和亚硝酸, 或经重氮甲酸酯重排, 放出氮和羟酸酯；在碱性条件下可快速分解为重氮烷。亚硝胺和N亚硝酰胺在紫外光照射下都可发生光分解反应。 通过对300多种N-亚硝基化合物的研究, 已经证明约90％具有强致癌性, 其中N-亚硝酰胺是终末致癌物, 亚硝胺需要在体内活化后才能成为致癌物。 含有N-亚硝基化合物较多的食品有干鱿鱼（300 gµ/kg）、熏肉（~ µg/kg）、熏鱼（4~9 gµ/kg）、咸鱼（12~24 µg/kg）、咸肉（~ gµ/kg）、油煎火腿（10~20 µg/kg）、干香肠（19 µg/kg）、腌制蔬菜（亚硝酸盐含量可达78 mg/kg, 而鲜蔬菜中亚硝酸盐的含量在1 mg/kg以下）等。另外, 在啤酒及干奶酪、奶粉、奶酒等全乳制品中也含有微量的N-亚硝基化合物, 一般在~ µg/kg。 2. 苯并[α]芘 苯并[α]芘, 又称3,4-苯并芘, 是一种由5个苯环构成的多环芳烃。常温下苯并[α]芘为浅黄色针状结晶, 性质稳定, 熔点179～180 ℃, 在水中溶解度为～ mg/L, 微溶于乙醇、甲醇, 易溶于环己烷、己烷、苯、甲苯、二甲苯、丙酮等有机溶剂。在有机溶剂中, 用波长365 nrn紫外线照射时, 可产生典型的紫色荧光。苯并[α]芘在碱性条件下较稳定。在常温下不与浓硫酸作用, 但能溶于浓硫酸；能与硝酸、过氯酸、氯磺酸起化学反应, 人们可利用这一性质来消除苯并[α]芘。 苯并[α]芘是已发现的200多种多环芳烃中最主要的环境和食品污染物, 是一种强烈的致癌物质, 对机体各器官, 如对皮肤、肺、肝、食道、胃肠等均有致癌作用。 加工过程中苯并[α]芘对食品的污染主要是针对熏制、烘烤和煎炸等食品而言的, 该类食品中的苯并[α]芘一方面来源于煤、煤气等不完全燃烧, 另一方面来源于食品中的脂肪、 25
胆固醇等成分的高温热解或热聚。据研究报道, 在烤制过程中动物食品所滴下的油滴中苯并[α]芘含量是动物食品本身的10～70倍。当食品经烟熏或烘烤而发生焦烤或炭化时, 苯并[α]芘生成量随着温度的上升而急剧增加。当淀粉在加热至 390 ℃时可产生 gµ/kg的苯并[α]芘, 加热至 650 ℃时可产生 17 gµ/kg；葡萄糖、脂肪酸加热至650 ℃可分别产生 7 mg／kg和 88 mg／kg的苯并[α]芘。 另外, 由于输送原料或产品的橡胶管道、包装糖果、棒冰、面包等用的蜡纸、食品加工机械用的润滑油等都可能含有苯并[α]芘, 这样, 就可能使得某些食品在加工环节中被污染。 在此顺便指出, 人们生活常用的煤、石油、天然气、木材等, 当不完全燃烧时都会产生苯并[α]芘；沥青中苯并[α]芘含量为％～％, 烧沥青和喷洒沥青时会有大量苯并[α]芘散发在空气中, 这些都可能对环境造成污染,进而污染原料食品。 二、该类有害物质的检测 1. 食品中N-亚硝基化合物的测定 我国国家标准GB/T 9677-1998 规定了N-二甲基亚硝胺及N-二乙基亚硝胺在海产品 (分别为≤ 4 及 ≤7 gµ/kg) 及肉制品 (分别为≤ 3 及 ≤5 gµ/kg)中的限量标准。另外, 国家标准GB/T -1996规定了食品中N-亚硝胺类的检测方法。该标准中的第一法,气相色谱-热能分析仪法, 适用于啤酒中N-二甲基亚硝胺的检测。该法的原理是先将样品中N-二甲基亚硝胺经硅藻土吸附或真空低温蒸馏,然后用二氯甲烷提取分离后,采气相色谱-热能分析仪法测定。 第二法,GC-MS法,适用于酒类、肉类、蔬菜、茶叶及豆制品等食品中N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺、N-二丙基亚硝胺及N-亚硝基吡咯烷含量的检测。详见国家标准GB/T -1996。 2. 食品中苯并[α]芘的测定 请参考GB/T -1996。 该法先将样品用有机溶剂提取或皂化后提取,再将提取液经液-液分配或层析柱净化,然后经乙酰化滤纸层析分离后,在365 nm 或254 nm 的紫外光下圈出相应蓝紫色斑点,用溶剂溶出后,用荧光分光光度法比色测定。 第九节 食品中其他有害物质及其检测 一、 食品中二恶英及其检测 （一） 二恶英的特性与种类 二恶英的全名为多氯代二恶英, 英文名称为Dioxins或 Polychlorodibenzodioxins, 简称 PCDDs, 是一类三环芳香族化合物。与多氯代二恶英共存的常常有多氯代苯并呋喃, 简称PCDFs, 其母核的结构式如图14-11。按苯上氯原子的数目和位置不同, 多氯代二恶英共有75种同系物和异构体, 多氯代苯并呋喃共有135种同系物和异构体, 详见表14-9。 O9191O82823737O4646ClyClxylCClxClyxlC PCDDs PCDFs PCBs 图14-11 二恶英及多氯联苯的母核结构 26
表14-9二恶英的同系物及异构体 PCDDs 分子量 异构体数目 PCDFs 分子量 异构体数目 MCDD 2 MCDF 4 DCDD 10 DCDF 16 TriCDD 14 TriCDF 28 TetraCDD 22 TetraCDF 38 PentaCDD 14 PentaCDF 28 HexaCDD 10 HexaCDF 16 HeptaCDD 2 HeptaCDF 4 OCDD 1 OCDF 1 合计 75 135 二恶英属于脂溶性化合物, 难于生物降解, 且随着两个环上的卤素含量增加, 其在环境中的稳定性、亲脂性、热稳定性以及对酸、碱、氧化剂和还原剂的抵抗能力增加。二恶英的毒性很强。PCDF与 PCDDS的毒性相近, 其中, 毒性最强的是17种在2, 3, 7, 8位有氯代的S化合物, 而其中又以2,3,7,8-TeCDD的毒性最强,它是目前已知的最毒的化合物。有的动物对2,3,7,8-TeCDD的半致死量仅为 2 gµ／kg。二恶英还具有强烈的致肝癌毒性。TCDD只要有10～100 µg／kg量试验动物就会诱发肝癌变。TCDD对哺乳动物的急性毒性主要表现在, 肝器官受损。二恶英对人类不致命的慢性症状包括痤疮、脱发、尿血、神经麻木和体重减轻, 有时会出现极度衰弱。 已有不少国家对食品中二恶英作了最高残留量限量规定, 对于奶制品：比利时为5 ng／kg、荷兰为6 ng／kg、德国为5 ng／kg；美国FDA规定日摄入量不超过0．01 ng/kg体重,1998 WHO根据最新毒性资料，规定日摄入量不超过1～4 pg/kg体重。我国尚未制定相关的限量标准。 （二） 二恶英的主要来源 1. 含氯化合物的生产和使用。这些含氯化合物主要包括：作为农药或防腐剂的氯酚类、作为除草剂的氯代苯氧酸型除草剂、被广泛用于电器设备的多氯联苯（PCBs, ）类、造纸行业的纸浆加氯漂白等, 2. 垃圾的焚烧。垃圾的不充分燃烧, 可产生大量的有害化合物。如含有聚氯乙烯塑料的垃圾在焚烧过程中可能产生酚类化合物和强反应性的氯和氯化氢等, 这些物质是合成二恶英的前体物。医院废弃物中含有卤代化合物, 焚烧时释放的二恶英含量高于生活垃圾, 废水处理后的污泥经脱水后进行焚烧处理, 也可释放二恶英, 其含量较生活垃圾稍低。据估计, 每50万人在生活当中产生的垃圾经焚烧处理, 每天可产生350 mg～1600 mg 二恶英。 3. 煤、石油、汽油、沥青等的燃烧。汽油的不完全燃烧, 致使汽车排出的尾气中也含有33二恶英, 其中2,3,7,8-TCDD约为～ pg／m, 2,3,7,8-TCDF约为～ pg／m。 4. 含除草剂的枯草残叶的燃烧及森林大火也会产生二恶英。 (三) 二恶英的检测 环境中的二恶英主要是通过食物链和生物富集作用进入食品。 二恶英难溶于水而溶于有机溶剂和脂肪, 所以在食品的脂肪中二恶英的浓度较高。二恶英含量最常用的分析方法是高分辨率气相色谱一质谱法, 对氯取代基小于 7个的 PCDDs和 PCDFs的测定, 选用极性毛细管色谱柱；对氯取代基等于或大于7个的PCDDs和 PCDFs, 应选用极性小或非极性的毛细管色谱柱；质谱仪分辨率至少要在10000以上。采用非分流进样及选择离子检测方式, 用 27
内标法定量。由于二恶英种类繁多、标准品不全、含量少而且常常会受到多氯联苯（PCBs, 结构如图14-11）或多氯二苯醚的干扰等, 因此, 现在的分析方法还不能完全将其所有的异构体进行分离检测。二恶英残留量的分析需要随着分析手段的提高而不断改进。在此仅介绍二恶英检测的一般性方法。 1. 二恶英的提取方法 对不同种类食品中二恶英的提取,目前主要有下述三种方法。 A. 碱分解法 对于蛋白质或脂肪含量高的样品, 可称取 50～100 g, 加 l mol/L KOH的乙醇溶液300 mL, 在室温下振荡 2 h, 再加入 1：1正己烷饱和水-正己烷 300 mL提取10 min, 分离水相后, 于水相中再加入150 mL正己烷提取, 有机层用硫酸钠脱水。 B. 丙酮-正己烷提取法 蔬菜类样品, 捣碎后取100 g, 加入2 ⅹ 200 mL 1：1丙酮-正己烷振荡提取l h, 过滤,合并正己烷层, 加入1体积正乙烷饱和水, 振荡10 min, 弃去水层, 正己烷层用无水硫酸钠脱水。 C. 草酸钠-乙醇-乙醚-正己烷提取法 对于牛奶样品, 取牛奶100 mL, 加入饱和草酸钠溶液50 mL、乙醇100 mL、乙醚100 mL, 搅拌均匀后, 加入正己烷200 mL, 振荡10 min, 下层再用200 mL正己烷提取两次, 合并正己烷层, 加入2％ NaCl 200 mL振摇, 弃去水相。正己烷相用无水硫酸钠脱水。 2. 常用的净化方法 A. 浓硫酸与多层硅胶柱处理法, 在提取样液中加入浓硫酸, 分解提取液中共存的有机成分及有色物质, 然后将有机相用多层硅胶柱净化。层析柱从下至上分别装填 g硅胶, 3 g 2％ KOH／硅胶, g硅胶, g 44％硫酸／硅胶, 6 g 22％硫酸／硅胶, g硅胶, 3 g 10％硝酸银／硅胶, 最上层为 6 g无水硫酸钠。本法净化效果较好, 但费时、繁琐。 B. 硅胶柱层析处理法, 用130 g活化硅胶填充柱吸附试样, 用正己烷或苯洗脱二恶英类化合物。 C. 其它净化方法, 氧化铝柱层析法、聚酰胺色谱分离方法或透析法等。 3. 分析方法 GC-MS分析法。 二、 食品中氯丙醇及其检测 （一）氯丙醇的种类及性质 丙三醇和盐酸反应可产生四种氯丙醇产物, 即, 3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）和2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP)。其中主要的产 物是3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）。氯丙醇微溶于水, 易溶于有机溶剂。不同的氯丙醇其毒性不一样, 3-MCPD会影响肾脏及生育, 还可引发癌症；1,3-DCP会引起肝、肾脏、甲状腺等的癌变；2,3-DCP对肾脏、肝脏和精子也有一定的毒性。 （二）氯丙醇的来源 食品中的氯丙醇主要来源于酸水解动植物蛋白, 在酸水解蛋白的同时, 原料的脂肪或油脂中存在的三酰甘油也被水解成丙三醇, 并进一步与盐酸反应生成氯丙醇。 在国外, 水解植物蛋白作为风味剂在食品中大量使用, 包括许多加工和预加工食品、汤、肉汁混合物、风味快餐和固体汤料中, 其典型的添加水平大致在％～％之间；在我国, 允许用水解植物蛋白来生产配制酱油，因此，有可能导致一些酱油制品中氯丙醇含量过多。 我国《食品卫生法》中对食品生产使用的原料和辅料提出了明确的规定, 指出非食品用原料不准用于食品生产。因此, 使用人发、猪毛、畜蹄角等非食用原料生产所谓的“氨基酸调味液”作为配制酱油是一种违法行为。 28
另外, 氯丙醇的其他来源还包括：袋泡茶的包装袋；以含氯凝聚剂作成的净水剂；被包装工业称为“第三代”食品包装材料的聚3-氯-1,2-环丙烷树脂等。 美国、英国、瑞士及欧盟规定食品中氯丙醇的最高限量标准分别为≤1 mg/kg、 mg/kg、10 mg/kg 及1 mg/kg。我国行业标准 SB 10338-2000规定了酸水解植物蛋白调味液中氯丙醇的最高限量为1 mg/kg。 （三）酸水解植物蛋白调味液中氯丙醇的测定 (节录自中国行业标准 SB 10338-2000) 1. 氯丙醇提取与净化 用20％ NaCl溶液调节酸水解植物蛋白调味液至固形物含量为36％的溶液后, 取适量上弗罗里硅藻土柱, 用乙酸乙酯洗脱, 洗脱液在50 ℃下浓缩至近干, 用乙酸乙酯定容后, 用GC法测定,内标法定量。 2. GC条件 检测器： 电导检测器（以卤素方式进行工作） 毛细管柱： mm ⅹ 30 m, Supelcowax 10, 或 Carbowax柱 气体流速: 氦气, 8 mL/min, 温度: 柱温, 170 ℃保持5 min, 以 5 ℃/min 升至250 ℃保持10 min, 进样口温度, 225 ℃ 反应条件: 反应氢气, 30 mL/min, 反应溶剂, 1-丙醇,反应温度, 900 ℃, 基本温度,275 ℃ 详见SB 10338-2000。 思考题 1. 食品有害物的概念及其检测的意义? 2. 食品有害物质的种类及其来源? 3. 正相色谱及反相色谱对物质分离的原理? 4. 表面活性吸附剂的活度与含水量的关系? 5. GC及HPLC检测器的种类及其工作原理? 6. 质谱的表示方法及质谱峰的种类? 7. 造成农药及兽药污染的可能原因? 8. 主要的霉菌毒素及各自的主要污染对象? 9. 如何做到既注重食品的精美包装又减少来自包装材料的污染? 10. 如何减少水解植物蛋白中氯丙醇的含量? （王启军） 29
第十五章 食品分析中的质量保证 食品分析的结果是许多重要决策的基础。如，食品企业根据原辅材料的分析结果决定接受还是拒受；根据加工过程中各个关键控制点的在线检测结果，了解食品安全控制状态，决定是否需要采取预防或纠偏措施；根据终产品的分析结果决定某批次产品是否合格，能否放行出厂，进入食品流通渠道。又如，相关政府机构根据食品分析结果进行食品质量与安全方面的监督和管理，以保护消费者健康，维护消费者合法权益。总而言之，食品分析结果的质量直接影响生产、科研、司法等重要活动。实践证明，如果没有可靠的分析质量保证措施，就不能提供可靠的分析数据，由此造成的后果可能会比没有数据更为严重。另一方面，分析人员本身也常常面临证明其分析结果的准确性或可靠性的压力，需要用分析质量保证体系来证明其有能力提供符合质量要求的分析结果。所以，分析质量保证对食品企业、食品科学研究机构、食品质量与安全管理机构以及分析人员都具有十分重要的意义。 分析质量保证（ lacniAtyla uyQtila ,uessnAarcAQA）指分析测试过程中，为了将各种误差减少到预期要求而采取一系列培训、能力测试、控制、监督、审核、认证等措施的过程。因此，分析质量保证涉及许多影响分析结果的因素，例如，分析测试中使用仪器设备的性能、玻璃量器的准确性、试剂的质量、分析测量环境和条件、分析人员的素质和技术熟练程度、采样的代表性以及选用分析方法的灵敏度等等。由于整个分析过程比较复杂，不可能做到完美无缺，只要其中任何一个环节发生问题，就一定会影响测定结果的准确性，产生测量误差。虽然，随着现代科学技术水平以及分析人员素质的提高，可以将误差控制在比较小的范围内，但是，不论分析人员怎样努力，都不可能彻底消除分析过程中的误差。所以，分析质量保证是一个需要不断改进与完善的过程。 本章将从如何保证分析数据的质量、如何进行实验室质量控制等方面，阐述食品分析中质量保证的主要内容。 第一节 分析数据的质量 分析人员和利益相关各方都非常关心分析过程和分析结果是否有效和可信，或者说分析结果的质量如何。对分析结果（即分析数据）的可信程度提出疑问是很自然的，因为人们需要比较、评价或再现（复现）分析结果。但是，回答这些问题存在一定的难度，因为，影响测定结果的因素很多，而人们对各影响因素又缺乏全面的了解。在实际工作中，尽管分析人员选择最准确的分析方法、使用最精密的仪器设备，具备丰富的经验和熟练的技术，对同一样品进行多次重复分析，也不会获得完全相同的结果，更不可能得到绝对准确的结果。这就表明，误差是客观存在的。如何减少分析过程中的误差，减少分析数据的不确定度，是保证分析数据质量的关键措施。 一、误差 误差或测量误差是指测量值或测量结果与真实值之间的差异。根据误差的性质，误差可分为系统误差、偶然误差和过失误差三大类。 （1）系统误差 系统误差是由分析过程中某些固定原因造成的，使测定结果系统地偏高或偏低。常见的系统误差根据其性质和产生的原因，可将其分为方法误差、仪器误差、试剂误差、操作误差（或主观误差）等几种。 （2）偶然误差 偶然误差又称随机误差。它是由某些难以控制、无法避免的偶然因素造成的，其大小与正负值都不固定，又称不定误差。偶然误差的产生难以找到确定的原因，似乎没有规律性。 1
但如果进行很多次测量，就会发现其服从正态分布规律。偶然误差在分析操作中是不可避免的。 （3）过失误差 分析工作中除上述两类误差外，还有一类“过失误差”。它是由于分析人员粗心大意或未按操作规程办事所造成的误差。在分析工作中，当出现误差值很大时，应分析其原因，如是过失误差引起的，则该结果应舍去。 二、不确定度 1.定义 不确定度是测量不确定度的简称，指对分析结果的正确性或准确性的可疑程度。不确定度是用于表达分析质量优劣的一个指标，是合理地表征测量值或其误差离散程度的一个参数。 不确定度又叫可疑程度，习惯地俗称为“不可靠程度”。它定量地表述了分析结果的可疑程度，定量地说明了实验室（包括所用设备和条件）分析能力水平。因此，常作为计量认证、质量认证以及实验室认可等活动的重要依据之一。另外，由于通常真实值是未知的，分析结果是分析组分真实值的一个估计值。只有在得到不确定度值后，才能衡量分析所得数据的质量，才能指导数据在技术、商业、安全和法律方面的应用。。 2.分类 不确定度是与分析结果有关的参数，在分析结果的完整表述中，应包括不确定度。不确定度可以用标准差或其倍数，或是一定置信水平下的区间（置信区间）来表示，因此就可将不确定度分为两大类：标准不确定度和扩展不确定度。 （1） 标准不确定度 用标准偏差表示的分析结果的不确定度。根据计算方法，标准不确定度又分为三类。A类标准不确定度是用统计分析方法计算的不确定度；B类标准不确定度是用不同于A类的其他方法计算的，以估计的标准差表示；而所有标准不确定度分量的合成称为合成标准不确定度，其标准偏差也是一个估计值。 （2） 扩展不确定度 扩展不确定度又称为总不确定度。它提供了一个区间，分析值以一定的置信水平落在这个区间内。扩展不确定度一般是这个区间的半宽。 不确定度分类如下： A类标准不确定度 标准不确定度 B类标准不确定度 不确定度 合成标准不确定度 扩展不确定度 3.来源 在实际分析工作中，分析结果的不确定度来源于很多方面，典型的来源包括：对样品的定义不完整或不完善；分析的方法不理想；取样的代表性不够；对分析过程中环境影响的认识不周全，或对环境条件的控制不完善；对仪器的读数存在偏差；分析仪器计量性能（灵敏度、分辨力、稳定性等）上的局限性；标准物质的标准值不准确；引进的数据或其他参量的不确定度；与分析方法和分析程序有关的近似性和假定性；在表面上看来完全相同的条件下，分析时重复观测值的变化等。 典型的不确定度源包括： （1） 取样 分析过程中在实验室或现场取样时，取样代表性不够、不同样品间的随机变化和在取样过程中潜在的偏差可导致最终结果的不确定度。 2
（2） 存放条件 实验样品在分析前要存放一段时间，存放条件可能影响结果。存放期限和存放条件应该作为不确定度源加以考虑。 （3） 仪器效应 如分析天平校准的准确度范围，温度控制器可能保持与它的指示设定点不同的平均温度，自动分析仪可能有滞后效应等。 （4） 试剂纯度 即使已测定了试剂的纯度，试剂溶液的浓度仍不能准确知道，因为与测定过程有关的不确定度仍存在。而有些试剂在放置过程中也会发生纯度的变化。如氢氧化钠试剂和氢氧化钠溶液在放置过程中都会和空气中的二氧化碳反应生成碳酸氢钠，纯度发生了变化。 （5） 假定的化学计算 一般分析时都要假定分析过程遵循一个特殊反应的化学计算，但这一化学计算和实际的计算还是有差异的，而且还可能发生了不完全反应或副反应。 （6） 分析条件 如分析环境温度有时会影响到分析结果，要考虑到温度的不确定度，当然，显著的温度效应必须校正。同样，在样品对可能的湿度变化敏感的情况下，湿度也会引起分析结果的不确定度。 （7） 样品效应 复杂的样品中被分析成分的回收率或仪器响应可能受到样品组成的影响，被分析成分可能进一步复合这种影响。由于复杂的成分改变了热状态或光分解效应，样品和被分析成分的稳定性在分析中也会发生变化。 （8） 计算上的影响 选择的校准模式，如对曲线的响应选择直线校准，可能会导致较大的不确定度；舍项也可能会导致结果不准确。 （9） 空白校正 空白值和空白矫正的合理性均存在不确定度，这在痕量分析中特别重要。 （10） 分析人员的影响 读数可能偏高或偏低。 （11） 随机效应 所有分析中都有随机因素响产生的不确定度。 4.不确定度的评估过程 不确定度的评估在原理上很简单。下面叙述了为获取分析结果的不确定度估计值所要进行的工作。这些步骤包括： （1）规定分析对象 清楚地写明需要分析什么，包括分析对象和分析所依赖的输入量(例如所测定的参数、常数、校准标准值等)的关系。只要可能，还应该包括对已知系统影响量的修正。该技术规定资料应在有关的标准操作程序O)SP(或其他方法描述中给出。 （2） 识别不确定度的可能来源 列出不确定度的可能来源。包括第一步所规定的关系式中所含参数的不确定度来源，但是也可以有其他来源，必须包括那些由化学假设所产生的不确定度来源。 （3）不确定度分量的量化 测量或估计与所识别的每一个潜在的不确定度来源相关的不确定分量的大小。通常能评估或测量与大量独立来源有关的不确定度的单个分量。要考虑数据是否足以反映所有的不确定度来源，计划其他的实验和研究来保证所有的不确定度来源都得到充分的考虑。 3
（4）计算合成不确定度 在第三步中得到的信息是总不确定度的一些量化分量，它们可能与单个来源有关，也可能与几个不确定度来源的合成影响有关。这些分量必须以标准偏差的形式表示，并根据有关规则进行合成，以得到合成标准不确定度。应使用适当的包含因子来给出扩展不确定度。 图115-表示不确定度的评估过程。 三、误差和不确定度 误差和不确定度是两个完全不同的概念。误差是本，没有误差，就没有误差的分布，就无法估计分布的标准偏差，当然也就不会有不确定度了。而不确定分析实质上是误差分析中对误差分布的分析。然而，误差分析更具广义性，包含的内容更多，如系统误差的消除与减弱等。可见，误差和不确定度紧密相关，但也有区别，其具体区别见表15-1。 表1 5-1误差与不确定度的主要区别 序号 误差 不确定度 1 单一值 区间形式，可用于其所描述的所有分析值 2 表示分析结果相对真实值的偏离 表示分析结果的离散性 有正号或负号，其值为分析结果减去无符号的参数，用标准差或标准差的倍数3 真实值 或置信区间的半宽表示 客观存在，不以人的认识程度而改变与人们对分析对象、影响因素及分析过程4 的认识有关 由于真实值未知，往往不能准确得到，可以由人们根据实验、资料、经验等信息5 当用约定真实值代替真实值时，可以进行评定，从而可以定量估计。评定方法得到其估计值 有A和B两类 按性质可分为随机误差、系统误差和不确定度分量评定时—般不必区分其性过失误差三类。定义随机误差和系统质，若需要区分时应表述为：“由随机效应6 误差都是无穷多次分析情况下的理想引入的不确定度分量”和“由系统效应引概念 入的不确定度分量” 已知系统误差的估计值时可以对分析不能用不确定度对分析结果进行修正，在7 结果进行修正．得到已修正的分析结已修正分析结果的不确定度中应考虑修正果 不完善而引入的不确定度 四、如何提高分析结果的准确度，减少不确定度 分析结果的准确度是指分析结果与真实值之间的一致程度。在定量分析工作中，为了使分析结果和数据有意义，就要尽量提高分析结果的准确度。因此，定量分析必须对所测的数据进行归纳、取舍等一系列分析处理（见第十六章）；同时，还需根据具体分析任务对准确度的要求，合理判断和正确表述分析结果的可靠性与精密度以及分析的不确定度。为此，分析人员应该了解分析过程中产生误差的原因及误差出现的规律，并采取相应的措施减小误差，使分析结果尽量地接近客观的真实值。 从前面有关误差的讨论中可知，在分析测试过程中，不可避免地存在误差和不确定度。那么如何尽可能地减小分析误差和分析的不确定度，提高分析结果的准确度呢？下面结合实际情况简单地予以讨论。 1.选择合适的分析方法 各种分析方法的准确度和灵敏度是不同的，在实际工作中要根据具体情况和要求来选择分析方法。化学分析法中的重量分析和滴定分析相对于仪器分析而言，准确度高，但灵敏度低，适用于质量分数高的组分的测定。而仪器分析方法相对而言灵敏度高，准确度低，因此它适于质量分数低的组分的测定。例如有一试样铁的质量分数为4100.％，若用重铬酸钾法滴定铁，其方法的相对误差为±％，则铁的质量分数范围是2004.％～％。若采用分 4
开始 说明分析对象 第一步 识别不确定度来源 第二步 将现有数据的不确定度第三步 来源分组以简化评估 量化各组分量 量化其他分量 将分量转化为标准偏差 第四步 计算合成标准不确定度 复核，如必要，重新评估较大的分量 结束 计算扩展不确定度 图1 5-1不确定度的评估过程 5
光光度法测定，其方法的相对误差约为±2％，则铁的质量分数范围是％～.490％，很明显，后者的误差大得多。如果试样中铁质量分数为500.％，用重铬酸钾法滴定无法进行，也就是说方法的灵敏度达不到。而分光光度法，尽管方法相对误差为±2％，但质量分数低，其分析结果绝对误差低，为×50.％＝001.％，测得的范围为409.％～％，这样的结果是符合要求的。 2.减少测定误差 为了保证分析测试结果的准确度，必须尽量减少测量误差。例如，在分析滴定中，用1 -碳酸钠基准物标定20 .olm·LlCH标准溶液，分析步骤中先是用分析天平称取碳酸钠的质量，然后读出滴定管lCH溶液的体积。 分析天平的一次称量误差为±，采用递减法称量两次，为使称量时相对误差小于10.％，称量质量不能太小，至少应为 2× g试样质量＝绝对误差／相对误差＝＝0 .2g %滴定管的一次读数误差为± Lm，在一次滴定中，需要读二次。为使滴定时相对误差小于10.％，消耗的体积至少应为 2× mL滴定体积＝＝20 L %所以，为了减少称量和滴定的相对误差，在实际工作中，称取碳酸钠基准物质量为205.～ g范围，使滴定体积在3 0Lm左右。 应该指出，不同的分析方法准确度要求不同，应根据具体情况，来控制各测量步骤的误差，使测量的准确度与分析方法的准确度相适应。例如，用分光光度法测定微量组份，方法2的相对误差为±2％，若称取50g.试样时，试样的称量误差小于50.×±＝±（g）001就行了，没有必要像滴定分析法那样强调称准至± g。但是，为了使称量误差可以忽略不计，最好将称量的准确度提高约一个数量级，称准至±00 .01g就足够了。 此外，在比色分析中，样品浓度与吸光度之间往往只在一定范围内呈线性关系，分光光度计读数时也只有在一定吸光度范围内才准确。这就要求测定时样品浓度在这个线形范围内，并且读数时应尽可能在这一范围内，以提高准确度。可以通过增减取样量或改变稀释倍数等来达到这一目的。 3.增加平行测定次数，减少随机误差 由前面的讨论可知，在消除了系统误差的前提下，平行测定次数越多，平均值越接近真实值。因此，增加平行测定次数，可减少随机误差，但测定次数过多，工作量加大，随机误差减小不大，故一般分析测试，平行3～4次即可。 4.消除测量过程中系统误差 在分析工作中，有时平行测定结果非常接近，分析的精密度很高，但用其他可靠方法检查后，发现分析结果准确度并不高，这可能就是因为分析中产生了系统误差。因此，在分析工作中必须十分重视系统误差的消除。系统误差产生的原因是多方面的，可根据具体情况采用不同的方法来检验和消除系统误差。 一般采用对照试验来检验分析过程中有无系统误差。对照试验有以下几种类型。 (1)选择组成与试样组成相近的标准试样进行分析，将测定结果与标准值比较，用t-检验法来确定是否存在系统误差。 由于标准试样的数量和品种有限及价格因素，所以一些单位又自制了一些“管理样”，以此代替标准试样进行对照分析。管理样事先经过反复多次分析，其中各组分的含量也是比较可靠的。此外，有时也可以自行配制“人工合成试样”来进行对照分析，它是根据试样的 6
大致成分由纯化合物配制而成。配制时，要注意称量准确，混合均匀，以保证被测组分含量的准确性。 (2)采用标准方法和所选方法同时测定某一试样，用F-检验法和t-检验法来判断是否存在系统误差。这里的标准方法一般是国家颁布的标准分析方法或公认的经典分析方法。 (3)如果对试样的组成不完全清楚，则可以采用“加入回收法”进行对照试验。即取两份等量的试样，向其中一份加入已知量的被测组份，进行平行试验，看看加入的被测组份是否定量地回收，根据回收率的高低可检验分析方法的准确度，并判断分析过程是否存在系统误差。 (4)采用训练有素的分析人员的分析结果来做对照，找出其他分析人员的习惯性操作失误所产生的系统误差。 若通过以上对照试验。确认有系统误差存在，则应设法找出产生系统误差的原因，根据具体情况，采用下列方法加以消除。 (1)作空白试验消除试剂、去离子水带进杂质所造成的系统误差。即在不加试样的情况下，按照试样分析操作步骤和条件进行试验，所得结果称为空白值。从试样测试结果中扣除此空白值，就得到比较可靠的分析结果。 (2)校准仪器以消除仪器不准确所引起的系统误差。如对砝码、移液管、滴定管、容量瓶等进行校准。 (3)标定溶液。分析中所用的各种标准溶液（尤其是容易变化的试剂）应按规定定期标定，以保证标准溶液的浓度和质量。 ＋2(4)测定结果的校正。例如用eF标准溶液滴定钢铁中铬时，钒也一起被滴定，产生正系统误差，可选用其他适当的方法测定钒，然后以每1％钒相当304.％铬进行校正，从而得到铬的正确结果。此外，还可以用上面所介绍的加入回收法测定回收率，利用所得的回收率对样品的分析结果加以校正。 5.标准曲线的回归 在用比色法、荧光法、色谱法等进行分析时，常需配置一套具有一定梯度的标准系列，测定其参数（吸光度、荧光强度、峰高等），绘制参数与浓度之间的关系曲线，称为标准曲线。在正常情况下，标准曲线应该是一条穿过原点的直线。但在实际测定中，常出现偏离直线的情况，此时可用最小二乘法法求出该直线的方程，就能最合理地代表此标准曲线。 用最小二乘法计算直线回归方程的公式如下： y＝bx+a nxy−xy∑∑∑(x−x()yy−)∑22b == nx−(x)2∑∑(x−x)∑2xy−yxx∑∑∑∑22y−bxa = = nx−(x)∑∑(x−x)(yy−)nyx−xy∑∑∑∑ii r== 222222[nx−(x)[]ny(−y)](x−x)(yy−)∑∑∑∑∑∑ii式中 n ——测定点的次数； x ——各点在横坐标上的值（自变量） y ——各点在纵坐标上的值（因变量） b——直线斜率 7
a——直线在y轴上的截距 r ——线性相关系数 其中相关系数r要进行显著性检验，以检验分析结果的线性相关性。 利用这种方法不仅可以求出平均的直线方程，还可以检验结果的可靠性。实际上可以直接应用回归方程进行测定结果的计算，而不必根据标准曲线来计算。 第二节 分析测试中的质量保证 国家标准B861G365—.8中对质量保证（ tqlyuiasuraaesn,c AQ）的定义是“为使人们确信某一产品或服务质量能满足规定的质量要求所必需的有计划、有系统的全部活动”。所以分析测试中的质量保证是为了使分析测试结果更好地反映真实值，其具体目的是把分析中的误差控制在容许的限度内，保证测量结果的精密度和准确度，使分析数据在给定的置信水平内，有把握达到所要求的质量。 一般分析测试活动是在实验室中进行的，所以分析测试中的质量保证包括实验室内部质量保证和实验室外部质量保证。其中质量保证活动包括质量控制和质量评定两方面的内容。质量控制是指为使测量达到质量要求所需遵循的步骤；而质量评定是指用于检验质量控制系统处于允许限度内的工作和评价数据质量的步骤。 一、实验室内部质量保证 1.实验室内部质量控制 质量控制是质量保证中的核心部分，实验室内质量控制是保证实验室提供可靠分析结果的关键，也是保证实验室间（实验室外部）质量控制顺利进行的基础。 实验室内质量控制技术包括从试样的采集、预处理、分析测定到数据处理的全过程的控制操作和步骤。质量控制的基本环节有：人员素质；仪器设备；实验室环境；采样及样品处理；试剂及原材料；测量方法和操作规程；原始记录和数据处理；技术资料及必要的检查程序等。 （1）人员素质 分析人员的能力和经验是保证分析测试质量的首要条件。随着现代分析仪器的应用， 对人员的专业水平要求更高。实验室应按合理的比例配备高、中和初级技术人员，各自承担相应的分析测试任务。还要有一位勤勤恳恳、努力工作、联系群众、既有一定的理论基础，又有丰富工作经验的负责抓质量保证的实验室主任。实验室工作人员必须具有一定的化学知识并经过专门培训，还要不断地对各类人员继续进行业务技术培训，并为每一位工作人员建立技术业务档案，包括学历、能承担的分析任务项目、撰写的论文与技术资料、参加的学术会议、专业培训（包括短训班、夜大学、进修有关的课程、研讨会）与资格证明、工作成果、考核成绩、奖惩情况等。这些个人技术业务档案不仅是对个人业务能力的考核，也是显示本实验室水平的重要基础，是社会认可本实验室的重要依据。 （2）仪器设备 仪器设备是实验室不可缺少的重要的物质基础，是开展分析工作的必要条件。分析检测的成功与失败，常与使用的仪器设备密切相关。现在，专门的仪器设备正在迅速地替代通用设备。因此，某些种类的分析检测就只能在有这些仪器设备的实验室中进行。 实验室的仪器设备必须适应实验室的任务要求，与其业务范围相适应。应根据实验室任务的需要，选择合适的仪器设备，没有必要盲目地追求仪器设备的档次。不应购进备而不用的仪器设备。 当然，要产生质量好的数据，只有合适的仪器设备是不够的，还必须正确地使用和保养好这些仪器设备，使仪器设备产生误差的因素处于控制之下，才能得到合乎质量要求的数据。详细规定和操作可参阅有关实验室工作手册。 8
（3）实验室管理 （a）组织管理与质量管理的9项制度 ①技术资料档案管理制度，要经常注意收集本行业和有关专业的技术性书刊和技术资 料，以及有关字典、辞典、手册等必备的工具书，这些资料在专柜保存，由专人管理，负责购置、登记、编号、保管、出借、收回等工作；②技术责任制和岗位责任制；③检验试验工作质量的检验制度；④样品管理制度；⑤设备、仪器的使用、管理、维修制度；⑥试剂、药品以及低值易耗品的使用管理制度；⑦技术人员考核、晋升制度；⑧试验事故的分析和报告制度；⑨安全、保密、卫生、保健等制度。 （b）实验室环境管理 ①实验室的环境应符合装备技术条件所规定的操作环境的要求，如要防止烟雾、尘埃、 震动、噪声、电磁、辐射等可能的干扰；②保持环境的整齐清洁。除有特殊要求外，一般应保持正常的气候条件；③仪器设备的布局要便于进行操作和记录测试结果，并便于仪器设备的维修。 （c）文件和记录管理 在实验室分析过程中测试的方法、步骤、程序、注意事项、注释、修改的内容、以及测试结果和报告等都要有文字记载，装订成册，以供使用与引用。对所采用的测试方法要进行评定。 ①对原始记录的要求：原始记录是对检测全过程的现象、条件、数据和事实的记载。原始记录要做到记录齐全、反映真实、表达准确、整齐清洁。记录要用编有页码的记录本或按规定印制的原始记录单，不得用白纸或其他记录纸替代；原始记录不准用铅笔或圆珠笔书写，也不准先用铅笔书写后再用墨水笔描写；原始记录不可重新抄写，以保证记录的原始性；原始记录不能随意涂改或销毁，必须涂改的数据，涂改后应签字盖章，正确的数据写在划改数据的上方。检验人员要签名并注明日期，负责人要定期检查原始记录并签上姓名与检查日期。 ②对实验报告的要求：要写明实验依据的标准；实验结论意见要清楚；实验结果要与依据的标准及试验要求进行比较；样品有简单的说明；实验分析报告要写明测试分析实验室的全称、编号、委托单位或委托人、交样日期、样品名称、样品数量、分析项目、分析批号、实验人员、审核人员、负责人等签字和日期、报告页数。 ③收取试样的登记：试样要编号并妥善保管一定时间。试样应贴有标签，标签上记录编号、委托单位、交样日期、试验人员、试验日期、报告签发日期以及其他简要说明。 （4）技术资料 试验室的技术资料需妥善保存以备用，这些资料主要有：①测试分析方法汇编；②原始数据记录本及数据处理；③测试报告的复印件；④试验室的各种规章制度；⑤质量控制图；⑥考核样品的分析结果报告；⑦标准物质、盲样；⑧鉴定或审查报告、鉴定证书；⑨质量控制手册、质量控制审计文件；⑩分析试样需编号保存一定时间；以便查询或复检；试验室人员的技术业务档案。 2. 实验室内部质量评定 质量评定是对分析过程进行监督的方法。实验室内部质量评定是在实验室内由本室工作人员所采取的质量保证措施,它决定即时的测定结果是否有效及报告能否发出。主要目的是为了监测实验室分析数据的重复性(即精密度)和发现分析方法在某一天出现的重大误差，并找出原因。 实验室内部的质量评定可采用下列方法： （1）用重复测试样品的方法来评价测试方法的精密度。 （2）用测量标准物质或内部参考标准中组分的方法来评价测试方法的系统误差。 9
（3）利用标准物质，采用交换操作者、交换仪器设备的方法来评价测试方法的系统误 差，可以评价该系统误差是来自操作者、还是来自仪器设备。 （4）利用标准测量方法或权威测量方法与现用的测量方法测得的结果相比较，可用来评价方法的系统误差。 二、实验室外部质量保证 实验室外部质量保证是在实验室内部质量保证的基础上，检验实验室内部质量保证的效果，发现与消除系统误差，使分析结果具有准确性与可比性。外部质量保证措施是发现和消除本实验室监测工作各环节的系统误差，提高工作水平，确保监测结果的准确性、科学性和可比性的必要手段。一般这两类质量保证和质量控制是穿插进行的，特别是对于在全国范围内普遍开展的分析监测工作，仅仅依靠实验室内部的质量保证是不够的，必须建立一个良好的外部质量保证和控制体系，定期对全国各实验室分析数据实施外部质量控制和质量评定。例如，为确保某一全国性的分析检测质量，可自上而下地建立一个质量保证体系，在省级范围内每年开展1—2次外部质量控制和质量评定，使各实验室的日常分析工作保质保量地进行。 1.外部质量控制 外部质量控制措施主要包括以下内容： （1）加强信息交流，注意国际国内有关分析标准、规范、方法和理论、概念的变化，及时使用分析工作的新的国家和行业标准和规定。 （2）广泛收集国际国内权威机构公布的各种技术参数。在分析工作中应该选用法定的、通用的、可靠的参数。 （3）积极参加各种分析比对。对业已成熟的分析项目，原则上规定参加国际国内比对及参加区域性或实验室之间比对不少于每年一次。对于条件尚不成熟的项目应积极参加区域性或实验室之间的比对。比对的方式可以分为仪器比对、方法比对和同类仪器相同方法的技术比对。通过比对结果的分析，寻找原因、总结经验，提高分析质量。 （4）接受权威机构组织的检查考核。考核可以是对整个分析工作的全面检查，而不仅仅是对分析结果的比较。如国家质量技术监督局组织的定期和不定期的计量认证检查。 （5）抽取一定比例的样品送权威实验室外检。对于大样本的分析项目，这是保证总体分析质量的必要手段。 （6）对于本实验室的标准物质和器具，包括标准物质、仪器、仪表、容器等必须定期进行检定或校验，保证量值溯源的可靠性。 2.外部质量评定 实验室外部质量评定是多家实验室分析同一样本并由外部独立机构收集和反馈实验室上报结果、评价实验室能力的过程。外部质量评定的主要目的是测定一实验室的结果与其它实验室结果之间存在的差异(偏差)，建立实验室间测定的可比性。它是对实验室测定结果的回顾性评价。分析质量的外部评定是很重要的。它可以避免实验室内部的主观因素，评价分析系统的系统误差的大小；它是实验室水平的鉴定、认可的重要手段。 实验室外部质量评定主要用途包括以下几个方面：评价实验室的分析能力；监控实验室可能出现的技术问题；改正存在的问题；改进分析能力、实验方法和与其它实验室的可比性；教育和训练实验室工作人员；作为实验室质量保证的外部监督工具。 外部评定可采用实验室之间共同分析一个试样、实验室间交换试样以及分析从其他实验室得到的标准物质或质量控制样品等方法。 标准物质为比较分析系统和比较各实验室在不同条件下取得的数据提供了可比性的依据，它已被广泛认可为评价分析系统的最好的考核样品。 由主管部门或中心实验室每年一次或二次把考核样品（常是标准物质）发放到各实验 10
室，用指定的方式对考核样品进行分析测试，可依据标准物质的标准值及其误差范围来判断和验证各实验室分析测验的能力与水平。 用标准物质或质量控制样品作为考核样品，对包括人员、仪器、方法等在内的整个测量系统进行质量评定，最常用的方法是采用“盲样”分析。盲样分析有单盲和双盲两种。所谓单盲分析是指考核这件事是通知被考核的实验室或操作人员的，但考核样品真实组分含量是保密的。所谓双盲分析是指被考核的实验室或操作人员根本不知道考核这件事，当然更不知道考核样品组分的真实含量。双盲考核的要求要比单盲考核高。 如果没有合适的标准物质作为考核样品时，可由管理部门或中心实验室配制质量控制样品，发放到各实验室。由于质量控制样品的稳定性（均匀性）都没有经过严格的鉴定，又没有准确的标准值，在评价各实验室数据时，管理部门或中心实验室可以利用自己的质量控制图。其控制图中的控制限一般要大于内部控制图的控制限。因为各实验室使用了不同的仪器、试剂、器皿等，实验室之间的差异总是大于一个实验室范围内的差异。如果从各实验室能得到足够多的数据时，也可以根据置信区间来评价各实验室的分析测试质量水平，也可以从各实验室之间的控制图来进行评价。 三、质量控制图 近年来质量控制图愈来愈多地被用来控制与评估分析测试的质量。质量控制图建立在实验数据分布接近于正态分布（高斯分布）的基础上，把分析数据用图表形式表现出来，纵坐标为测量值，横坐标为测量值的次序（次数）。 过去人们采用假定是精确的分析方法来检查样品的变异性，评估分析测试的结果。目前，则是用组成均匀、稳定的与试样基体相似的标准物质来检查分析方法的变异性，评估与控制分析测试的质量。 1.质量控制图的作用 质量控制图有三个作用：①它是分析系统性能的系统图表记录，可用来证实分析系统是否处于统计控制状态之中，并可以找出质量变化的趋势；②是对分析系统中存在的问题找出原因的有效方法；③可积累大量的数据，从而得到比较可靠的置信限。 2.质量控制图的分类 质量控制图的形式有x（测量值）质量控制图、x（平均值）质量控制图和R（极差）质量控制图等。 （1）x质量控制图 这种控制图的纵坐标为测量值，横坐标为测量值的次序。中线可以是以前测量值的平均值，也可以是标准物质的标准值（即总体平均值）μ。其警戒限和控制限分别为： 警戒限（线）：警戒上限（线） x＋2s（或2σ） 警戒下限（线） x－2s（或2σ） 控制限（线）：控制上限（线） x＋3s（或3σ） 控制下限（线） x－3s（或3σ） 分析测试中测量值的平均值x与标准物质的标准值μ之间不完全相等,这是正常的。但二者之间的差异不能太大。如果标准物质的标准值落在平均值与警戒限之间一半高度以外去了，即∣x－μ∣＞1 s时,说明分析系统存在明显的系统误差，这是不能允许的，此时的控 11
制图不予成立。应该重新检查方法、试剂、器皿、操作、校准等各个方面，找出误差原因之后，采取纠正措施，使平均值尽可能地接近标准物质的给出值。 为了画好一张质量控制图，首先必须要有稳定、均匀、具有与分析试样相似基体的标准物质标样。通常标准物质价格较高，而且为了确保标准物质的稳定性，还必须保存在低温、惰性气体、避光、或湿度控制的条件下。因此，它不用于常规分析。常规质量控制时是用一定浓度的分析物来配制液态基体作为质量控制样品。 其次，必须用同一方法对同一标准物质（或质量控制样品）至少测定20个结果，而且这20个结果不能是同一次测定得到的，应是多次测定积累起来的。一般推荐的方法是，每分析一批样品插入一个标准物质，或者在分析大批量的样品时间隔10～20个样品插入一个标准物质，待标准物质的分析数据积累到20个时，求出这20个测量值的平均值x和标准偏差s。质量控制图上纵坐标为各次测量值，水平实线对应于平均值x，水平虚线对应于标准物质的标准值μ，横轴为测定标准物质的次序。1代表第1个标准物质的测量值，2代表第2个标准物质的测量值……。接着，画以x±2s为警戒限的水平虚线，和画以x±3s为控制限的水平实线，即得质量控制图。 -1例：用某标准方法分析还原糖质量浓度为 mg·L的标准物质溶液，得到下列20个分析结果：、、、、、、、、、、、、、、、、、、、(mg·L)。 上述数据求得平均值x＝ mg/L； -1标准偏差s＝ mg·L； -1标准物质标准值μ= mg·L； -1控制限x±3s＝（±）mg·L； -1警戒限x±2s＝(±) mg·L。 按前文所述方法画出的质量控制图如图15-3。 x 图1 5-3 溶液中还原糖含量的分析数据的质量控制图 控制图在使用过程中，随着标准物质（或质量控制样品）测定次数的增加，在适当的时间（通常再次累积到与先前建立控制图的测定次数差不多时）,将以前用过的和随后陆续累积的测定数据再重新合并计算,确定控制限,画出新的控制图。以此类推地进行下去。随着测 121-铜的质量浓度（c/mol·L）
定次数的增加，平均值的变化可能不大，而标准偏差s和总体标准偏差σ趋向一致，警戒限和控制限也将逐渐地靠拢。这样确定的控制限，不仅包括过去的测量值，而且还包括目前的测量值，能较真实地反映分析系统的特性与确定分析系统的置信限。 （2）x质量控制图 x平均值控制图的画法与x质量控制图的画法完全相似。在x平均值质量控制图中： 中线为x值 2警戒限为x±(A2R) 3控制限为x±A2R 式中 R——极差的数学平均值； A2——计算3σ控制限的参数值,见表15-2。 表1 5-2计算3σ控制限的参数值 样品 R图的控制参数 样品测定数 R图的控制参数x图的控x图的控制测定数 n D D D D n 制限参数限参数 3434A A 222 0 13 3 0 14 4 0 15 5 0 5 6 0 17 7 18 8 19 9 20 10 21 1 22 12 23 x质量控制图与x质量控制图比较有两个优点：①x质量控制图对非正态分布是很有用的，当平行测量次数足够多时，非正态分布的平均值基本上是遵循正态分布的；②x值是n个测量值的平均值，所以不受单个测量值的影响，即使有偏离较大的单个测量值存在，影响也不大。 x质量控制图比x质量控制图更为稳定。但x质量控制图有增加测定次数、增加成本的缺点。 （3）R质量控制图 对于常规的大量分析，由于成分、分析物或基体的不稳定性和其他原因难于获得合适的标准物质。在缺乏质量控制标准物质的情况下，R质量控制图是测试分析质量控制的主要 13
方法。 R质量控制图的绘制步骤： 周期地将样品一分为二，平行测定一系列样品中被分析物浓度。测定02个样品左右，计算极差R（这里实际上是两个测量值之差）。每个样品可进行二次以上的平行测定，但考虑到实际情况、经济效益等，一般平行测定只作两次，然后计算极差的平均值R。 在R质量控制图中： 中线为R值 2警戒上限（线）为(DR－R )43控制上限（线）为DR 4控制下限（线）为DR 3D、D参数可由表215-查出。 34例：积累02对平行测定的数据（％）如下。 测定次x x ’平均值极差测定次序x x ’平均值极差iiii序 R R iix x ii1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 01 0=50. 1=901. Rx∑∑先求出平均值 x＝＝（％） 平均极差 R＝＝≈（％） 20由表215-中查得n＝2时的A＝，D＝0，D＝。可计算出x质量控制图的： 234控制限 x±A2R＝±1090 .2警戒限 x±(A2R)＝5000.±021 .03另外，可计算R质量控制图的： 14
控制上限 DR＝ 4控制下限 DR＝0 32警戒上限为(DR－R)＝02 .0543根据上述数据可画出x质量控制图（图15-4）和R质量控制图（图515-）。 图1 5-4 x质量控制图 图1 5-5 R质量控制图 3.质量控制图的使用 在制得质量控制图之后，日常分析中把标准物质（或质量控制样品）与试样在同样条件下进行分析测定。 如果标准物质（或质量控制样品）的测定结果落在警戒限之内，说明测量系统正常，试样测定结果有效。如果标准物质（或质量控制样品）的测定结果落在控制限之内，但又超出警戒限时，试样测定结果仍应认可。这种情况是可能发生的。因为20次测定中允许有一次超出警戒限。假如超出警戒限的频率远低于或高于5%，说明警戒限的计算有问题，或者分析系统本身的精密度得到了提高或恶化。 如果标准物质（或质量控制样品）的测定结果落在控制限之外，说明该分析系统已脱离控制了，不再处于统计控制状态之中。此时的测试结果无效。应该立即查找原因，采取措施，加以纠正，再重新进行标准物质（或质量控制样品）的测定，直到测试结果落在质量控制限之内，才能重新进行未知样品的测定。如果脱离控制后，未能找到产生误差的原因，用标准物质（或质量控制样品）再测定校正一次。结果正常了，那么可认为上次测定结果超出 15
控制限是由于偶然因素或可能是某种操作错误引起的。 有关质量控制图的一个重要实际问题是分析标准物质的次数问题。根据经验表明，假如每批试样少于01个，则每一批试样应加入分析一个标准物质。假如每批试样多于01个，每分析01个试样至少应分析一个标准物质。 控制图在连续使用过程中，除了单个判断分析系统是否处于统计控制状态，还要在总体点的分布和连续点的分布上，对测量系统是否处于统计状态作出判断。 （1）数据点应均匀分布于中线的两侧，如果在中线的某一侧上出现的数据点明显多于另一侧的数据点时，则说明测量系统存在问题。 （2）如果有2／3的数据点落在警戒限之外，则测量系统存在问题。 （3）如果有7个数据点连续出现在中线一侧时，说明测量系统存在问题。根据概率论，连续出现在一侧有7个点的可能性仅为1／218。 4.质量控制图用于寻找发生脱离控制的原因 由于控制图积累了大量数据，从趋势的变化上有助于找到发生脱离统计控制的原因。 如图615-所示，在x控制图上的数据点尽管均在控制限之内，但有部分数据点较分散，常常超过警戒线，而且较集中于某段时间内。经分析，把数据点分成白天和晚上两个小组，几个循环下来，可以看出晚上测定精度不如白天的精度好。然后找出原因，是由于晚上的温度控制不及白天好。于是采取了加强晚上温度控制的校正措施之后，晚上的精度得到了提高，控制图中的数据点分布又趋于正常了。 又如图715-所示，在x控制图上发现数据点有一段突然向上偏移（见图715-的中段数据点）。这部分数据点的精密度尚好，但数值突然增大了许多。经多方寻找原因，原来是原有的质量控制样品被玷污。换了新的质量控制样品后，数据点有恢复正常了。 图1 5-6 x控制图中数据点随时间变化的情况 图1 5-7 x控制图中数据点突然偏高情况 5.质量控制图的应用范例 16
分析测试中质量控制图的应用广泛，现举例介绍如下。 （1）标准物质的质量控制图：它可对分析系统作周期性的检查，以确定测定的准确度和精密度的情况。 （2）质量控制样品的质量控制图：它可对分析系统的稳定性作定期检查，以确定分析系统的精度情况。此时可不必需要质量控制样品的组分的准确含量。 （3）平行样品的质量控制图：它可对分析系统的稳定性作检查，以确定测定的精度情况。此时也可不需要样品的组分准确含量。 （4）典型试验溶液的质量控制图：由于试验溶液制备容易，又不包括样品处理步骤在内，因此它不能检查整个系统过程的稳定性，而只能检查仪器的稳定性，可以确定分析仪器的精度情况。 （5）仪器工作特性的质量控制问题：例如对分光光度计的滤光片透过率作控制图，可检查滤光片透过率的精度情况。 （6）对操作者作的控制图：可以考核操作者操作的稳定性，尤其对新参加分析工作人员的考核检查十分有用。 （7）工作曲线斜率的控制图：可以对仪器的性能进行检验。例如，对分光光度计上吸光度与浓度工作曲线的斜率作分析是常见的控制图。 （8）校正点的控制图：例如在某个校正点上重复测定，以检验工作曲线的可靠性。 （9）空白控制图：在痕量和超痕量分析中，扣除空白是非常重要的，只有建立空白控制图才能正确扣除空白。 （10）对关键操作步骤的控制图。 （12） 对回收率作的控制图。 四、实验室认可 实验室认可是指权威机构给予某实验室具有执行规定任务能力的正式承认。继产品质量认证、质量体系认证之后，实验室的认可制度日益受到重视，并日趋完善。随着国际贸易自由化程度的提高，各国要求加快消除贸易壁垒，特别是技术壁垒，以形成全球统一的市场。因而，各国实验室认可活动的国际化趋势已提到了显著的位置。 我国主管实验室认可工作的政府机构是国务院标准化和计量行政主管部门——国家质量技术监督局（现在为国家质量监督检验检疫总局）。中国实验室国家认可委员会(CNACL)是“统一负责实验室资格认可及获准认可后日常监督的评定组织”。 1.实验室认可的目的 （1）向社会各界证明获准认可实验室（主要是提供校准、检验和测试服务的实验室）的体系和技术能力满足实验室用户的需要； （2）促进实验室提高内部管理水平、技术能力、服务质量和服务水平，增强竞争能力，使其能公正、科学和准确地为社会提供高信誉的服务； （3）减少和消除实验室用户（第二方）对实验室进行的重复评审或认可； （4）通过国与国之间的实验室认可机构签订相互承认协议（双边或多边互认）来达到对认可的实验室出具证书或报告的相互承认，以此减少重复检验，消除贸易技术壁垒，促进国际贸易。 2.实验室认可所遵循的原则 中国实验室国家认可委员会发布的《实验室认可管理办法》1LC1A0NC(－)919明确规定了实验认可工作的四个原则： （1）自愿申请原则 LCANC所从事的认可活动是一种公正的第三方的认可行为。无论是检测实验室还是校准实验室，无论是中国境内的还是境外的实验室，均可自愿向委员会提出获取中国国家认可 17
的申请，不强求某一类或某几类实验室必须获得其认可。但是，在有些情况下，一些实验室的管理部门或实验室的使用部门对实验室会提出强制其获取认可的要求。 （2）非歧视原则 对每一申请认可的实验室，委员均一视同仁，而不能因实验室的规模大小、隶属关系、等级高低、所有制性质或区域和国别的差异，而对其采取不公正行为。实验室认可的依据均为2LCA1N0C－991《实验室认可准则》和LCANC对不同专业领域实验室认可的补充要求。 （3）专家评审原则 评审活动的实施由委员会派遣的国家注册实验室评审员(有时由特邀技术专家提供配合)承担。国家注册实验室评审员是由LCANC批准的培训机构培训，考核后获取资格注册的。评审员(含特邀技术专家)必须严格按照委员会规定的程序和要求，客观、公正地对实验室进行评审，向委员会提交评审报告，并对评审结果负责。委员会负责监督评审员的行为。 （4）国家认可原则 获准认可的实验室，表明该实验室满足《实验室认可准则》及其相关要求，其技术能力获中国国家权威机构的正式承认。中国实验室国家认可工作只在国家一级进行，获取认可的实验室便会得到国家认可证书，LCANC不按地方(省、地、市等)级别或行业(委、部、局等)隶属关系来划分。因此，不论国家级的、省级的、市级的、县级的还是企业的实验室，均可申请国家认可的资格。 3.实验室认可的程序 实验室认可的程序是依据国际标准化组织SI)(O和国际实验室认可合作组织CALI()所推行的典型的实验室认可流程编制的，它分为3个主要阶段：申请阶段、评审阶段，认可阶段。 （1）申请阶段 实验室可从LCANC秘书处索取认可有关的信息和文件，当认为其基本满足LCANC的有关要求后，可正式向LCANC提交《实验室认可申请书》及其支持性文件。实验室在提交申请时至少应提供以下信息： ①实验室法定代表人签字并作相应承诺。提出希望认可的范围，申请实验室法人代表同意履行认可程序，并按要求付费。法定代表人同意遵守认可要求，并提供评审实验室所需的信息。 ②实验室相关信息：实验室的总体特征(法人名称、法律地位、人员技术资源)，实验室服务范围的说明，实验室质量手册及表示其经验、经历的支持性材料。 LCANC秘书处审查申报资料符合有关要求后，通知实验室，予以正式受理申请。 （2）评审阶段 受理申请后，CANCL秘书处便指定一位评审组长负责审阅申报资料，并与评审组长一起组建对该实验室实施评审的评审组，评审组成员在征得实验室同意后，再就评审时间、现场评审计划等现场评审事宜共同协商达成一致后安排现场评审。 评审员应在商定的时间内到达实验室。现场评审的主要目的是评价实验室的实际运作与实验室认可准则的符合性。其过程有评审组预备会议，首次会议，实施现场评审(包括必要的现场试验)，评审组分析、评议现场评审结果，向实验室负责人通报现场评审结果，末次会议(宣布评审结果)。现场评审着重对实验室的质量体系和技术能力两个方面进行评审。 通常现场评审完成后，评审组要向实验室提出一些不符合项，要求实验室进行整改(纠正措施)，整改期限原则上不超过6个月。 现场评审的结论性意见由评审员按规定程序提交给LCANC秘书处，在《评审报告》中，评审员应提出所评实验室是否应获取认可的建议。 （3）认可阶段 LCANC秘书处接到现场评审组长提交的评审资料(含实验室整改报告)后，将有关资料 18
提交认可委员会评定工作组，评定工作组作出是否认可的决定，LCANC主任/常务副主任，依据评定工作组的建议批准认可，并报请国家质量监督检验检疫总局颁发认可证书。 LCANC典型的从申请认可到批准认可的时间期限为6个月，主要分为以下6个阶段：①申请→答复受理(10天)；②答复受理→安排评审组长→组建评审组→现场评审(40天)；③现场评审→整改完毕(30天)；④整改完毕→评定(40天)；⑤评定→上报批准(30天)；⑥上报批准→发证(30天)。 思考题： 1. 什么叫误差？ 误差根据其性质可分为几类？各自的定义是什么？ 2. 什么叫不确定度，典型的不确定度源包括哪些方面？ 3. 误差和不确定度有什么样的关系？ 4. 怎样提高分析测试的准确度，减少不确定度？ 5. 可采取怎样的办法来消除系统误差？ 6. 实验室内质量控制技术包括哪几方面的内容？ 7. 怎样来进行实验室外部质量评定？ 8. 质量控制图分为哪几类？ 怎样来画质量控制图？ 9. 实验室认可有哪些作用，其程序是什么？ （钱和） 19
第十六章 实验方法评价与数据处理 第一节 实验方法评价 随着食品科学的不断发展，食品检验方法不断更新，评价检验方法的标准也逐步建立和完善起来。这些评价标准主要是准确度、精密度、检测限以及费用与效益。 一．评价指标 1、准确度 准确度是指在一定条件下，多次测定的平均值与真实值相符合的程度。准确度通常用绝对误差或相对误差表示。 在实际工作中，一般在试样中添加已知标准物质量作为真值，并以回收率表示准确度。即： X−X10 16--1 P(%)=×100%m 式中：P（%）——加入标准物质的回收率； X——加标样品测定值 1X——试样本底测定值 0m——加入标准物质的质量 式中的本底值Xo，其测定精密度所显示误差是反映随机误差；加入标准物质的质量m，其测定误差反映了系统误差。所以，回收率是两种误差综合指标，能决定方法的可靠性。 对回收率的要 求数值是个比较复杂的问题，依分析测定方法难易和不同类型的分析方法而变化。一般ppm级应在90%以上；ppb级如荧光法测定苯并芘在80%；比较繁杂的方法70%即可；但最低不能小于70%。 2、精密度 精密度是指多次重复测定某一样品时，所得测定值的离散程度。精密度通常用标准差或相对标准差来表示。 重复测定的精密度与待测物质绝对量有关，一般规定：mg 级Cv(变异系数或相对标准差)为5%；μg级Cv为10%，ng级Cv为50%左右。 3、检测限 检测限是指分析方法在适当的置信水平内，能从样品检测被测组分的最小量或最小浓度，即断定样品中被测组分的量或浓度确实高于空白中被测组分的最低量。 一般对检测限有几种规定方法： （1）气相色谱法：用最小检测量或最小检测浓度表示 最小检测量是指检测器恰能产生色谱峰高大于二倍噪音时的最小进样量。即： S=2N 16--2 式中：S---最小响应值 N---噪音信号 最小检测浓度是指最小检测量与进样量体积之比。即单位进样量相当待测物质的量。 例16--1用气相色谱法测定聚氯乙烯成型品中氯乙烯单体的检测限。仪器噪音的最大信号为峰高，注入氯乙烯标准制备的顶空气3ml，响应值为12mm，求最低检测量？ 题解：根据公式[16-2] S=2N=2×=
由 最小检测量注入标准物质量 = 可知道 最小响应值标准物质的响应值 最小响应值×注入标准物质量最小检测量=2× =标准物质的响应值 例16--2在上例中，如果注入3ml顶空气相当于聚氯乙烯成型品，求最小检测浓度？ 题解：最小检测浓度= （2）吸光光度法 在吸光光度法中，扣除空白值后，吸光值为所对应的浓度做为检测限。 例16-3利用镉离子与6-溴苯并噻唑偶氮萘酚形成红色络合物，对食品中镉含量进行比色测定。对全试剂空白进行5次平行测定，吸光度平均值是，再测定μg标准镉溶液，其吸光度为，求检测限？ 检测限镉标准质量最小响应值镉标准吸光度−空白吸光度题解： 由=可以知道： 最小响应值×镉标准质量检测限=镉标准吸光度−空白吸光度=× （3）一般实验：当空白测定次数N2>0时，给出置信水平95%，检测限为空白值正标准差（S）的倍。即：检测限=×S 16--3 例16-4在例16-3中，当空白测定N2>0时，吸光度±相当于镉±μg求检测限？ 题解：按式[16-3]检测限=×S=×=μg 若空白测定次数n<20时，检测限按下式计算 检测限=22tSf 16--4 式中；t-置信水平为95%（单侧），批内自由度为f时的临界值 ff-批内自由度 f=m(n-1)，m为重复测定次数， n为平行测定次数。 例516-用2、3一二氨基萘荧光法测定硒，双空白测定10次，其空白值为±，求检测限？ 题解：根据f=m(n-1)=10*(2-1)=10 查附表，当置信水平95%（单侧）时，t= 10按式[16-4]，=2×××= 检 测 限 =22tSf（4）国际理论应用化学联合会对检测限的规定 对于各种光学分析方法，可测量的最小分析响应值以下式表示 X=X−K×SLbb 16--5 式中：X-最小响应值； LX−b多次测量空白值的平均值（n≥20）； S--多次测量空白值的标准差； b
K--根据一定置信水平确定的系数（一般当置信水平为90%，空白测量次数n＜20时，K=3；置信水平为95%，n＞20时，K=）。 X−XK×SLbb检测限==mm 规定： 16--6 式中，m为方法灵敏度，即单位浓度或单位量被则物质所产生的响应值的变化程度，在实际工作中，以标准曲线斜率度量灵敏度，基余各项符号同式[16-5]。 例16-6在例16-5测定硒时，增加空白测定数，其空白值为：±，其灵敏度为荧光单位/ng，求检测限？ 题解：按16-6式 X−XK×SLbb =3× 检测限==mm 从检测限定义可以知道，增加实际测定次数，提高测定精密度，降低仪器噪音，可以改善检测限。 4、费用与效益 费用与效益是目前国内外重视的问题。实验室工作人员，应结合实际测试目标，选择或设计相应准确度和精密度的实验方法。用一般常规实验能够完成的测定，不必使用贵重精密仪器。检验员经训练能较好掌握某种测定方法的时间，也是评价实验方法的重要内容。“简单易学”在一定程度上意味着能保证检验质量。从实际工作需要出发，快速，微量，费用低廉，技术要求不高，操作安全的测定方法应列为一般实验室的首选方法。 二．实验结果的检验 在食品分析中，常遇到两个平均值的比较问题，如测定平均值和已知值的比较，不同分析人员，不同实验室，或用不同分析方法测定的平均值的比较，对比性试验研究等均属于此类问题。所以对这类问题常采用显著性检验法-------利用统计方法来检验被处理问题是否存在统计上的显著性，常用有t检验法和F检验法。 1、t检验法 用以比较一个平均值与标准值之间或两个平均值之间是否有在显著性差异。 进行t检验的程序如下： （1）选定所用的检验统计量： 当检验样本均值X与总体均值μ是否有显著性差异时，使用统计量 X−μt=S/n 16—7 式中：S—标准差 当检验两个均值之间是否有显著性差异时，使用统计量 X−Xn×n1212t=×Sn+n12 16—8 S其中--合并标准差 按下式计算： 22(n−1)S+(n−1)S1122S=n+n−212 16—9
2S式中1---第一个样本的方差 2S2---第二个样本的方差 n---第一个样本的测定次数 1n---第二个样本的测定次数 2（2）计算统计量， 如果由样本值计算的统计量值大于t分布表中相应显著性水平α和相应自由度f下的临界值t，，则表明 被检验的均值有显著性差异,反之，差异不显著。 α f应用t检验时，要求被检验的两组数据具有相同或相近的方差（标准差）。因此在t检验之前必须进行F检验，只有在两方差一致性前提下才能进行t检验。 （3）假设检验的一尾测验与两尾测验 在进行测验结果分析确定检验水平时，还应根据其处理的性质和试验结果的准确性，考虑显著性测验用一尾测验还是用两尾测验。 在提出一个统计假设时，必然有一个与其相对应的备择假设。备择假设为否定假设时，必然接受的另一个假设。例如，单个平均数进行显著性测验时，通常H：μ=μ，H：μ≠μ。00A0如果H被否定接受H时，其μ≠μ，便有μ大于μ或小于μ的两种可能性，即所测定的0A000误差概率在正态分布曲线的左尾和右尾各有一个否定域，而附表_1__中临界t值表规定的α值是两尾概率之和。如果确定的检验水平α=，则两尾否定域的概率各为，这类测验称这为两尾测验。 但有的试验则不然，例如某酿酒厂曲种酿造醋的醋酸含量大于12%，则其假设H：μ0＞12%，H：μ≤12%。如果选择的曲种酿造醋酸含量大于12%，H被否定，μ只能大于12%。A0若小于12%便不符合规定的企业标准，没有推广价值，因此只有在正态曲线的右尾一个否定域，这类检验称为一尾测验。两尾测验查两尾概表或一尾测验查一尾概率表时，可以直接从表上查得。如果两尾检验查一尾概表时，需将检验水平值除2，再查出µ值，如两尾测α验检验水平α=，一尾概率µ=，应将检验水平α=除以2得α=，µ=，如果一尾检验查两尾概率表时需将检验水平值乘以2，再查出µ值，如一尾检验水平α=，αµ=，因此用一尾测验还是用两尾测验，应认真从实际考虑。 而t检验法为判别性测验，多为两尾测验。 下面将t检验法在食品分析中的主要应用介绍如下： ①用已知组成的标样评价分析方法 为了鉴定一个分析方法的可靠性，可用一已知量的基准物或已知含量的标准试样进行对照试验，通过若干次测定，取得其平均值，然后将这个平均值与已知值（真值）进行比较，从而制断这个分析方法是否存在系统误差。因为这时将平均值与真值进行比较，所以可以按t检验法来判别。逻辑推理是先假设平均值与真值之间不存在真正的差异，如果所算出的t值大于通常规定的置信水平的t值，那么，应该拒绝所提的假设，就是说，这样的差异不能认为是偶然的误差，而是被检验的方法存在系统误差，反之，则应接该受假设，判断该方法不存在系统误差。 例16-7为了鉴定一个分析方法的准确度，取重量为100mg的基准物进行10次测定，所得数据为，，，，，，，，，,试对这组数据进行评价。 题解：计算平均值和标准偏差。X=，S=，按式167—，计算统计量
−100X−μt=t〉,10S/ 查t表得t=, = ,10表明10次测定的平均值与标准值有显著性差异，可认为该方法存在系统误差。 ②两个平均值的比较 在进行分析方法研究的时候，往往要在两种分析方法之间，两个不同实验室之间或两个不同操作者之间进行比较试验。这时对同一试样各测定若干次，得到两组测定数据的平均值，以比较两个平均值来判断它们之间是否存在真正的差异。如果两组测定数据的精密度高，两个平均值相差又比较大，这种情况自然容易判断。有时，两组数据本身不很精密，而两个平均值相差又不太大，这就是利用统计分析法才能进行正确判断。 两组测定的平均值都不是真值，在进行检验时，将两组数据看作同属一个总体来处理，按式16-8，16-9计算统计量t，与查表所得的t值（f=n+n-2）进行比较，便能作出判断。 12例16-8采用两种不同方法测定奶粉中脂肪含量，测定数据见表16-1。试比较两种方法的精密度有无显著差异。 表116-奶粉脂肪测定数据% 方法1 方法2 22脂肪含量 脂肪含量 X−XX−XX−XX−X1i12i21i12i2 ∑ 题解：根据两组数据，分别计算两种方法得平均值X及标准差S。 2(X−X)X∑1i1∑1iS====−1n 2(X−X)X∑2i2∑2iS====−1n 计算合并标准差 2222(n−1)S+(n−1)S5×+4×===+n−26+5−212 计算统计量
X−−×61212t===++612 查t表得 t =, t＜t , 两法差别不显著，即两种测定结果是一致的。 ,,9③配对比较试验数据 在分析方法试验中，为了判断某一个因素的结果否有显著影响，往往取若干批的试样，将其他因素固定下来，对某一因素进行配对的比较试验。这样的试验可以消除其它因素的影响而把被检验的因素突出来，以便 从随机误差的覆盖下找出被检验的因素是否存在真正的差异。例如为了比较两个实验室的分析结果，取若干批试样交由两个实验室进行比较测定；为了比较两种分析方法的差异性，可以用两种不同方法对同一试样进行测定比较也可以把一个试样交给几个人进行方法的比较试验等等。 配对比较试验数据的判断，不是根据两组数据的平均值来进比较，而是根据各组配对数据之差D来进行显著性的检验。 首先计算配对数据之差D的平均值D，标准差SD 161—0 D∑iD= n2(D)2∑i2D−(D−D)∑i∑inS==Dn−1n−1 16—11 然后计算统计量t D×nt=DSD 16--12 如果计算的统计量值小于t分布表中相不在显著性水平α和相应自由度f的临界值t， α,f则表明被检验的两种方法测定结果是一致的。 例916-某实验室使用直接离子计测定饮料中的氟含量 。为了检验新方法的可靠性，用新法和老法（氟试剂比色法）同时对10份不同饮料进行了对比性测定，结果见表16-2，两法的测定结果是否一致？ 表216-两种方法测定氟含量数据 2 氟含量（mg/L） 相差值DDi i饮料样品 氟试剂比色法 直接离子计法 1 3 5 7 9
∑ 题解：按式161—0，161—1计算差数的平均值D与标准差SD D∑iD=n= mg/L 2(D)2∑i2D−(D−D)∑i∑inS==Dn−1n−1= D××10t=按式161—2计算t 值 == 查t分布表，当f=9时， t=, t＜t=，说明测定结果的差别无显著性，,,9即两种方法的测定结果是一致的。 2、F检验法 F检验法是通过计算两组数据的方差之比来检验两组数据是否存在显著性差异。比如使用不同的分析对同一试样进行测定得到的标准差不同，或几个实验室 用同一种分析方法测定同一试样，得到的标准差不同，这时就有必要研究产生这种差异的原因，通过这种F检验法，可以得到满意的解决。 F检验法其步骤如下： (1)计算统计量方差比 2S1F=2S2 16—13 22S,S式中12-----分别代表两组测定值的方差 （2）查F分布表 （3）判断：当计算所得F值大于F 分布表中相应显著性水平α和自由度f,f下的临界12值fα(f,f)，即F＞fα(f,f)时，则两组方差之间有显著性差异，反之，则两组方差无显著性1212差异。 在编制F分布表时，是将大方差作分子，小方差作分母，所以，在由样本值计算统计22S,S量F值时，也要将样本方差12中数值较大的一个作分子，较小的一个作分母。 例106-1仍以例16-8中实验数据为例，通过F检验法比较两种方法的精密度有无显著差异。 题解：分别计算两种方法的方差 22S== 122S== 2按式16-13计算统计量方差比F：
2S1F=2S2= 查F 分布表，F（5，4）=, F＜F(5，4)= 说明差别不明显，即两种测定方法精密度是一致的。 例116-1用原子吸收法与比色法同时测定某试样中的铜，各进行了10次测定，原子吸-4-4收法测定方差为×10，比色法测定的方差为×10，试由测定精密度考虑，以选取那一测定方法合适。 题解：（1）给定量著性水平α=，根据本例题意，只要检验两个方差是否有显著性差异，不管两个方差中哪一个比另一个大得多或小得多，都认为是有显著性差异，因此是双侧检验。F分布表中给示的单侧检验F临界值，对于双尾检验，在给定显著性水平α时，要从F分布表中查F值，针对本例情况，查F分布表，F= α/(9,9)(2)计算统计量得 2S-4-41=×10/×10= F=2S2 F＜F=说明不能认为两法方差有显著性差异，即选用原子吸收或比色法都是可以(9,9)的。 第二节 实验数据处理 一、分析结果的表示 食品分析项目众多，某些项目测验结果还可以用多种化学型式来表示，如硫含量，可用2-2-S，SO，SO，SO化学形式表示，它们的数值各不相同。测定结果的单位也有多种形式，234如mg/L,g/L,mg/kg,g/kg,mg/100g,百分含量（%），等等，取不同单位时显然结果的数值不同。统计处理结果的表示方法也多种多样，如算术平均值X，极差，标准偏差等表示测定数据的离散程度（精密度）。 原则上讲，食品分析要求提出的测定结果既反映数据的集中趋热，又反映测定精密度及测定次数，另外还要照顾食品分析自身的习惯表示法。 通常，食品的分析中报出的测定结果的单位采用mg%或百分含量%，而对食品中微量无素 的测定结果采用mg/kg即ppm或μg/mg(ppb)，统计处理的结果采用测定值的算术平均数X与相差R=Xmax-Xmin同时表示。当测定数据的重现性较好时，测定次数n通常为2次，当测定数据的重视性较差时，分析次数应相应地增加。 二、实验数据的处理 通过测定工作获得一系列有关分析数据后，需按以下原则记录，运算与处理。 （一）记录与运算规则 食品分析中数据记录与计算均按有效数字计算法进行，即： （1）除有特殊规定外，一般可疑数为最后一位，有±1个单位的误差。 （2）复杂运算时，其中间过程可多保留一位，最后结果须取应有的位数。 （3）加减法计算结果，其小数点以后保留的位数，应与参加运算各数中小数点以后位数最少者相同。 (4 ) 乘除法计算结果，其有效数字保留的位数，应与参加运算各数中有效数字位数最少者相同。
（二）可疑数据的检验与取舍 1．实验中的可疑值 在实际分析测试中，由于随机误差的存在，使得多次重复测定的数据不可能完全一致，而存在一定的离散性，并且常常发现一组测定使其中某一、两个测定值比其余测定值明显的偏大或偏小，这样的测定值称为可疑值。 可疑值可能是测定值随机流动的极度表现。它虽然明显偏离其余测定值，但仍然是处于统计上所允许的合理误差之内，与其余测定使属于同一总体称之为极值，极值是一个好值，必须保留，然而也有可能存在这样的情况，就是可疑值与其余测定值并不属于同一总体，称其为界外值、异常值、坏值，应淘汰不要。 对于可疑值，必须首先从技术上设法弄清楚其出现的原因。如果查明是由实验技术上的失误引起的，不管这样的测定值是否为异常值都应舍弃，而不必进行统计检验。但是，有时由于各种缘故未必能从技术上找出它出现过失的原因，在这种情况下，既不能轻意地保留它，也不能随意地舍弃它，应对它进行统计检验，以便从统计上判明可疑值是否为异常值。如果一旦确定为异常值，就应从这组测定中将其除掉。 2．舍弃异常值的依据 对于可疑值究竟是极值还是异常值的检验，实质上就是区分随机误差和过失误差的问题。因为随机误差遵从正态分布的统计规律，在一组测定值中出现大偏差的概率很小的。单次测定值出现μ±2σ（σ为标准差，也用S表示）之间的概率为%（这一概率也称为置信概率或置信度μ±2σ将为置信区间），也就是说偏差﹥2σ的出现概率为5%（这概率也称之为显著概率或显著性水平）；而偏差﹥3σ的概率更小，只有%。通常分析检验只进行少数几次测定，按常规来说，出现大偏差测定值的可能性理应是非常小的，而现在竟然出现了，那么就有理由将偏差很大的测定值作为与其余的测定值来源于不同的总体异常值舍弃它。并将2σ和3σ称为允许合理误差范围，也称为临界值。 3．可疑值的检验准则 ①已知标准差 如果人们在长期实践中已知道了标准差σ的数值，可直接用2σ（置信度%）或3σ（置信度）作为取舍依据 ②未知标准差 一般情况下，总体标准差σ事先并不知道，而要由测定值本身来计算它，并依次来检验该组测定值中是否混有异常值，判别方法有许多，如狄克逊（Dixon）检验法，格鲁布斯（Grubbs）检验法、科克伦（Cochran）最大方差检验法等。下面介绍前两种方法： （1）狄克逊（Dixon）检验法 此法也叫Q统计量法，是指用狄克逊法检验测定值（或平均值）的可疑值和界外值的统计量，并以此来决定最大或最小的测定值（或平均值）的取舍。其中提到关于平均值的取舍问题，是由于有时要进行几组数据的重复测定，取几次测定值的平均值，也有一个可疑值取舍问题，也要进行检验。 现将Q统计量法和检验步骤和方法说明如下： ①首先将一组测定值按大次序排列：即：X≤X≤X------≤X≤X不言而喻,异常值(界123n-1n外值)必然出现在两端。 ②用表16-3,所列公式,计算Q统计量。计算时，Q统计量的有效数字应保留至小数点后3位。 ③从表16－4查出检验显著概率为5％和1％的Q统计量的临界值Q和Q,其,(H),(H)中H为受检验的一组按小到大排列的测定值的最大的一个序数(也就是测定次数),从受检验的测定值的两个Q统计量计算值中,只选取较大的Q统计量的计算值与Q统计量的临界值比较。
④判定：若计算统计量Q≤Q，则受检验的测定值正常接受。 (H)若Q≤H≤Q，，则受检验的测定值为可疑值。用1个星号"＊"记在右上角。查(H)有技术原因的可疑值舍去，否则保留。 若Q﹥Q则受检验的测定值判为界外值（异常值），用2个星号"＊"记在右上角。该值(H)舍去。 ⑤当Z（1）或Z（H）舍去时，还需对Z（2）或（H－1）再检验，注意此时统计量的临界值应为Q和Q依次类准。但在舍去第二个测定值时要慎重考虑有否其他原(H-1)(H-1)因。 表16－3统计计算方式 H 计算公式 公式用途 Z(2)−Z(1)Q= 检验最小值Z（1） 10Z(H)−Z(1) 16--14 3--7 Z(H)−Z(H−1)Q=检验最大值Z（H） 10Z(H)−Z(1) 16--15 Z(2)−Z(1)Q= 检验最小值Z（1） 11Z(H−1)−Z(1) 16--16 8--12 检验最大值Z（H） Z(H)−Z(H−1)Q= 11Z(H)−Z(2) 16--16 13个以上 检验最小值Z（1） Z(3)−Z(1)Q= 22Z(H−2)−Z(1) 16--17 检验最大值Z（H） Z(H)−Z(H−2)Q=22Z(H)−Z(3) 16--18 用狄克逊检验准则检验的优点是方法简便，概率意义明确，现以气相色谱分析的一个实例来说明具体检验方法。 表16－4狄克逊法界外值检验的临界值 临界值 临界值 H5% 1% H5% 1% 3 22 4 23 5 24 6 25 7 26
8 27 9 28 10 29 11 30 12 31 13 32 14 33 15 34 16 35 17 36 18 37 19 38 20 39 21 40 例16－21用外标法定量，标准试样共进样10次，依次得到峰高（mm）如下： 142，，，，，，，，，在取平均峰高之前，检验一下哪些测定值要舍弃？ 题解：①首先按由小到大排列：；；142；；；；；；；受检验的是两个端值。 ②根据表16－3公式，计算 Z(2)−Z(1)Q=11Z(H−1)−Z(1)=140-135/-135= Z(H)−Z(H−1)Q=11Z(H)−Z(2)=162-14707/162-140= ③从表16－4查出检验显著概率为5％和1％统计量的临界值为：Q= (10)Q= (10)④判定：∵Q＜Q= ∴值正常接受。 (10)而Q＞Q= 因此值为界外值，舍弃不要。 (10)如果计算的统计量Q介于～之间，则为可疑值，但本组数据不在可疑值。 ※※⑤舍去测定值后，还需检验这一新的端值，就像重新提供1组测定值样，还需要重新算起，只是此时H=9即： Z(2)−Z(1)Q=11Z(H−1)−Z(1)= Z(H)−Z(H−1)Q=11Z(H)−Z(2)= 而查得Q= Q= (9)(9)
∵﹤Q（）＝ ﹤Q（）＝ 故检验结果及均为正常保留值，应按9个计算平均值。 从上例不难看出，狄克逊检验准则拒绝接受的只是偏差很大的测定值，它把非异常值误判为异常值的概率是很小的，而把异常值误判为非异常值的可能性则大些。因而用钬克逊检验的数据，精密度不可能有偏高的假象，是一个比较好的检验方法。同时也使我们认识到，实验数据不能随意取舍。比如有人做了三次重复测定，往往有两个测定值比较接近，另一个数据有较大偏差。有的人则喜欢从三个测定值中挑选两个"好"的数据进行计算，另一个数据则丢弃不管。实际上，根据统计原理从三个数据中挑选两个是不合理的,不科学的，要纠正这种盲目行为。 （2）格布鲁期（Grubbs）检验法 本法用于一组测量值或多组测量值的平均值的一致性检验和排除异常值，应用格布鲁斯检验时，按下述三种不同情况进行处理。 a、在只有一个可疑值的情况下： ①将几个测定值有小到大排成X，X，X……X，设X被检验的可疑值（包括最大或123nd最小值）； ②计算统计量G X−XdG=S 16—20 X∑X−n式中， S为标准差；X为被检验的最大或最小可疑值。 d③查格布鲁斯检验临界值表16－5，查出相应显著性水平α和测定次数n时的临界值Gα,n ④判断： 当G≤G则可疑值为极端值应保留 当G＞G则可疑值为异常值应舍弃 若G﹤G﹤G，则该值属技术原因产生的可以舍去，否则保留。 例16－31有10个实验室，对同一试样进行测定，每个室5次测定的平均值分别是，，，，，，，，，。检验最大均值是否为异常值？ X∑i题解：均值的平均值X== n2(X−X)∑i均值的标准差S== xn−1X−Xd∴G== S查表16—5；当n=10和显著性水平α=时，G，=，G＜G，=；表明最大均值为正常值。 b、如果可疑值有两个或两个以上，而且可疑值在同一侧，在检验时可以人为地暂时舍去两个可疑值的偏差更大的一个，用n－1个侧定值计算平均值和标准差S，检验偏差较小
的一个可疑值，若为异常值则先前舍去的必然为异常值，若检验值为不异常值，这时再由全部n个测定值计算平均值和标准差，去检验舍去的那个可疑值，根据检验结果确定是否为异常值，再决定取舍。 c、如果可疑值为两个或两个以上，并且分布在平均值两侧，检验方法同b。 表16－5格布鲁斯检验临界值G表 显著性水平 显著性水平 n n 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 例16－41某实验室对同一试样进行10次测定的结果为：，，，， ，，，，，。试问可疑值与是否为异常值。 题解：这是两个可疑值分布在平均值两侧的情况，测定平均值为，两个值偏差分别是和+，因此是暂时舍去可疑值+，用某余9个测定值去计算平均值值X和标准差S，检验可疑值。 X−Xd这时：X=， S=。G== S查表165—；当n=9和显著性水平α=时，G，=，G=G，=；表明可疑值不能作为异常值舍弃，应该保留。 X−Xd再用10个测定值计算：X=， S=。G== S查表16—5；当n=10和显著性水平α=时，G，=，G＜G，=；表明可疑值也不能作为异常值舍弃。 三．测定结果的校正 在食品分析中常常因为系统误差，使测定结果高于或低于检测对象的实际含量，即回收率不是100％，所以需要在样品测定时，用加入回收法测定回收率，再利用回收率按下式以样品的测定结果的校正。 X％＝X％÷P％ 16－21 0式中：X％－样品中被测成分的百分含量；
X％－样品中被测成分测得的百分含量； 0P％－回收率。 思考题： 1. 当有一组测量值，其总体标准偏差σ为未知，要判别得到这组数据的分析方法是否可靠，应该性质下列方法中的哪一种？ （1）4d法 （2）格布鲁斯法 （3）F检验法 （4）t检验法 2. 回收率在一定程度上决定了方法的可靠性，一般可靠的回收率范围是多少？ 3. 当测定次数很多时，下列关于标准偏差σ与平均偏差δ之间关系是什么？ 2-4. 两组分析人员对同一含SO的试样用重量法进行分析，得到两组分析数据，要判断两4人分析的精密度有无显著性差异，应该用下列哪一种方法？ （1）Q检验法 （2）F检验法 （3）u检验法 （4）t检验法 5 在上题中，若要判断两分析人员的分析结果之间是否存在系统误差，则应该选用下列哪种方法？ （1）u检验法 （2）F检验法 （3）F检验法加t检验法 （4）t检验法 （章银良）
